专利名称：一种以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种用于多环芳烃污染土壤原位修复的固定化微生物颗粒的制备方法，主要是以泥炭土为载体的吸附固定化微生物工艺。
背景技术：
泥炭是部分化石化的植物残体，常呈深棕色。泥炭组成成分复杂，主要是木质素和纤维素。泥炭具有多孔结构，部分分解的泥炭具有近乎95％的多孔结构以及值为200m2/g的特定表面积，是天然载体材料。
多环芳烃(PAHs)是指2个或2个以上的苯环稠合在一起的一类化合物，它们在环境中普遍存在。人类活动特别是化石燃料的燃烧是环境中PAHs的主要来源。由于该类化合物的辛醇-水分配系数高，水溶性差，常被吸附于土壤颗粒上。因此，土壤就成为PAHs的主要载体。PAHs在土壤中比较稳定而且难于分解，即便采用处理土壤中易挥发、易降解有机污染物较成功的方法也很难去除土壤中的PAHs。多环芳烃在自然界中的积累会对人类以及整个自然界造成极大的危害，一些多环芳烃进入人体和动物体内后，会产生致癌、致畸、致突变的后果。因此，有关PAHs污染土壤的修复技术倍受关注。尽快开发出安全、高效、实用性强的多环芳烃污染土壤修复技术，是科研工作者面临的艰巨而紧迫的任务。
近年来，发展起来的微生物修复技术为PAHs的降解提供了较好的途径，但也存在一些缺陷，如单位体积内有效降解菌浓度低、反应启动慢、与上著菌竞争处于劣势、抗毒性侵害能力差、对环境条件敏感，加入到修复现场环境中的微生物可能由于竞争或难以适应环境而导致作用结果与实验结果有较大出入，使得不能很好的应用于原位污染土壤修复。因此，亟需开发更高效更适合于原位多环芳烃污染土壤修复的新型生物技术，而微生物固定化技术可以克服这些弊端。
所谓固定化技术，是利用化学或物理的手段，将游离的细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域使其保持活性并能反复使用的一种基本技术。其优点是可以大幅度提高参加反应的微生物浓度，固定化后的微生物耐环境冲击性增强，根据需要可选择适宜的微生物，可降低二次污染等优点，因而被广泛用于修复受污染的流体介质(如废水)和半流体介质(如泥浆)环境中。但将固定化微生物用于降解非流体介质(土壤)中有机污染物的研究，国内外尚未见报道。
微生物固定化技术的关键是筛选适宜的载体材料和确定优化的固定化工艺条件。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于修复多环芳烃污染土壤的固定化颗粒制备方法。本发明以泥炭土为载体材料，采用吸附固定化方法，对高效降解多环芳烃的菌株进行固定化，将制得的固定化微生物应用于多环芳烃污染土壤的修复，结果表明按照该配方制得的固定化生物产品对高分子量多环芳烃污染土壤具有良好的修复效果，是一种可信赖的新型环保生物产品。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案(固定化微生物制备方法)为一种以泥炭土为载体的固定化微生物制备方法，以经过碱化与浸润处理的泥炭土为载体材料，高温高压蒸汽灭菌后，接入菌悬液，然后增殖培养，制得所需固定化颗粒所述泥炭土在作为载体以前需经过碱化与浸润处理，具体处理过程为将自然风干泥炭土过2mm筛后，用0.05～0.15mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶5～10，置于恒温摇床中震荡12～24h，110rpm；然后取出调pH至6.5～7.5，离心分离，3000rpm，10～15min；去除上清液，取沉淀物60～83℃烘干，研磨过0.25～2mm筛，然后将处理后的泥炭土按0.5～1.5ml/g的固液比用无菌水或增殖培养基浸润培养12～24h。
所述菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，购自北京微生物研究所，其对多环芳烃具有一定的降解能力，培养温度为25～30℃；种子培养基可为牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％，pH 7.2，较佳的种子培养基为葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，KCl 0.02％，pH 6.5；增殖培养基为葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0。
本发明具有如下优点1.本发明对载体材料采用碱化与浸润处理等技术，制备的固定化颗粒为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；泥炭土中含有一定量的腐殖酸，经碱处理后生成具有良好粘结性能的腐殖酸钠，在有水存在的条件下能形成亲水溶胶，具有较大微空隙和比表面积，与微生物具有较好的亲和力，提高了固定化效率；该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。
2.本发明所采用载体为泥炭土，主要组分是木质素和纤维素。泥炭具有多孔结构，部分分解的泥炭具有近乎95％的多孔结构以及值为200m2/g的特定表面积，为微生物提供优良的微环境，有利的屏蔽了外界土著菌的干扰，使固定化微生物很好的发挥对多环芳烃降解作用；高分子量多环芳烃一般以共代谢的方式被降解，泥炭土除作为微生物载体外，组分中的木质素和纤维素还可为微生物提供初级共代谢底物，诱导微生物产生降解多环芳烃所必需的酶类，从而实现对高分子量多环芳烃的共代谢降解；固定化颗粒对受芘(PYR)或苯并[a]芘(BaP)等高分子量多环芳烃污染土壤的修复中具有明显的修复效果，在投粒比2％、修复时间60d的条件下，土壤中PYR去除率为38％，最高可达63％，而对BaP的去除率为26～45％，较游离菌提高20％以上。
3.本发明所用载体材料价格便宜，成本低，来源广泛，通气性良好，无毒，不会造成土壤的二次污染，亦可增加土壤肥力。
图1为碱化泥炭土断面固定化细菌×5,000扫描电子显微镜照片；图2为碱化泥炭土断面固定化细菌×10,000扫描电子显微镜照片；图3为碱化泥炭土表面固定化细菌×7,500扫描电子显微镜照片；图4为碱化泥炭土表面固定化细菌×2,000扫描电子显微镜照片。
具体实施例方式
下面通过实例对本发明作进一步详细说明。
实施例1(1)固定化细菌液体培养在装有种子培养基(葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，KCl 0.02％，pH 6.5)的三角瓶中接种芽孢杆菌，置于28～30℃恒温摇床中培养12h。
(2)固定化载体碱化处理将自然风干泥炭土过2mm筛后，用0.1mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶10，摇床震荡24h，转速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液调pH至7.0，再离心分离，3000rpm，15min；去除上清液，将沉淀物60℃烘干后，研磨过1mm筛。
(3)固定化载体浸润培养将碱化处理的泥炭土按1ml/g比例加无菌水，高温湿热灭菌90min，备用。
(4)固定化颗粒制备取细菌菌悬液，均匀地加入无菌载体表面，接种量2％，密封后放入28℃恒温培养箱中避光培养，每天按1ml/g载体的量补加增殖培养基(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0)，3d后便制得固定化细菌颗粒。
经上述步骤制得的固定化颗粒周期短，单位体积细胞密度大，1.35×1010个/g较游离细胞密度增加了2个数量级。
(5)对受多环芳烃污染土壤修复的效果将制备好的固定化颗粒按2％投粒比，投入受多环芳烃污染的土壤中，60d后，土壤中PYR的去除率为42％；土壤中BaP的去除率为30％。在整个降解过程中，固定化颗粒的降解速度快，60d后固定化颗粒仍然具有85％以上的活性。
实施例2与实施例1不同处之一在于载体碱化处理步骤为将自然风干泥炭土过2mm筛后，用1mol/L NaOH中和泥炭样品到pH 7.0，然后用0.15mol/LNaOH调节固液比为1∶5，摇床震荡12h，转速110rpm，离心分离，3000rpm，10min，取沉淀物80℃烘干后，研磨过1mm筛。
不同处之二在于载体无碱化后的浸润处理步骤，而是直接将干燥后的泥炭土灭菌，然后接种，增殖培养3d，制得固定化颗粒。
不同处之三在于固定化颗粒无增殖培养过程。取细菌菌悬液，均匀地加入无菌载体表面，接种量2％，密封后放入28℃恒温培养箱中避光培养3d，便制得固定化细菌颗粒。
经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度较大，4.27×109个/g，较对照提高了1个数量级。
固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为38％，BaP的去除率为26％。
实施例3与实施例1不同处在于载体碱化处理时处理方法为将自然风干泥炭土过2mm筛后，用0.05mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶8，摇床震荡18h，转速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液调pH至6.5，再离心分离，3000rpm，15min；去除上清液，将沉淀物70℃烘干后，研磨过1mm筛。
经上述步骤制得的固定化细菌颗粒单位体积内细胞密度很大，3.16×1011个/g，较对照提高了3个数量级。
