专利名称：用Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株生产果聚糖的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能够产生果聚糖的微生物Cellulomonas sp.nov.GJT07以及利用该菌株生产果聚糖的方法。
背景技术：
果聚糖是自然界中分布最广泛的生物高分子，是由以β-2，6-键和β-2，1-键连接的呋喃果糖基组成的同多糖。果聚糖在植物中是作为碳水化合物储存物质而产生的。据本发明人通过查阅资料、文献检索所知，有些微生物也能产生果聚糖，包括细菌、酵母和真菌。如醋杆菌属、放线菌属、曲霉属、芽胞杆菌属、棒杆菌属、欧文氏菌属、假单胞菌属和链球菌属等。但国内外尚未有纤维单胞菌属(Cellulomonas)微生物产果聚糖的报道。
果聚糖定性和定量的分析方法主要采用分光光度法和色谱法。其中，色谱法最为常用，包括纸层析、薄层色谱以及高效液相色谱法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能产生果聚糖的微生物Cellulomonas sp.nov.GJT07以及利用该菌株生产果聚糖的方法。
本发明分离纯化出一株来源于土壤的微生物Cellulomonas sp.nov.GJT07，其具有产生果聚糖的特性，保藏单位简称CCTCC，保藏号为M205085。
本发明的特点是首次分离出产果聚糖的Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株。该菌株为不规则杆状，革兰氏阳性，0.5～0.6μm×1.8～2.1μm，单个或呈V字状排列，运动，不能形成芽孢，不抗酸。此菌株在营养肉汤培养基上37℃培养24h形成单菌落，菌落淡黄色凸起，圆形，边缘整齐。接触酶阳性，能分解纤维素，还原硝酸盐到亚硝酸盐。根据伯杰氏手册第九版，确定其为纤维单胞菌属，但其形态和生理生化特征与该属已知菌相比有所不同(该菌株与纤维单胞菌属其他菌种的特征对比见表1)。
将本发明的Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株接种于发酵培养基中，30℃摇瓶培养48h后，收集发酵液，并冷冻离心去除菌体，获得含有多糖产物的上清液。然后，用乙醇沉淀法和sevag法来提取纯化产物多糖，冷冻干燥，得到多糖成品。
图1果糖标准品的高效液相色谱分析图。
图2Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株胞外多糖水解液的高效液相色谱分析图。
具体实施例方式
本发明Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株的获得从果园采集土壤样品，加入到装有25ml富集培养基的三角瓶中，30℃，160r/min摇瓶培养48h。然后将富集培养液用无菌生理盐水10倍稀释后，取0.2ml涂布分离培养基平板。30℃倒置培养48h，获得在平板上有粘稠透明外观的菌落，得到一株能产胞外多糖的细菌。通过菌株形态观察和生理生化鉴定，根据伯杰氏手册第九版确定其为纤维单胞菌属。富集培养基由蔗糖2g，酵母膏3g，NaNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NH4Cl 0.5g，FeSO40.01g组成，加蒸馏水1000ml，调pH7.5；分离培养基由蔗糖10g，酵母膏3g，NaNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，NH4Cl0.5g，FeSO40.01g，琼脂15g组成，加蒸馏水1000ml，调pH7.5。
Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株胞外多糖的生产与制备将菌种接种于装有100ml发酵培养基(蔗糖40g，蛋白胨7g，硫酸铵1.4g，K2HPO42g，MgSO40.25g，FeSO40.01g，H2O 1000ml，pH8)的250ml三角瓶中，30℃摇瓶培养48h后，将培养液4℃下4000rpm离心10分钟去除菌体，获得含有多糖产物的上清液。然后，加2.5倍体积的95％乙醇于上清液中，玻璃棒搅动，静置至出现絮状沉淀，离心除去上清液，沉淀以蒸馏水复溶后，用sevag法(加入1/4倍体积的氯仿-正丁醇体积比为4∶1的混合液，振摇30min，离心取水相)去除蛋白，再用2.5倍体积的95％乙醇沉淀多糖，离心，冷冻干燥，得到胞外多糖成品。
Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株胞外多糖的组成分析将胞外多糖在稀酸水解(1mol/L硫酸，90℃，4h)之后，BaCO3中和水解液，离心，取上清液通过纸层析和高效液相色谱法进行分析。将上清液点样于新华中速层析滤纸进行纸层析分析，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝4∶1∶5(溶剂层)，显色剂为苯胺-二苯胺，标准单糖为葡萄糖、半乳糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、果糖。通过纸色谱分析发现，结果显示为单一斑点，其Rf值以及呈色反应都与果糖标准品一致。又将上清液和果糖标准品经精密的高效液相色谱仪进行分析，色谱柱Inertsil NH2(4.6×250mm，5μm)，流动相为乙腈∶水＝75∶25，流量为0.8mL/min，示差检测。结果显示该多糖水解液色谱峰只含一个果糖主峰(图1、图2)，表明该多糖水解液中只有果糖。由此证明由Cellulomonas sp.nov.GJT07菌株生产的胞外多糖为果聚糖。
表1 纤维单胞菌属种间的鉴别
权利要求
1.对能产生果聚糖的一种细菌Cellulomonas sp.nov.GJT07 CCTCC M205085菌株实施专利保护。
2.对Cellulomonas sp.nov.GJT07 CCTCC M205085菌株在果聚糖生产中的应用实施专利保护。
全文摘要
本发明涉及一种能产生果聚糖的微生物Cellulomonas sp.nov.GJT07以及利用该菌株生产果聚糖的方法。本发明的目的是提供一种来源于自然界的菌种Cellulomonas sp.nov.GJT07以及利用该菌株生产果聚糖的方法。本发明从果园土壤中分离纯化出一株细菌Cellulomonas sp.nov.GJT07，其具有产生果聚糖的特性。根据伯杰氏手册第九版，该菌种的形态和生理生化特征与纤维单胞菌属相符。该菌种具有营养要求范围广，容易培养的特点。用本发明的菌株作为果聚糖的生产菌株，具有稳定性好、生产操作简便、成本低等特点，能够实现工业化的生产。
文档编号C12P19/04GK1778896SQ20051010653
公开日2006年5月31日 申请日期2005年9月29日 优先权日2005年9月29日
发明者江晓路, 张红霞 申请人:中国海洋大学