专利名称：一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于无机纳米材料应用领域，尤其是涉及一种ZnO纳米材料在抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性方面的应用。
背景技术：
大白菜软腐病是一种细菌性病害，全国各地都有发生，此病在发病菜地能迅速传染扩大危害，严重时可造成大白菜减产50%以上。胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(E. carotovora subsp. Carotovora)是该病主要的病原菌,本菌除为害大白菜外,还可以为害马铃薯、胡萝卜、洋葱、辣椒、大蒜、人参、君子兰、魔芋、郁金香、马蹄莲等植物，引起不同程度的损失。可用于防治细菌性病害的药物比较少，并且农用链霉素等防治该病原菌的主要传统药物，易产生耐药性，导致药效降低，同时也存在残留的问题，因此，有必要研究控制细菌性病害的新方案。 ZnO作为一种新型无机抗菌材料，具有较高的热稳定性、化学稳定性以及光催化活性，在诸多行业的应用前景受到广泛的关注。研究表明，ZnO对于革兰氏阳性和阴性细菌都有较好的抑制效果，其抑菌性能随其浓度增加和粒径减小而升高，而且ZnO在有光照和无光照条件下都有良好的抑菌活性，这为ZnO的抗菌应用提供了更广泛的空间。ZnO在水中释放出的微量Zn2+还是植物生长所必须的矿质元素，可以说，ZnO是一种环境友好型的功能材料。但是将ZnO纳米材料作为抗菌材料应用于抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性方面，还未见报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种原料易得，成本低廉，操作简单，以期设备简单，适合于大规模工业生产的ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，将ZnO单独或ZnO与硫酸链霉素混合后，超声处理30分钟，加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，作用2小时，防控胡萝卜软腐欧文氏菌。ZnO单独加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，得到的混合物中ZnO的浓度为O. 001 O. 01g/L。所述的ZnO 的浓度为 O. 0025g/L、0. 004g/L、0. 005g/L、0. 01g/L。ZnO与硫酸链霉素混合后，加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，得到的混合物中ZnO的浓度为0. 001 0. 002g/L，硫酸链霉素的浓度为0. 0006 0. 001g/L。所述的混合物中ZnO的浓度为0. 001g/L时，硫酸链霉素的浓度为0. 0006g/L或0. 001g/L ；Ζη0的浓度为0. 002g/L时，硫酸链霉素的浓度为0. 0006g/L或0. 001g/L。所述的ZnO的粒径为10 20nm。所述的硫酸链霉素为市售农药，剂型为可溶性粉剂。
检测ZnO对抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的效果,方法如下挑取4°C下保存的胡萝卜软腐欧文氏菌的单菌落，接种于LB液体培养基，置于28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm培养20小时得到原始菌液。将得到的原始菌液进行稀释，然后取O. 5ml稀释后的菌液加入等体积系列浓度梯度的ZnO悬液、硫酸链霉素溶液及ZnO和硫酸链霉素混合液中作用2小时。最后从每种混合液中吸取O. Iml加入已倒好凝固的LB琼脂固体培养基平板上，在28°C下培养24小时观察结果。与现有技术相比，本发明首先利用ZnO纳米材料防控细菌性病害病原菌有利于在传统药物药效降低时保持防效，同时也可以减少农用链霉素的使用，这有助于降低耐药性产生的风险，同时ZnO的光催化性质，还具有将残余链霉素降解的潜力，这为探索高效、低毒、环境友好的新型杀菌剂提供了思路。本发明原料易得，成本低廉，操作简单，以期设备简单，适合于大规模工业生产。
图I为纳米ZnO的XRD结果；图2为纳米ZnO的TEM照片；图3为不同浓度的纳米ZnO对胡萝卜软腐欧文氏菌抑菌活性的测定结果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。实施例I纳米ZnO结构表征对待测ZnO进行X射线衍射(XRD)分析和透射电子显微镜(TEM)观察粒度分析。图I是ZnO纳米粒子的XRD分析结果，各衍射峰明显宽化，根据Scherrer公式得出ZnO纳米粒径大小为17nm。图中所有的衍射峰都可以清楚地指标化为纯的纤锌矿结构的晶体ZnO的晶面衍射。XRD图中没有出现其它物质的衍射峰，表明此纳米ZnO纯度很高。从图2可知，纳米氧化锌是颗粒状，颗粒直径在10nm_20nm之间，显示为六方晶型，从TEM中得到的粒子尺寸与由XRD衍射半峰宽计算出的晶粒尺寸符合的很好。颗粒尺寸大小比较均一，由于粒径较小产生了一定程度的团聚。团聚会影响纳米ZnO抑菌效果，本研究中采用的纳米ZnO样品在测试前经过超声处理，能有效的缓解团聚现象，更真实的反映具有纳米尺寸效应的ZnO的对病原菌的抑制活性。纳米ZnO抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性测试采用平板涂布法进行毒力测试。挑取4°C下保存的胡萝卜软腐欧文氏菌的单菌落，接种于LB液体培养基，置于28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm培养20小时得到原始菌液。将得到的原始菌液用无菌水稀释至I. OX 103CFU/ml，然后取O. 5ml稀释后的菌液加入O. 5ml经过超声处理30分钟的ZnO悬液中，制成含ZnO浓度为O. 0025g/L的菌液，试验同时设置无菌水对照。将上述菌液置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，从菌液液中吸取O. Iml加入已倒好凝固的LB琼脂固体培养基平板上，用涂布棒轻抹均匀，每个处理重复三次。平板倒扣置于28°C下黑暗培养24小时后统计各处理平板上的菌落数量，按如下公式计算各浓度下的抑制率)。
-^ ΙΜ^Ι ____
抑制率(％) =-.ππ·^^·-X 100%