固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为47％，BaP的去除率为33％。
实施例4与实施例3不同之处在于载体浸润处理步骤为将碱化处理后的泥炭土按1ml/g比例加细菌培养液(牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaC l0.5％，pH 7.2)后，再高温湿热灭菌90min。结果表明经培养液浸润的载体较经无菌水或无浸润的载体对细菌吸附能力更强，细菌活力更持久，制得的固定化颗粒细胞密度可达3.12×1012个/g；固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为52％，BaP的去除率为39％。
实施例5与实施例3不同处之一在于载体碱化处理时处理方法为将自然风干泥炭土过2mm筛后，用0.1mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶10，摇床震荡12～24h，转速110rpm；然后取出用1mol/LNaOH溶液调pH至6.5，再离心分离，3000rpm，15min；去除上清液，将沉淀物60℃烘干后，研磨至载体粒径为0.25～0.45mm之间。
不同处之二在于载体浸润处理步骤为将碱化处理后的泥炭土按1ml/g比例加增殖培养液(葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH 7.0)后，静止12～24h，然后高温湿热灭菌90min。
结果表明载体粒径小于0.45mm时吸附的细菌数更多，经SEM(扫描电子显微镜)观察时(见图1～4)，可见不但载体表面吸附大量细菌，而且载体中心部位也附着许多细菌；经增殖培养液浸润的载体对细菌吸附能力更强，细菌活力更持久。
按上述步骤制得的固定化颗粒细胞密度可达7.23×1013个/g；固定化颗粒按照2％投粒比修复受多环芳烃污染的土壤，修复60d，PYR的去除率为63％，BaP的去除率为45％。
权利要求
1.一种以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法，其特征在于以经过碱化与浸润处理的泥炭土为载体材料，高压蒸汽灭菌后，接入菌悬液，然后增殖培养，便制得所需固定化颗粒。
2.按照权利要求1所述以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法，其特征在于所述碱化与浸润处理过程为将自然风干泥炭土过筛后，用0.05～0.15mol/L NaOH溶液浸泡，固液比1∶5～10，置于恒温摇床中震荡12～24h；然后取出调pH至6.5～7.5，离心分离；去除上清液，取沉淀物60～83℃烘干，研磨过0.25～2mm筛，然后将处理后的泥炭土按0.5～1.5ml/g的固液比用无菌水或增殖培养基浸润培养12～24h。
3.按照权利要求1所述以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法，其特征在于所述菌为芽孢杆菌，培养温度为25～30℃。
4.按照权利要求3所述以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法，其特征在于所述菌为芽孢杆菌的种子培养基为牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％，pH7.2，或葡萄糖1.25％，牛肉膏0.25％，NH4NO30.1％，MgSO4·7H2O0.02％，KCl 0.02％，pH6.5；增殖培养基为葡萄糖4.0％，酵母膏0.3％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，(NH4)2HPO40.2％，pH7.0。
全文摘要
本发明涉及细胞固定化技术，具体的说是一种以泥炭土为载体的固定化细菌制备方法，以经过碱化与浸润处理的泥炭土为载体材料，高温高压蒸汽灭菌后，接入菌悬液，然后增殖培养，便制得所需固定化颗粒。本发明载体材料采用碱化与浸润处理，为微生物提供了更适合的微环境，与土著菌的竞争力增强，对环境中毒物的抗性增加，可以在不良环境中仍然发挥高效降解菌对多环芳烃的降解作用；泥炭土中含有的腐殖酸，经碱处理后生成具有良好粘结性能的腐殖酸钠，在有水存在的条件下能形成亲水溶胶，具有较大微空隙和比表面积，与微生物具有较好的亲和力，提高了固定化效率；该固定化方法简单易行，该固定化方法简单易行，适宜原位土壤大规模修复。
文档编号C12N11/14GK1982446SQ20051004803
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者李培军, 苏丹, 鞠京丽, 张海荣, 许华夏 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所