专利名称：一种固定化微生物的载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及固定化微生物对于有机污染土壤的修复，具体的说是采用一种新型的载体形状来实现对多环芳烃(PAHs)的去除。
背景技术：
多环芳烃(PAHs)是指由两个或两个以上的高温获得的芳香环，以直链状、角状或串状排列组成的化合物，是有机物不全燃烧或高温裂解的副产品。因此，只要燃烧有机质，就有多环芳烃产生，燃烧温度决定了多环芳烃的混合组成。居民供暖化、内燃发动机和工业活动，如焦碳生产油的精练、铝生、非铁金属的熔炼等是多环芳烃的主要来源。多环芳烃在环境中的含量虽然微量但分布广泛，更由于一些多环芳烃中除含有致癌和致突变的成分外，还含有多种促进致癌的物质，对人体健康产生很大的威胁。
目前，对于已经被污染的生态环境，需要采用生物技术等手段进行修复。生物修复技术具有成本低、处理效果好以及对环境的二次污染小等优点，被认为最有发展前景。固定化微生物技术在生物修复技术中占有重要的地位，它是用化学或物理手段将游离微生物定位于限定的空间区域，使其保持活性并反复利用的方法，该技术具有微生物密度高、反应速度快、耐毒害能力强等优点。在难降解有机废水处理方面，固定化微生物技术研究已广泛开展，但对于有机污染土壤的修复很少见到报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固定化微生物的载体及其应用，利用固定化微生物，来降解土壤中的多环芳烃，本发明通过对固定化载体形状的改变，从而提高其对污染物的降解。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种固定化微生物的载体，其为中空十字花型。
所述中空十字花型的“十”字边长度为3-10cm，宽度为1-3cm，厚度为1-5cm；所述“中空”是在“十”字型的“十”字边上沿厚度方向上开有小孔；小孔最好为圆形，其直径可为0.5-0.7cm；所述中空十字花型的“十”字边长度最好为3-5cm，在“十”字型的“十”字边交叉处沿厚度方向上开有直径为0.5-0.7cm的中空圆孔；载体的重量配比通常为聚乙烯醇9.5～10.5％，海藻酸钠0.4～0.6％，活性炭4.5～5.5％，余量为水。
所述载体可用于固定化去除土壤中多环芳烃的微生物。
所述载体中微生物种子液的接种量为接种后液体总重量的10-20％；将微生物与载体充分混匀后，放入冰箱内-10～15℃进行冷冻22～24小时；解冻后增殖3次，每次的时间为20～24小时；微生物为土著真菌中的镰刀菌、木霉和/或黑曲霉。
将固定化微生物后的载体用于降解泥浆污染物时，泥浆中的水土质量比为3～4∶1，固定化载体的接种重量4.5～5.5％，降解过程在28～30℃下进行。
本发明具有如下的优点1.成本低。采用聚乙烯醇和活性炭为载体，材料来源广，价格低廉，对生物不具有毒性。
2.应用效果好。无论是对真菌进行单株固定还是混合固定，中空十字花型的载体对污染物的降解效果都比较好。单株球型载体对芘和苯并(a)芘的降解，在240小时降解率小于34.3％和15.4％；单株片型载体对芘和苯并(a)芘的降解率小于40.2％和21.6％。而本发明的中空十字花型的载体，单株载体对芘和苯并(a)芘的降解率240小时时大于63.8％和31.8％，降解率明显提高。
图1为本发明载体的结构示意图，其中1为长度方向，2为宽度方向，3为厚度方向，4为圆孔。
具体实施例方式
实施例1对土著真菌进行固定化包埋，将镰刀菌、木霉、黑曲霉这3株真菌的种子液分别与载体充分混匀，种子液的接种量为接种后液体总重量的20％，装入中空十字花型磨具内，在冰箱内-15℃冷冻22小时。解冻后用10％的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖备用；解冻后增殖3次，每次的时间为20小时；采用的载体配比为聚乙烯醇(PVA)为9.5％，海藻酸钠0.6％，活性炭5.5％，余量为水；制备的中空十字花型“十”字边长度为3cm，宽度为1cm，厚度为1cm，在“十”字型的“十”字边交叉处沿厚度方向上开有直径为0.5cm的中空圆孔；将固定化微生物后的载体用于降解泥浆土壤中多环芳烃污染物时的相关参数为泥浆中的水土质量比为3～4∶1，固定化载体的接种重量4.5～5.5％，降解过程在28～30℃下进行，摇床转数120～130r/min。
种子培养基的配比为2％葡萄糖，20％的土豆培养基，pH自然。
增殖培养基的配比为2％葡萄糖，0.3％酵母膏，20％的土豆培养基，pH自然。
泥浆培养基的配比为2％葡萄糖，20％的土豆培养基，水土比为3∶1，pH自然。
将5％的固定化载体接入泥浆上摇床，分别在0h、48h、96h、168h和240h测其对芘和苯并(a)芘降解率，结果见表1、表2。
表1 固定化单菌对芘的降解率
表2 固定化单菌对苯并(a)芘的降解率
实施例2基本操作与实施例1相同，不同之处在于，将镰刀菌、木霉、黑曲霉这3株真菌，两两混合及三株同时混合，装入中空十字花型磨具内，在冰箱内冷冻24小时。解冻后用10％的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖备用。
采用的载体配比为聚乙烯醇(PVA)为10.5％，海藻酸钠0.4％，活性炭4.5％，余量为水；制备的中空十字花型“十”字边长度为5cm，宽度为3cm，厚度为5cm，在“十”字型的“十”字边上沿厚度方向上开有5个直径为0.7cm的中空圆孔；将5％的固定化载体接入泥浆上摇床，分别在0时、48h、96h、168h和240h测其对芘和苯并(a)芘降解率，结果见表3、表4。
表3 固定化混合菌对芘的降解率
表4 固定化混合菌对苯并(a)芘的降解率
载体的形状至关重要，传统的载体形状多为球型和片型，不适合对真菌的包埋。真菌的特性是菌株大，菌丝长，好氧性强。而传统的球型和片型存在一定的无氧区，不利于真菌的生长。本发明所采用的中空十字花型，解决了死区的问题，同时也提高了载体与污染物的接触面积，有利于对污染物的降解。本发明采用的载体形状为中空十字花型，直径为3cm(具体形态见图1)。真菌被固定化包埋后，对芘和苯并(a)芘的降解效果比较显著。
本发明通过对真菌进行固定化包埋，使其降解污染物的能力大大提高，这为污染土壤的修复提供了一条新的途径。
实施例3对土著真菌进行固定化包埋，将镰刀菌、木霉、黑曲霉这3株真菌的种子液与载体充分混匀，种子液的接种量为接种后液体总重量的20％，装入中空十字花型磨具内，在冰箱内-10℃冷冻24小时。解冻后用10％的硫酸钠浸泡24小时，再用无菌水浸泡24小时后增殖备用；解冻后增殖3次，每次的时间为24小时；采用的载体配比为聚乙烯醇(PVA)为10％，海藻酸钠0.5％，活性炭5％，余量为水；制备的中空十字花型“十”字边长度为10cm，宽度为1cm，厚度为1cm，在“十”字型的“十”字边上沿厚度方向上开有19个直径为0.5cm的中空圆孔；增殖培养基的配比为2％葡萄糖，0.3％酵母膏，20％的土豆培养基，pH自然。
权利要求
1.一种固定化微生物的载体，其特征在于所述载体为中空十字花型。
2.按照权利要求1所述载体，其特征在于所述中空十字花型的“十”字边长度为3-10cm，宽度为1-3cm，厚度为1-5cm；所述“中空”是在“十”字型的“十”字边上沿厚度方向上开有小孔。
3.按照权利要求2所述载体，其特征在于所述小孔为圆形，其直径为0.5-0.7cm。
4.按照权利要求2所述载体，其特征在于所述中空十字花型的“十”字边长度为3-5cm，宽度为1-3cm，厚度为1-5cm；在“十”字型的“十”字边交叉处沿厚度方向上开有直径为0.5-0.7cm的中空圆孔。
5按照权利要求1所述载体，其特征在于所述载体的重量配比为聚乙烯醇9.5～10.5％，海藻酸钠0.4～0.6％，活性炭4.5～5.5％，余量为水。
6.一种权利要求1所述固定化微生物载体的应用，其特征在于所述载体用于固定化去除土壤中多环芳烃的微生物。
7.按照权利要求6所述固定化微生物载体的应用，其特征在于所述载体中微生物种子液的接种量为接种后液体总重量的10-20％；将微生物与载体充分混匀后，放入冰箱内-10～-15℃进行冷冻22～24小时；解冻后增殖3次，每次的时间为20～24小时。
8.按照权利要求6或7所述固定化微生物载体的应用，其特征在于所述微生物为镰刀菌、木霉和/或黑曲霉。
9.按照权利要求6所述固定化微生物载体的应用，其特征在于将固定化微生物后的载体用于降解泥浆污染物时，泥浆中的水土质量比为3～41，固定化载体的接种重量4.5～5.5％，降解过程在28～30℃下进行。
全文摘要
本发明涉及固定化微生物对于有机污染土壤的修复，具体的说是一种固定化微生物的载体，载体为中空十字花型；本发明成本低，应用效果好。无论是对真菌进行单株固定还是混合固定，中空十字花型的载体对污染物的降解效果都比较好。
文档编号C12N11/04GK1978638SQ200510047890
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者李培军, 王新, 鞠京丽, 巩宗强, 许华夏, 张辉 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所