对照囷袼教从图3中可以看到ZnO纳米材料取得了非常不错的抑菌效果，在O. 0025g/L时对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制率可达73%。实施例2在超声处理30分钟后的纳米ZnO悬液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO浓度为O. 004g/L的菌液，置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料的抑菌活性。从图3中可以看到ZnO纳米材料取得了非常不错 的抑菌效果，在O. 004g/L时对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制率可达95%。实施例3在超声处理30分钟后的纳米ZnO悬液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO浓度为O. 005g/L的菌液，置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料的抑菌活性。从图3中可以看到ZnO纳米材料取得了非常不错的抑菌效果，在O. 005g/L时对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制率可达99%。实施例4在超声处理30分钟后的纳米ZnO悬液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO浓度为O. 01g/L的菌液，置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料的抑菌活性。从图3中可以看到ZnO纳米材料取得了非常不错的抑菌效果，在0.01g/L时对胡萝卜软腐欧文氏菌的抑制率可达100%。实施例5纳米ZnO与硫酸链霉素联用效果的测定根据预试验结果，选取中低效的ZnO与硫酸链霉素联合使用，测定混用效果。在超声处理30分钟后的ZnO和链霉素混合液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO与硫酸链霉素终浓度分别为O. 001g/L+0. 0006g/L的混合液。按例I中方法作用2小时后，取O. Iml加入已倒好凝固的LB琼脂固体培养基平板上，用涂布棒轻抹均匀，每个处理重复三次。在28°C黑暗下培养24小时后观察结果。按例I中的方法计算抑制率后，运用Abbott方法评估联用的效果。首先计算预期联用抑制率(％ )，计算公式为% Cexp = A+B- (AXB/100)其中A和B为单剂的抑制率)。然后计算协同效应系数(SF)SF = % Cobs/% Cbxp其中％ Ctjbs为实际联用的抑制率)。从表I中可以看到ZnO纳米材料与硫酸链霉素取得了一定的增效抑菌效果，在O. 001g/L+0. 0006g/L浓度配比时超过二者单独使用效果的加和。实施例6在超声处理30分钟后的ZnO和链霉素混合液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO与硫酸链霉素终浓度分别为O. 002g/L+0. 0006g/L的混合液。置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用的抑菌活性。从表I中可以看到ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用取得了良好的抑菌效果，在O. 002g/L+0. 0006g/L浓度配比时约等于二者单独使用效果的加和。实施例7在超声处理30分钟后的ZnO和链霉素混合液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO与硫酸链霉素终浓度分别为O. 001g/L+0. 001g/L的混合液。置于避光的28°C恒温的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用的抑菌活性。从表I中可以看到ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用取得了较好抑菌效果，在O. OOlg/L+0. 001g/L浓度配比时约等于二者单独使用效果的加和。实施例8在超声处理30分钟后的ZnO和链霉素混合液中加入胡萝卜软腐欧文氏菌悬液，制成含ZnO与硫酸链霉素终浓度分别为O. 002g/L+0. 001g/L的混合液。置于避光的28°C恒温 的振荡水浴器中以IlOrpm充分作用2小时后，检测ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用的抑菌活性。从表I中可以看到ZnO纳米材料与硫酸链霉素联用取得了良好抑菌效果，在0. 002g/L+0. 001g/L浓度配比时约等于二者单独使用效果的加和。表I纳米ZnO与硫酸链霉素联用效果测定结果
权利要求
1.一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，将ZnO单独或ZnO与硫酸链霉素混合后，超声处理30分钟，加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，作用2小时，防控胡萝卜软腐欧文氏菌。
2.根据权利要求I所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用,其特征在于，ZnO单独加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，得到的混合物中ZnO的浓度为O.001 O. 01g/L。
3.根据权利要求2所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，所述的 ZnO 的浓度为 O. 0025g/L、0. 004g/L、0. 005g/L、0. 01g/L。
4.根据权利要求I所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，ZnO与硫酸链霉素混合后，加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，得到的混合物中ZnO的浓度为O. 001 O. 002g/L，硫酸链霉素的浓度为O. 0006 O. 001g/L。
5.根据权利要求4所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用,其特征在于，所述的混合物中ZnO的浓度为O. 001g/L时，硫酸链霉素的浓度为0. 0006g/L或0.001g/L ；Ζη0的浓度为0. 002g/L时，硫酸链霉素的浓度为0. 0006g/L或0. 001g/L。
6.根据权利要求I或2或4所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，所述的ZnO的粒径为10 20nm。
7.根据权利要求I或4所述的一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，其特征在于，所述的硫酸链霉素为市售农药，剂型为可溶性粉剂。
全文摘要
本发明涉及一种ZnO纳米材料抑制胡萝卜软腐欧文氏菌活性的应用，将ZnO单独或ZnO与硫酸链霉素混合后，超声处理30分钟，加入含胡萝卜软腐欧文氏菌的悬液中，作用2小时，防控胡萝卜软腐欧文氏菌。与现有技术相比，本发明具有原料易得，成本低廉，操作简单，以期设备简单，适合于大规模工业生产等优点。
文档编号A01P1/00GK102823623SQ201110164830
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者吴庆生, 薛敬哲, 罗志辉 申请人:同济大学