专利名称:苎麻微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种苎麻的DNA分子遗传标记。
背景技术：
微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1～6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA，广泛分布于真核基因组中。微卫星序列两侧有保守的DNA序列，根据其两侧的保守序列设计引物，可用PCR扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复的次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性(即SSRLP或SSR)。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传关系分析，品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲源关系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15137-142)、用微卫星DNA标记进行猪品种分类的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”(公开号CN 1370834A)。
苎麻(又称为“中国草”，种名为Boehmeria nivea(L.)Gaud)属于荨麻科苎麻属，是我国重要的纤维经济作物。苎麻的品种分类、遗传关系分析等一般是根据形态、生理指标进行，准确度低、且受生长季节、发育时期等的限制。苎麻的分子标记的研究起步较晚，有研究者尝试用RAPD(随机扩增多态性DNA)标记进行了苎麻品种亲源关系分析，取得了成功(郭安平.RAPD.湖南农业大学博士学位论文，1999.)。但是，RAPD标记在绝大多数情况下是显性标记，不能区别纯合基因型与杂合基因型。如何解决苎麻品种分类、遗传关系分析中存在的准确度低及受生长季节、发育时期限制的问题，是开展苎麻研究迫切需要解决的技术。
发明内容
本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立苎麻的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行品种分类、遗传关系分析和辅助育种。
实现上述发明目的的技术方案包括苎麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选及测序，得到15个含有(CT/AG)n微卫星克隆，确定了15个多态性丰富的微卫星标记BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33；BN19为674个核甘酸、BN20为571个核甘酸、BN21为653个核甘酸、BN22，BN23，BN24均为760个核甘酸、BN25为529个核甘酸、BN26为472个核甘酸、BN27为338个核甘酸、BN28为366个核甘酸、BN29为542个核甘酸、BN30为670个核甘酸、BN31为1068个核甘酸、BN32为649个核甘酸、BN33为326个核甘酸。
图1是用BN19位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图2是用BN20位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图3是用BN21位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图4是用BN22位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图5是用BN23位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图6是用BN24位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图7是用BN25位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图8是用BN26位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图9是用BN27位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图10是用BN28位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图11是用BN29位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图12是用BN30位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图13是用BN31位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图14是用BN32位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图图15是用BN33位点的特异性引物扩增25个苎麻品种DNA的PAGE电泳图具体实施方式
1苎麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建(1)按郭安平等方法(参见郭安平等，1997，中国麻作，194-10)提取苎麻基因组DNA。用限制性内切酶Mse I酶切苎麻基因组DNA，酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)纯化回收的酶切产物。
(2)将碱基互补的寡核苷酸PHC-1(5’-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3’)和磷酸化的寡核苷酸PHC-2(5’-phos-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3’)等摩尔混合，95℃变性5分钟，60℃退火1小时，形成具有MseI粘性末端的接头。
(3)将酶切产物和接头用T4DNA连接酶连接。连接产物用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心收集上清液。在上清液中加0.3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干DNA后溶于50μl无菌水中。
(4)用生物素标记的寡核苷酸探针(CT)15与连接产物DNA片段杂交。具体操作为在总体积100μl杂交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng连接产物和100pmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95℃下变性10min，60℃杂交1小时。
