专利名称:红麻微卫星dna标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子标记技术，具体涉及一种红麻的DNA分子遗传标记。
背景技术：
微卫星(又称为简单重复序列，SSR)是由1～6个核苷酸组成的短序列串联重复多次而组成的一段DNA，广泛分布于真核基因组中。微卫星序列两侧有保守的DNA序列，根据其两侧的保守序列设计引物，可用PCR扩增出微卫星位点的序列。由于微卫星中重复单元的重复的次数不同，因而扩增出的微卫星序列的长度呈现多态性(即SSRLP或SSR)。由于其具有多态性丰富、重复性高、共显性遗传等优点，被广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位、遗传关系分析，品种鉴定等领域。如用微卫星标记分析苎麻品种的亲源关系(Zhou等，2005，Progress in Natural Science，15137-142)与用微卫星DNA标记进行猪品种分类的公开号为CN 1370834A的专利申请“适于猪品种分类的猪微卫星DNA标记”。
红麻(又称为“洋麻”，种名为Hibiscus cannabinus L.)属于锦葵科木槿属，是我国重要的纤维经济作物。红麻的品种分类、遗传关系分析等一般是根据形态、生理指标进行，准确度低、且受生长季节、发育时期等的限制。红麻的分子标记的研究起步较晚，有研究者尝试用RAPD(随机扩增多态性DNA)标记进行了红麻品种亲源关系分析，取得了成功(Cheng等，2002，Hereditas，136231-239)。但是，RAPD标记在绝大多数情况下是显性标记，不能区别纯合基因型与杂合基因型。如何解决红麻品种分类、遗传关系分析中存在的准确度低，及受生长季节、发育时期限制的问题，则是开展红麻研究迫切需要解决的技术。
发明内容
本发明旨在分离克隆微卫星DNA标记，建立红麻的微卫星DNA的技术体系并利用这些分子标记进行红麻品种分类、遗传关系分析和辅助育种。
实现上述发明目的的技术方案包括红麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建、含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序，得到21个含有(CT/AG)微卫星克隆，确定了5个多态性丰富的微卫星标记HCM30、HCM31、HCM32、HCM33、HCM34；HCM30为547个核苷酸，HCM31为820个核苷酸，HCM32为662个核苷酸，HCM33为455个核苷酸，HCM34为726个核苷酸。
下面结合附图进一步详述本发明。
图1、用HCM30位点的特异性引物扩增16个红麻品种DNA的PAGE电泳图图2、用HCM31位点的特异性引物扩增16个红麻品种DNA的PAGE电泳图图3、用HCM32位点的特异性引物扩增16个红麻品种DNA的PAGE电泳图图4、用HCM33位点的特异性引物扩增16个红麻品种DNA的PAGE电泳图图5、用HCM34位点的特异性引物扩增16个红麻品种DNA的PAGE电泳图1红麻(CT/AG)n微卫星富集文库的构建(1)按郭安平等方法(参见郭安平等，1997，中国麻作，194-10)提取红麻基因组DNA。用限制性内切酶Mse I酶切红麻基因组DNA，酶切产物在1.2％琼脂糖凝胶上电泳，紫外光下切下300-1000bp大小的DNA片段并用凝胶回收试剂盒(购自Qiagen公司)纯化回收的酶切产物。
(2)将碱基互补的寡核苷酸PHC-1(5’-AGATGGAATTCGTACACTCGT-3’)和磷酸化的寡核苷酸PHC-2(5’-phos-TAACGAGTGTACGAATTCCATCT-3’)等摩尔混合，95℃变性5分钟，60℃退火1小时，形成具有MseI粘性末端的接头。
(3)将酶切产物和接头用T4DNA连接酶连接。连接产物用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，离心收集上清液。在上清液中加0.3M醋酸钠(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀，70％乙醇清洗一次，真空抽干DNA后溶于50μl无菌水中。
(4)用生物素标记的寡核苷酸探针(CT)15与连接产物DNA片段杂交。具体操作为在总体积100μl杂交液(6×SSC，0.1％SDS)中加入500ng连接产物和100pmol生物素标记的寡核苷酸探针，并在95℃下变性10min，60℃杂交1小时。
(5)加入100μl(10μg/μl)磁珠(Dynabeads M-280，购自Dynal Biotech公司)，并在室温放置30分钟。
(6)用磁铁吸附磁珠，弃上清。磁珠用400μl洗涤缓冲液(6×SSC，0.1％SDS)在60℃下洗涤15分钟，然后在室温下，分别用2×SSC和1×SSC溶液洗涤两次，并弃上清。
(7)最后加入50μl无菌水，在90℃下保温10分钟，小心吸取上清，上清液即为含有(GA)n重复序列的单链DNA片段。以PHC-1为引物，以单链DNA片段为模板进行PCR扩增获得双链目的片段。
(8)将扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体(购自大连宝生物公司)上，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌液涂抹在含有IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上进行蓝白斑筛选。
2.含微卫星序列的阳性克隆的筛选、测序及微卫星引物的设计
(1)挑取白色菌落并接种到3ml LB培养液中，于37℃培养过夜，然后提取质粒。
(2)以质粒DNA为模板，采取PIMA方法(参见Lunt等，1999，Molecular Ecology，8891-894)筛选含有(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。
(3)将阳性克隆测序，分析是否含有(CT/AG)n重复序列。通过测序，共得到了21个含(CT/AG)n微卫星序列的阳性克隆。
(4)根据微卫星重复序列两侧的保守序列设计引物。
3.利用红麻微卫星DNA标记分析红麻品种间的遗传差异将上述微卫星标记用于16个红麻品种的分类，确定了5个多态性丰富、适于红麻品种分类的微卫星标记HCM30、HCM31、HCM32、HCM33、HCM34。具体操作步骤如下(1)按郭安平等方法(参见郭安平等，1997，中国麻作，194-10)提取各个红麻品种的DNA。
(2)分别用HCM30、HCM31、HCM32、HCM33、HCM34 5个位点的5对引物(引物序列见表1)扩增这16个品种红麻的DNA。
(3)将各个PCR产物在6％变性聚丙烯凝胶上电泳，然后进行银染并拍照(图1-5)。
(4)结果分析对每对引物PCR扩增产物进行分析，每个样品的扩增条带按有或无记录，扩增条带存在时赋值为1，否则赋值为0。采用SPSS10.0for windows统计分析软件中的系统聚类分析程序，距离测量选用相关系数距离法，用类间平均连锁法(Between-groupslinkage)进行聚类分析并建立品种间亲源关系系统树。具体分析方法参见《系统与进化植物学中的分子标记》(邹喻苹、葛颂、王晓东编，科学出版社，2001年)中的方法进行。
由附图1-5可看出，本发明的五个微卫星点的序列长度在供试的16个品种中都出现多态性，由此可见，本发明的这五个微卫星标记能用于苎麻的品种分类和遗传关系分析。
表1引物特性表引物序列，退火温度，片段大小
注F表示5’端引物，R表示3’端引物。
本发明提供了5个红麻微卫星位点的DNA序列及扩增上述5个红麻微卫星位点的引物序列和扩增方法，5个红麻微卫星位点用于红麻品种分类、遗传关系分析和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
序列表<110>湖南师范大学<120>红麻微卫星DNA标记<160>5<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>547<212>DNA<213>红麻(Hibiscus cannabinus L)<400>1aaaggaaatt caagatgcaa gaggtgaagg aagtgattat gtttggtatt tgcaacaaca 60aatgtctagg aacattgatt tatcgtagtt tcaatgaaaa ttgttccttc gtattttgga 120aatttttttt atttctttta agagataata ggaaagatag tgtattagcg tggaaatgtg 180aattcatata tgttgctcaa ctcaaagtac tagtttttgc agaggccaag tgctaatttt 240gggcattttc caagggcaca aagaggcacg tgcgaatctg ccacatgtac tgacccaccc 300ctctctctct ctccctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcaaa tttttctcta 360agcagacatg gccaacaatt cttcttcatc agccaaatac acaatggtgg cagccaagaa 420ccgctgggaa gagcaaggat tctatctgga tgacagccaa gttaaatacg gcctggagcc 480gatcattcac aaaaggctgc acgaactcag ctagttccgc cttgcaagca gccagccagg 540gccaact 547<210>2<211>820<212>DNA<213>红麻(Hibiscus cannabinus L)<400>2aaaaggaaat tcaagatgca agaggtgaag aaagtgatta tgtttggtat ttgcaacaac 60
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权利要求
1.适于红麻品种分类、遗传关系鉴定和辅助育种的微卫星DNA标记，其特征在于，所述的编号分别为HCM30、HCM31、HCM32、HCM33、HCM34的五个微卫星DNA标记的核苷酸序列如下HCM30aaaggaaatt caagatgcaa gaggtgaagg aagtgattat gtttggtatt tgcaacaaca 60aatgtctagg aacattgatt tatcgtagtt tcaatgaaaa ttgttccttc gtattttgga 120aatttttttt atttctttta agagataata ggaaagatag tgtattagcg tggaaatgtg 180aattcatata tgttgctcaa ctcaaagtac tagtttttgc agaggccaag tgctaatttt 240gggcattttc caagggcaca aagaggcacg tgcgaatctg ccacatgtac tgacccaccc 300ctctctctct ctccctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcaaa tttttctcta 360agcagacatg gccaacaatt cttcttcatc agccaaatac acaatggtgg cagccaagaa 420ccgctgggaa gagcaaggat tctatctgga tgacagccaa gttaaatacg gcctggagcc 480gatcattcac aaaaggctgc acgaactcag ctagttccgc cttgcaagca gccagccagg 540gccaact 547HCM31aaaaggaaat tcaagatgca agaggtgaag aaagtgatta tgtttggtat ttgcaacaac 60aaatgtctag gaacattgat ttatcgtagt ttcaatgaaa attgttcctt cgtattttgg 120aaattttttt tatttctttt aagagataat aggaaagata gtgtattagc gtggaaatgt 180gaattcatat atgttgctca actcaaagta ctagtttttg cagaggccaa gtgctaattt 240tgggcatttt ccaagggcac aaagaggcac gtgcgaatct gccacatgta ctgacccacc 300cctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctaaagc 360tggggttttt gcaaagaatt tgccgagaca tggccaaatg agtaatctgg ccatcaattt 420tcttaacatt gaattgtgtc tagctggatt gaagaacgta gtttctggtt ctttctatta 480gaaccttcct ttgtaatact tggggattga actcttccaa gagaaccaag acccaagttt 540gatttgattg tgttagatta cagtgtattt taggtgaaag ctgtatctgc aagagtttag 600ccactttctt ggatattgga atcaattact taactaaaat aaaaacaaaa atgtgcatag 660tgttttcatt ctttagtcgc cgatgtataa taatagttta agtttattga ctcttctgat 720tctaggcttt ctagatttga cttgtctgtt aaagactgtg gttcttcttt ttctggtaaa 780ttgatattgg atgtgcctac tcgatggaac tctacttatt 820HCM32acagggaaaa atgaaggcat aatccgatca tccgagtttt ggccgaagaa actccgttga 60aaccccacct tgtgttgtgc atcagccaag tatcagattt actaccgttt gagcggagat 120cgcgcccgga gcacctagaa acttggaaaa aattgacttt aatttcgaat tcatgggtat 180accaatcggg tttgtgggtc tctcccgtag taagtaactc catctctctc tctctcttcc 240gttcatctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 300ctctcttttt gtttcttcca ttttctttct ttccaaaaac tgaaactttc ttggcattcg 360ttacgattta taattagccc ccacccctaa aaattttaca taaaaaagac agccagatcc 420ccaccattga aatgatgctt tgctttgtag cattcatcat caccgtccaa tccaatgcct 480gcagcaatgg atgacccata atccggtaca agcccgagca ttttctgtaa gccccccccc 540cccaaaaaaa aaaaaaaacc aaccatgctc gcctttgttg aaattaaaga agttcgacgg 600tgaagaaatc atttaagaaa tcagtgaatt cacctaatga ggtgaatttg atcaatgaag 660gat 663HCM33acaactcacc actgtgatgg accaattgac tcatcgtcaa cagaatgatt gatcggctca 60ctttacaacg atcggtcggc tccttgcaat gaccgattgg tccagttggc tcgtcaccga 120catgatgacg agttggttct ccttctcaac gttagattgg ctcgctttct ggccaccaac 180ataatgatta aataaatttt attctctctc aactcatacc aataattact tcacaaatat 240catttttcta cttcttttat cttttctctc taggctctct ctttcttccg atcttctttc 300ttttctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctttgtcc ttttctccat 360ctttgtctcc tagtgcgccc agattttgtc cagaatgcct caacatccac atcatcccac 420agatccttgt agaaatgcta cagcttcttc tcctt 455HCM34attttttgcg tccatgtttg cttaagcagt caccacctat ttttgctcat tctttgtttt 60tcttctctct cactttctca cttcgctttc ctatctttct cttcgttttg agatcttttg 120gttcatcctt tgtttagttg ttgtggatgt ttctccctga cgtttttggc tctgtgcggg 180ccctcttaag tgaacgagac tatagattgg tgatagagaa gagtttttaa ccagttttca 240tcctcctttt tctgatgacg aggcacttca gtgtcgtagc ctacatcatt tcttaagctt 300ttgtgatgcc tttcatctaa ccgcaatgct tgatgttagt ctctctccac atctccttca 360aactctcgat acttttgtat gcatcagatt tgacacacaa cttgatgagt ggacgctagt 420tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tcatacaata gtgtatgaca 480taactatggt ttttggaaac aatagcagaa ttcaaactaa cgctatacaa gaggaggaaa 540aacctgccta ttggtttact ttccagtttc aactagagat tcccattaat gtaagggaag 600aagtggaagt gcattgttaa gtgcacttat tgttgtcgag ttaaaacaga tgagggtttt 660gaactgcctg cctgtgatcc tagtttgtat aaggttatgt ttgcatagcc aacttgagat 720atagtt 726
2.根据权利要求
1所述的一种适于红麻品种分类、遗传关系鉴定和标记辅助育种的微卫星标记检测技术，其特征在于HCM30、HCM31、HCM32、HCM33、HCM34五个位点的引物序列为P30-F5’-AAGGGCACAAAGAGGCACG-3’P30-R5’-GGCTGATGAAGAAGAATTGTTGG-3’P31-F5’-CGTGCGAATCTGCCACAT-3’P31-R5’-CTTGGGTCTTGGTTCTCTTGG-3’P32-F5’-GGTCTCTCCCGTAGTAAGTAACTCCA-3’P32-R5’-TGGTGGGGATCTGGCTGTCT-3’P33-F5’-ACCGACATGATGACGAGTTGG-3’P33-R5’-GTGGGATGATGTGGATGTTGAG-3’P34-F5’-CACAACTTGATGAGTGGACGCTAG-3’P34-R5’-CCTCCTCTTGTATAGCGTTAGTTTG-3’
专利摘要
本发明涉及红麻的DNA分子遗传标记。本发明分离克隆了5个多态性丰富的红麻微卫星DNA标记的DNA序列和扩增该5个红麻微卫星位点的引物序列。本发明的红麻微卫星DNA标记用于红麻品种分类、遗传关系鉴定和标记辅助育种，重复性好，是一种可靠有效的分子标记。
文档编号C12Q1/68GKCN1757731SQ200510031930
公开日2006年4月12日 申请日期2005年7月28日
发明者周建林, 揭雨成, 蒋彦波, 张健 申请人:湖南师范大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan