专利名称：葡萄炭疽病生物芯片的制取方法
技术领域：
本发明属于生物芯片技术领域，特别是涉及用于葡萄炭疽病早期诊断的生物芯片。
背景技术：
生物芯片技术是90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有重大的基础研究价值，又具有明显的产业化前景。生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机(CCD)对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。由于常用玻片/硅片作为固相支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。
生物芯片可应用于基因表达水平的检测、基因诊断、药物筛选、个体化医疗、测序、生物信息学研究，目前生物芯片技术广泛应用于疾病诊断和治疗、药物基因组图谱、药物筛选、中药物种鉴定、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。它将为人类认识生命的起源、遗传、发育与进化、为人类疾病的诊断、治疗和防治开辟全新的途径，为生物大分子的全新设计和药物开发中先导化合物的快速筛选和药物基因组学研究提供技术支撑平台。
随着基因芯片技术的发展，基因芯片在人类医学传染性疾病和遗传病诊断上有广泛应用。疾病基因芯片诊断原理是从正常人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以得出病变的DNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项现代化诊断新技术。例如Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。又如，Heller等构建了96个基因的cDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。诊断芯片因为具有对各类致病基因片段检测效率高、早期诊断且待测样品用量较少、极高的灵敏度、特异性、可靠性以及自动化程度高，利于大规模推广应用等特点，备受关注。在疾病诊断方面，美国Affymetrix公司已利用基因芯片进行爱滋病(HIV)的研究工作，并有商业化的GeneChip HIV PRT诊断芯片上市，用于爱滋病的早期诊断。
然而，对葡萄炭疽病基因芯片研究尚未见到。葡萄炭疽病是葡萄生产中危害最为严重的病害之一，每年葡萄炭疽病造成的产量损失极大。由于不能做好前期病害诊断，导致后期大量化学农药使用，果品污染严重。研制葡萄炭疽病生物芯片对该病早期诊断与防治，减少化学农药污染，生产出葡萄无公害产品非常有意义。
发明内容
本发明就是针对上述问题，提供一种可准确地诊断早期葡萄炭疽病的生物芯片。
本发明采用如下技术方案首先对葡萄炭疽病菌进行基因序列测序，然后根据测序结果，利用引物设计软件(Primer Premeier)，测得葡萄炭疽病菌探针5’-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’，再经过基片处理、芯片点制，封闭即成。
本发明的主要优点有检测样品为葡萄炭疽病菌基因片段，可提高检测效率；能早期诊断病害，且待测样品用量较少；具有极高的灵敏度、特异性和可靠性；自动化程度高，利于推广应用，对该病防治有直接的指导作用，应用前景广阔。
图1是生物芯片的制备与样品检测流程；图2是本发明实施生物芯片微阵列设计图；图3是本发明实施生物芯片检测葡萄炭疽病菌样品杂交扫描结果；图4是本发明实施葡萄炭疽病菌目标基因检测点的杂交信号曲线。
具体实施例方式
1、供试材料菌株葡萄炭疽病菌，PDA培养基培养。
试剂消化液(0.01M Tris·Cl，0.005M EDTA，0.5％SDS，50μg/ml蛋白酶K)，酚，氯仿，异戊醇，蛋白酶K，琼脂糖，PCR试剂盒(Promega公司)手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(SIGMA)，dNTP(上海生工生物工程公司)，点样液，洗脱液，杂交液。
仪器设备PCR扩增仪(Biometra Personal PCR system，USA)，稳压稳流电泳仪(BIO-RAD MiniII，USA)，低温离心机(SIGMA，USA)，生物芯片点样仪(MG II600，BioRobotics Ltd，England)、激光扫描仪(Gene TACTMLS IV，GenomicSolutions Inc.USA)，数显电热恒温干燥箱(202-0，上海阳光实验仪器有限公司)2、基因组DNA提取与定量刮取培养基上的葡萄炭疽病菌菌落，置于2ml EP管中，加入消化液1ml，振荡混合，37℃水浴30min。加入等体积酚—氯仿混合液(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，混匀，16000r/min离心5min，弃有机相，取上清。重复酚提取步骤，至两相间无蛋白层。加入等体积氯仿，混匀，16000r/min离心5min，弃有机相，取上清。加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，颠倒摇动数次，于-20℃静置1小时。16000r/min离心10min，70％乙醇洗涤，常温干燥。加适量无菌去离子水溶解DNA，4℃冰箱保存备用。采用紫外分光光度法定量测定基因组DNA含量。在波长260nm及280nm处测定DNA样品的吸光值，初步估计DNA样品的纯度。当OD260/OD280≥1.8表示纯度比较高。否则，表示纯度不够，必须重新抽提。根据1 OD260相当于50μg/ml dsDNA，估计各样品浓度，加适量无菌菌去离子水调整各样品浓度至约1μg/μl。
3、聚合酶链反应(PCR)扩增4、基因芯片的制备与样品检测基因芯片的制备与样品检测按流程进行。
5、基片处理和制备取20×20盖玻片，于铬酸溶液中浸泡12小时以上，蒸馏水洗净，1N NaOH浸泡1小时，丙酮化3min。浸入手臂分子溶液(2％氨基丙基三乙氧基硅烷，以5％丙酮溶解)10min，丙酮清洗，烘烤固定，5％戊二醛中浸泡过夜。
6、探针设计葡萄炭疽病菌28S rRNA序列为1ACGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAGGAGTCGTCTTCGTATGCGAGTGT51 TCGGGTGTCAAACCCCTACGCGTAATGAAAGTGAACGCAGGTCAGAGCTT101 C---GGCGCATCATCGACCGATCCTGATGTTCTCGGATGGATTTGAGTAA151 GAGCATACGGGGCCGGACCCGAAAGAAGGTGAACTATGCCTGTGTAGGGT201 GAAGCCAGAGGAAACTCTGGTGGAGGC227
根据葡萄炭疽病菌样品的测序结果设计炭疽探针。同时以无标记引物的互补链作为阳性对照，以同等浓度探针缓冲液作为空白对照，以同等浓度的无关探针(指与靶序列无同源性或同源性很低的寡核苷酸序列)作为阴性对照。序列如下炭疽探针 5’-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’ (21bases)阳性对照 5’-TGCTGGGCAGAACTTTGTGC-3’ (20bases)阴性对照 5’-ATGCTTACCGAATCCTTAGC-3’ (20bases)探针及引物合成均在英俊生物技术有限公司进行。
7、芯片点制将冷冻干燥的探针用0.2M碳酸盐缓冲液稀释至100μM。4℃保存备用。
将制备好的寡核苷酸探针分别加入384孔板，使用生物芯片点样仪，制成预先设计好的微阵列。点样中注意保持湿度70-80％，点样后37℃水化过夜，80℃烤于固定，备用。
8、封闭与核酸杂交取制备好的生物芯片，用前以0.1％SDS洗去多余的未共价结合的探针。浸入5％二乙胺(0.01MPB，PH9)，室温封闭30min，充分洗净吹干。PCR产物加杂交液(10μl鲑鱼精DNA溶于1ml 10×Denhart液)按1∶1稀释混匀，取15μl覆盖于各微阵列，加放经疏水处理的盖片。置入杂交舱中55℃保温30min。
9、洗涤与检测取出杂交芯片，除去盖片。用预热至60℃的洗液(浓度分别为1×SSC/0.1％SDS，0.5×SSC/0.1％SDS，0.1×SSC)进行梯度洗涤，各振荡3min，ddH2O洗净吹干。激光扫描仪扫描检测杂交结果，用信噪比进行结果判断。
10、不同菌种检测分析采集葡萄炭疽病菌样品，经过基因组DNA提取、PCR扩增(荧光标记)，PCR产物加杂交液(10μl鲑鱼精DNA溶于1ml10×Denhart液)按1∶1稀释混匀，取15μl覆盖于各微阵列，加放经疏水处理的盖片。置入杂交舱中55℃保温30min。洗涤吹干，分别在激光扫描仪扫描检测杂交结果，观察样品的敏感性，并用信噪比对结果进行判断。
权利要求
1.葡萄炭疽病生物芯片的制取方法，其特征在于对葡萄炭疽病菌进行基因序列测序，然后根据测序结果，利用引物设计软件，测得葡萄炭疽病菌探针5′-ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA-3’，再经过基片处理、芯片点制，封闭即成。
全文摘要
葡萄炭疽病生物芯片的制取方法属于生物芯片技术领域，特别是涉及用于葡萄炭疽病早期诊断的生物芯片。本发明就是提供一种可准确地诊断早期葡萄炭疽病的生物芯片。本发明采用如下技术方案首先对葡萄炭疽病菌进行基因序列测序，然后根据测序结果，利用引物设计软件(Primer Premeier)，测得葡萄炭疽病菌探针5′－ACGGGGCCGGACCCGAAAGAA－3'，再经过基片处理、芯片点制，封闭即成。
文档编号C12Q1/68GK1978663SQ20051004787
公开日2007年6月13日 申请日期2005年11月30日 优先权日2005年11月30日
发明者赵奎华, 刘长远, 赵雨杰, 马佳明, 傅俊范, 苗则彦, 梁春浩 申请人:辽宁省农业科学院植物保护研究所