(5)加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，购自Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。
(6)用磁铁吸附磁珠，弃上清。磁珠用400μl洗涤缓冲液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗涤15分钟，然后在室温下用分别用2×SSC和1×SSC溶液洗涤两次，并弃上清。
(7)最后加入50μl无菌水，在90℃下保温10分钟，小心吸取上清，上清液即为含有(GA)n重复序列的单链DNA片段。以PHC-1为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。
(8)将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体(购自大连宝生物公司)上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。
2.含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计(1)挑取白色菌落并接种到3ml LB培养液中，于37℃培养过夜，然后提取质粒。
(2)质粒DNA为模板，采取PIMA方法(参见Lunt等，1999，Molecular Ecology，8891-894)筛选含有(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。
(3)将阳性克隆测序，分析是否含有(CT/AG)n重复序列。通过测序，共得到了16个含(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。
(4)根据微卫星重复序列两侧的保守序列设计引物。
3.利用苎麻微卫星DNA标记分析苎麻品种间的遗传差异将上述微卫星标记用于25个苎麻品种的分类，确定了15个多态性丰富、适于苎麻品种分类的微卫星标记BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33(表1)。具体操作过程如下(1)按郭安平等方法(参见郭安平等，1997，中国麻作，194-10)提取各个苎麻品种的DNA作为模板，进行PCR。
(2)分别用BN19、BN20、BN21、BN22，BN23，BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33。15个位点的15对引物(引物序列见表1)扩增这25个品种苎麻的DNA。
(3)将PCR产物在6％变性聚丙烯凝胶上电泳，然后进行银染并拍照，得到图1-18。
(4)结果分析每个样品的扩增条带按有或无记录，扩增条带存在时赋值为1，否则赋值为0。采用SPSS10.0 for windows统计分析软件中的系统聚类分析程序，距离测量选用相关系数距离法，用类间平均连锁法(Between-groups linkage)进行聚类分析并建立系统树。
具体分析方法参见《系统与进化植物学中的分子标记》(邹喻苹、葛颂、王晓东编，科学出版社，2001年)中的方法进行。
由附图1-15可看出，本发明的15个微卫星点的序列长度在供试的25个品种中都出现多态性，由此可见，本发明的这15个微卫星标记能用于苎麻的品种分类和遗传关系分析。
表1引物特性表引物序列，退火温度，片段大小
表1中F表示5’端引物，R表示3’端引物。
本发明提供了15个苎麻微卫星位点的DNA序列及扩增上述15个苎麻微卫星位点的引物序列和扩增方法，15个苎麻微卫星位点用于苎麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
序列表<110>中国农业科学院麻类研究所<120>苎麻微卫星DNA标记<160>13<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>674<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(193)..(272)<220>
<221>重复单元<222>(441)..(456)<400>1taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540
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<221>重复单元<222>(340)..(411)<400>2taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt tagagtcgct tcggagccaa aaaactattt 120tgaaggctat atttcgacaa aactagttat aacgatttac tttttgcgcg aaataaattt 180ttaagcttgg agtagtcaag agtggttgaa gctctaacca ctagagattt tgagaagcgc 240acagtatgag cgaaaatggg cttgtgggtt ttggtgtaga tggcaaagga aggtgaagaa 300caagcgtaga atgtcgaagc agagaacgcc atcgaagggg agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agagagagag aattctagaa aatctcttac ttgcttttta 420cttgtaatct ccagattagc aaagtcgaca cgtggcgcaa cggacatccc gagttgggat 480acccagtcac gtgcctcacg tgaagttggg acaaaatttt gtcccaacat ttacatttag 540cataagatag tgttactgtg atatcccgat t 571<210>3<211>653<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(32)..(36)<220>
<221>重复单元<222>(309)..(328)<220>
<221>重复单元<222>(328)..(363)<400>3caagtgaata tcaagcatat agcttcttct ttctctctct cgtttccctt tttcccttct 60tttcaggaca tttcagatac tttctggttt tatccaatgt tgcacaaaag aaaatatgat 120tcactaacat gtcaatacgg gaaagagaac tcaatcaaat caaatcaaat caaacgatat 180cacagacaac aatcacgtat catgaattac tggtcacaca tattcttgtg atagtcaaga 240ctagatcaag aaatcatgca ttttcctttt atacatagca gagaaaacct tagacttgta 300tatatgtctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agaattttgc acgtaactgg caataattgg ccgtgtattc 420caaaaaactt ggaaaatgaa ggcatagcca aaagcatctt caatcttcat ctccggggtc 480gattggtaat ttacacaatc ttcttcttat gatatgttat tgtttgatca aagaaatttt 540atgttgaacg atttttcatt gctgtttata acttcaggga aattacagaa atggacgctt 600catgtcctga ttatgattat catctttacc ctttgaccag cttgcagatt ggg 653<210>4<211>760<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(601)..(658)<400>4
taataataaa caataataat aataataata atcacctagc actggggact cttctgggta 60gctggggctc gagctcagtg ggcaagccca ggaagccatt gaagcggtcg aaggtcacgt 120gcgacacgtg cctgacctct gtgggccagc tgatctccaa cgccgacgac gaccccgacg 180ccgacgccga cgacgacgtc gacgacacgt cgtctctctc gacgctgcat gtgactatgg 240acttcctcag agccgtcacc agcacatcca cgatcgcgaa ctgatgagag ccattgccgt 300cgtctctgcc attatcgccg ccgtggtaaa gccgagcctt gctgctaaac ggcgtcgtca 360cggggttgta caacgcctcg tcttcgccgt cttcgtacaa ttcgttctcc gactcttctt 420cttcttcttc ttcttcttcg tcggattctt gttcgtctat gaagataggg ctgggtgggg 480ccgtgttgaa ctcggcgagc ccgcaagatt ttgaccggaa aagccgagtc atggcgagag 540gtcaagatca gagaaaccaa aacagagtag tgtttgtgtg tttgatttgt tttgagagtt 600gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaag 660agccggcctt ggaagaaaca agaaggagaa gagaaaagct tgatttttcc aagctaaaac 720gtaaggtaac ttagccagct tttcttatag tttgagtttt 760<210>5<211>529<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(306)..(347)<400>5taacaactca ccactgtgat ggaccaattg actcatcgtc aacagaatga ttgatcggct 60cactttacaa cgatcggtcg gctccttgca atgaccgatt ggtccagttg gctcgtcacc 120gacatgatga cgagttggtt ctccttctca acgttagatt ggctcgcttt ctggccacca 180acataatgat taaataaatt ttattctctc tcaactcata ccaataatta cttcacaaat 240
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<221>重复单元<222>(305)..(318)<220>
<221>重复单元<222>(335)..(348)<400>6taacccaact caagctgaag aaacttattc aatggtcacc gctaaccgct tttggtccca 60aatctttggg gttgcttttt ccaataaacg ttggttacat ttctttatgt tatttgtacc 120agtcactggt ttatggatga gtgctcttgg agtagtcggt ctggctttga atctacgtgc 180ctatgacttc gtttctcaag aaatccgtgc agcggaagat cctgaatttg agactttcta 240cacaaaaaat atcctcttaa tttgttgttt gtgtgtcagt gtttgtggtg atttcagggg 300agacagagag agagagagat tgtgagaaag agaaagagag agagagagat gaaagtgaag 360gctgaattat tggaaagata gatacagaga catgtcgttt gtgggttctg agttggaatt 420ggttgagata taatcatgcc ggccaatggc aatcacggaa agtttagttt tt 472<210>7<211>338<212>DNA
<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(220)..(235)<400>7taagatgtac caaagaaatt ggggggccag agaagcacaa gagagaggct aatctggaca 60taagaacccc caacactttg gaagtggaat caatatatgc ctctagaaca aagccatcaa 120gaaatcgatc atcagatctc aaacccttga agccgaaagg agaggcattt atactcaacc 180cacgcacaca gagccaaaat gaaaattgct ttacaccaaa gagagagaga gagagggagt 240aatgattcga ggcttagtga agagtagagt tgtgaaggat atttataggg tggcctaaaa 300ccctaggttg tgaacgatgc tgagaagata tcagctgc 338<210>8<211>366<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(264)..(273)<220>
<221>重复单元<222>(291)..(300)<400>8acaaaacctc cccaatcaat ttcaagtttg gaggccgacg atggtgaggt ggatggctgc 60ggcggctgtg cgattttcgg catagtccga cagtttccga tgacaaacca ctgctcaaaa 120tattcctctc gtcgagagct ttccaacggt accaagtatg catcaatcgg acttaggatg 180agaaagttat gagtgttcga attttgaaga atttttgaaa aaaataattg aggagagaaa 240gagaattcga atttagagaa gaaagagaga gagggtgaca gaaatagggg gaagaagaag 300
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<221>重复单元<222>(194)..(229)<220>
<221>重复单元<222>(230)..(241)<400>9taatcatcaa tccatgtcgt tttcagcctt gccgcttctt cagtaggtct cacttgttct 60ctaattgtcg ttttcacgtc tccttcgaca acaaaaacga cacgtcgttt acatcccccg 120ctctcgcagc ctcaaaaacc cccaaaaacc ccaacaaatc tccttcggcg tttagcttct 180cagattgaga cacagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagagg agagagagag 240aggggtgggt cagtacatgt ggcagattcg cacgtgcctc tttgtgccct tggaaaatgc 300ccaaaattag cacttggcct ctgcaaaaac tagtactttg agttgagcaa catatatgaa 360ttcacatttc cacgctaata cactatcttt cctattatct cttaaaagaa ataaaaaaaa 420tttccaaaat acgaaggaac aattttcatt gaaactacga taaatcaatg ttcctagaca 480tttgttgttg caaataccaa acataatcac tttcttcacc tcttgcatct tgaatttcct 540tt 542<210>10<211>670<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)
<220>
<221>重复单元<222>(380)..(423)<400>10taagaaagac tttttttgac caaaatgatc atatcataca ttagtcaact tgattttgat 60aaaatcaagg agcttggcat ttgaagaata gttctatatg tactactttt tttttagaaa 120aaaatgtgat tgactttgat ataattaaac atttataaac cttttgaatt agcagagaaa 180agggcagttg gttattattg agctagctca atacagtttg gtcaggctga gaaaattggc 240gatataagta gatatctaat tttacctata ataagtcata ggcaaatgat gcactaaacg 300caaatttcca agatgattta agggtccaaa atccttttat acttaggtga gtttttagag 360agagtttcac ttgtgtcttt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 420ctctatctct atatccattt acagctccat tttctttatg aatgaatgtt gacgcacgct 480ttcacctaac tctgctttct aatctaaaat caagattgga agagttttat gttttctttt 540tcgacttcta gagataacat tttttttggg tattgcgtat gatgattgga tataaatgtt 600gactttttaa agggcttttt ttggcaccga aatgactatg gcgaagttgt tttgatccca 660aatgagtgtt 670<210>11<211>1068<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(683)..(714)<400>11taaaaaatgg agacaccatt atcatctaaa attcgaagaa aattcaaaag cagtgacagg 60agttgtagac ttacacccat acgtttgccc ttgcctccag ccagaagaat gaccgaaacg 120
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<221>重复单元<222>(331)..(346)<220>
<221>重复单元<222>(349)..(376)
<400>12taatcgcctt actagttgct gtactgatat acttgggagc gaagaaaaga aaaatgatca 60agctcaagga gaaattcttt gtagaaaatg gaggattgat gttacaacaa caacttgcta 120gtagaagacc agtcgagacg acaaaaatat tttctgagga cgaactgaga agcgccacaa 180acaattacca ccaaaagaga gttctaggag aaggaggatt tggaatagtg tataaaggaa 240tatttccaga tcaaagggtt gttgcaatta ataacacctc aaaaaagctc agaaaaaaaa 300aaaaaccaga aaccaaaatc atgtttgttt gagagagaga gagagaggga gagagagaga 360gagagagaga gagagagtcc aagtctcttt gtccttctac gccagcctct gacacgtgct 420ctcatggggt tgtcctattc tcatctcatc tcatcatgct tggccttggc ctttgccttc 480ccaatttttc ctctgtaaca ctcttctatt caaaataatc tcatattgtt gatattcaat 540caaaagaaga ggcgctattg tttatttgtt ttcatactgc aaattctacg cgtatatgta 600cgcacatgaa aatgtattag agttattatt gcgttattta taagtgaga 649<210>13<211>326<212>DNA<213>苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)<220>
<221>重复单元<222>(26)..(43)<400>13attctctctc ttcaaaggta aagtttctct ctctctctct ctcctttttt ttttctgtga 60atgtatagta atggaatgaa tgtcaagaaa ccatgctcat gcaagttctg cgatgatagt 120tttggtgacg ggtttcgctt ctgttctctt agtttgtgcc gaatttagca ttttcgtagg 180catttcttag ggtcggaagg tagtgattgg agattctagt ttcggtaatg gcggatcttt 240aggttctact ctctgattgt ggtttttttc tgtatggttg tgttcgttgc gtgttggatc 300tgtgggaaat tttggatttt ttttgg 326
权利要求
1.一种苎麻微卫星标记，其特征在于，所述微卫星标记的编号分别为BN19、BN20、BN21、BN22、BN23、BN24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33其核甘酸序列是BN19taaattgtga aggccatttt gggccttcac tttgttgaat gcccaaccca tttatgggcc 60taacagcaag aaagctgtga aggctatttt cgaccttgtt ctagcgcctc ataagtggct 120aacgcccatt tgtatcttgg ccaaatgtgt aagaaggcct tgaacctagt agtgggccac 180ttaattactc aaagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 240agagagagag agagagagag agagagagag aggggttttc tgagatgggc tagctcaaag 300tcaggtgggc ctggcgttgg cccgaaatga ccaaactcga cccgacccgg aagtgaccaa 360cctcgggtca agaagtgaca cgtggacaga agtacctaac tgtcagcctc aggtaatttc 420atggaagtgg ataaagaaac agagagagag agagagcgcg agattttagc gccttttaac 480cagacacaac cgttccaagt tttgaaaagc gctataaggg tgaatctgct ccacgacaga 540ttcgatttca tcattacttt cgaacccaaa agacttcaat tgacgaaagc cttctttatc 600taattgataa acaatatttt tgacacccgc aaatccatat aagtgcaata cttcagattt 660tttcacgatc attt 674BN20taaggcttgt tggacctcca agtgagtccc taatacttat tataatatat tatatgttca 60aatactcagt tgggatcaaa acaactttgt tagagtcgct tcggagccaa aaaactattt 120tgaaggctat atttcgacaa aactagttat aacgatttac tttttgcgcg aaataaattt 180ttaagcttgg agtagtcaag agtggttgaa gctctaacca ctagagattt tgagaagcgc 240acagtatgag cgaaaatggg cttgtgggtt ttggtgtaga tggcaaagga aggtgaagaa 300caagcgtaga atgtcgaagc agagaacgcc atcgaagggg agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag agagagagag aattctagaa aatctcttac ttgcttttta 420cttgtaatct ccagattagc aaagtcgaca cgtggcgcaa cggacatccc gagttgggat 480acccagtcac gtgcctcacg tgaagttggg acaaaatttt gtcccaacat ttacatttag 540cataagatag tgttactgtg atatcccgat t 571BN21caagtgaata tcaagcatat agcttcttct ttctctctct cgtttccctt tttcccttct 60tttcaggaca tttcagatac tttctggttt tatccaatgt tgcacaaaag aaaatatgat 120tcactaacat gtcaatacgg gaaagagaac tcaatcaaat caaatcaaat caaacgatat 180cacagacaac aatcacgtat catgaattac tggtcacaca tattcttgtg atagtcaaga 240ctagatcaag aaatcatgca ttttcctttt atacatagca gagaaaacct tagacttgta 300tatatgtctg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag agagagagag agagagagag agagagagag 360agagagagag agagagagag 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ctcacatcgg aagaaaaagc 360agaaaaggtg aggctcagac ggagagtggg agtgggtatg gccatatctg ttttagtgtt 420ttcggattgg aagtggcatt cactgccact gctgactttg atacgcagag cacaacgcaa 480cacagaatga agttcgggcg gcgatggatg gcttggggtt tctcgagacg atgggcggtg 540gtcggagggg aaggtacgcc gcgattctca gcggcagagg cgacggcgtt cggcagtgat 600tttgggtggt tcaattttgg gtttctctcg gaaaaagatg gcggtgaccg actttgttgc 660cggcagttgg ataacaaaga tcgagagaga gagagagaga gagagagaga gagagtgagt 720acgctgttcc tggaagtagt agtttccttg gaggcgacag ccgaggcgat cgatggcttg 780gccggtctcg cggatccaga atccgacggt gtaggttgct ttgcccaaag tcccatctta 840gcgagctcgg agtcgtcgtc ttcagtgggg atttaggttt ctgagtcaaa cagaccaaga 900ttttgatttc gggagaagag aaatgatacc cgagaaagcg ggggattggg gtataaaacg 960acgactcacc ggtcgtggat gttttttttt gacaattacg tgattcccat tttaccaggg 1020gacgaattca tctatcctaa agattccgta ccgactcaat tcaacttg 1068BN32taatcgcctt actagttgct gtactgatat acttgggagc gaagaaaaga aaaatgatca 60agctcaagga gaaattcttt gtagaaaatg gaggattgat gttacaacaa caacttgcta 120gtagaagacc agtcgagacg acaaaaatat tttctgagga cgaactgaga agcgccacaa 180acaattacca ccaaaagaga gttctaggag aaggaggatt tggaatagtg tataaaggaa 240tatttccaga tcaaagggtt gttgcaatta ataacacctc aaaaaagctc agaaaaaaaa 300aaaaaccaga aaccaaaatc atgtttgttt gagagagaga gagagaggga gagagagaga 360gagagagaga gagagagtcc aagtctcttt gtccttctac gccagcctct gacacgtgct 420ctcatggggt tgtcctattc tcatctcatc tcatcatgct tggccttggc ctttgccttc 480ccaatttttc ctctgtaaca ctcttctatt caaaataatc tcatattgtt gatattcaat 540caaaagaaga ggcgctattg tttatttgtt ttcatactgc aaattctacg cgtatatgta 600cgcacatgaa aatgtattag agttattatt gcgttattta taagtgaga 649BN33attctctctc ttcaaaggta aagtttctct ctctctctct ctcctttttt ttttctgtga 60atgtatagta atggaatgaa tgtcaagaaa ccatgctcat gcaagttctg cgatgatagt 120tttggtgacg ggtttcgctt ctgttctctt agtttgtgcc gaatttagca ttttcgtagg 180catttcttag ggtcggaagg tagtgattgg agattctagt ttcggtaatg gcggatcttt 240aggttctact ctctgattgt ggtttttttc tgtatggttg tgttcgttgc gtgttggatc 300tgtgggaaat tttggatttt ttttgg 326
2.根据权利要求
1所述的苎麻微卫星标记，其特征在于所述BN19、BN20、BN21、BN22-23-24、BN25、BN26、BN27、BN28、BN29、BN30、BN31、BN32、BN33十五个位点的引物序列为BN19-FGCT AAC GCC CAT TTG TAT CTT GBN19-RGGC CCA CCT GAC TTT GAG CBN20-FTGG CAA AGG AAG GTG AAG AAC AAGBN20-RTGA GGC ACG TGA CTG GGT ATC CBN21-FAGA TGC TTT TGG CTA TGCBN21-RTCA AAC GAT ATC ACA GAC AACBN22-FGCC CAG GAA GCC ATT GAA GCBN22-RGAC GAC GGC AAT GGC TCT CABN23-FTGC CGT CGT CTC TGC CAT TAT CGBN23-RGCC CCA CCC AGC CCT ATC TTC ABN24-FCTT CTT CGTCGG ATT CTT GTT CBN24-RGCT TTT CTC TTC TCC TTC TTG TTTBN25-FCTC TCT CAA CTC ATA CCA ATA ATBN25-RAGA GAA CAG CCA ACA TCA ABN26-FCGT GCC TAT GAC TTC GTT TCT CBN26-RTTT CCA ATA ATT CAG CCT TCA CTTBN27-FGGA CAT AAG AAC CCC CAA CAC TBN27-RGGC CAC CCT ATA AAT ATC CTT CACBN28-FTTC CGA TGA CAA ACC ACT GCTBN28-RACA CTC ACC AAC CCA TTA CAT CACBN29-FCTT GCC GCT TCT TCA GTA GGT CTGBN29-RGGC ATT TTC CAA GGG CAC AABN30-FAAT TAG CAG AGA AAA GGG CAG TTBN30-RAAA GCG TGC GTC AAC ATT CABN31-FAAG GTA CGC CGC GAT TCT CBN31-RTGG GCA AAG CAA CCT ACA CCBN32-FCGC CAC AAACAA TTA CCA CCA ABN32-RAAT AGG ACA ACC CCA TGA GAG CACBN33-FAAG GTA AAG TTT CTC TCT CTC TCBN33-RAGA ATC TCC AAT CAC TAC CTT
专利摘要
本发明涉及一种苎麻的DNA分子遗传标记，提供了15个苎麻微卫星位点的DNA序列及扩增上述15个苎麻微卫星位点的引物序列和扩增方法，15个苎麻微卫星位点用于苎麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
文档编号C12P19/00GKCN1814787SQ200510032422
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月24日
发明者揭雨成, 蒋彦波, 周建林, 张健 申请人:中国农业科学院麻类研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan