专利名称：利用巢式pcr进行水牛胚胎性别鉴定的方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，涉及利用PCR(聚合酶链式反应)方法扩增水牛SRY基因进行胚胎性别鉴定的方法。
背景技术：
在胚胎生物技术领域中，性别控制问题长期以来一直是科学家致力研究的一个重大理论课题，目前，能够实现性别控制的手段主要有两种一是X精子和Y精子的分离；二是早期胚胎的性别鉴定。目前精子分离效率虽然较高，但存在成本高，不适宜实际生产中推广。而早期胚胎性别鉴定技术有几十年的发展历史，特别在PCR(聚合酶链式反应)技术发明以后，早期胚胎性别鉴定逐渐发展成熟，成为目前最有使用价值的一项性别控制技术。
胚胎性别鉴定方法经历了这样几个阶段染色体核型分析法、X连接酶活性分析法、免疫学方法和现在的分子生物学方法，在PCR技术应用之后，该项技术进入是实际生产领域。目前常用来鉴定牛胚胎性别的检测基因有Y-染色体多重复序列、SRY基因核心序列、ZFX/ZFY基因序列等。在国外，Herr CM等(1990)首先成功用了PCR技术鉴定牛羊胚胎性别(HerrCM，Theriogenology，1991，35(1)45-54)，获得了91.7％(11/12)的准确率；Peura等(1991)采取了利用PCR扩增3对引物进行牛胚胎性别鉴定，其中一对是牛DNA特异性引物，该引物扩增雌雄均产生同样条带，用于检测样品是否丢失，另两对引物为牛Y染色体特异性引物，它们扩增的为雄性特异产物。在国内，朱裕鼎等(1992)应用两步PCR法，使性别鉴定准确率达到100％(高技术通讯，1992，(12)12-14)；曾溢滔等通过对牛Y-染色体性别决定区域(SRY)基因核心序列测序的基础上，设计一对特异于牛的SRY引物，通过检测SRY基因的存在与否鉴定了奶牛胚胎的性别获得成功，成功率为100％[中国科学(B)，1993，23(4)371-375]，徐亚欧等(1993)依据ZFX/ZFY设计了一对引物，利用PCR扩增牛血液DNA鉴定性别，将扩增片断用Pst I酶切，公牛的ZFY基因PCR扩增片断有两个酶切位点，而ZFX没有，所以再电泳前者出现三个片断(486bp，356bp，112bp)。
由于Y-染色体多重复序列常常在X染色体上存在有同源序列，因而鉴定结果有一定的不确定性。扩增ZFX/ZFY基因也有不足之处，因为ZFX/ZFY基因需要进一步做酶切鉴定，费时费力，在生产中也不能广泛应用；扩增SRY核心序列法，因SRY为雄性特异，故具有较高的准确率，但是SRY是单拷贝基因，使用的模板为几个卵裂球，常规PCR一次扩增的灵敏度有限，有时会造成由于扩增产物的量太少而影响鉴定的结果。
如利用巢式PCR技术，在对水牛SRY基因测序的基础上设计两对引物，在使用外引物扩增20个循环后，取出1/25产物使用内引物进行第二次PCR扩增，可达到很高的鉴定效率，理论上可用于单卵裂球的性别鉴定。
目前报道已有其他牛属动物经过胚胎性别鉴定后产犊。但用巢式PCR扩增水牛SRY基因进行胚胎性别鉴定，目前国内外还未见有报道。
水牛是我国的主要牛种之一，水牛奶具有很高的营养价值，但就目前我国奶水牛的现状看，其数量和奶产量，还远远满足不了市场的需求。而通过早期胚胎性别鉴定移植雌性胚胎，能迅速增加奶水牛头数，从而提高奶水牛的选择强度，这对加快奶水牛业的发展意义非常重大。
本发明的目的是利用胚胎性别鉴定技术与体外受精技术相结合这一动物繁殖新技术来生产预知性别的水牛胚胎，以达到控制良种奶水牛后代的性别。同时也为良种奶水牛胚胎工厂化、性别化生产提供技术支撑。生产水牛可控性别体外胚胎这一方法的最大特点是高效、省时、省力及节省费用，因此该方法是目前加快高产奶水牛扩繁速度最为有效的技术手段之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异于水牛SRY序列的引物。利用该种PCR引物在进行水牛SRY基因检测时，不但灵敏度有可靠的保证，而且通过引入GAPDH内参基因，使验证胚胎样品是否丢失成为可能。另外本发明采用的巢式PCR引物是在对水牛SRY基因测序的基础上设计的，特异性强，适合少量样品扩增，便于在生产中使用。
利用胚胎性别鉴定技术结合体外受精技术，大量生产预知性别的水牛胚胎，以满足市场对可控性别水牛胚胎的需求，从而达到加速良种奶水牛的繁育速度，促进水牛奶业的发展。
具体内容如下(1)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，使用显微操作仪或手工切割获取少量胚胎样品，取样后的胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存。
(2)胚胎样品在无钙镁的PBS(磷酸缓冲液)中洗涤三次，转入PCR管中，加入细胞裂解液(Lysis Solution)，于室温放置5min，98℃灭活蛋白酶K后直接作为模板进行PCR反应。
(3)在新的PCR管中加入24μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，去离子水)和上下游外引物、上下游内参引物(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下20循环95℃20s；62℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应。
(4)取出2μL的PCR产物加入新PCR管中，再加入23μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq DNA聚合酶，去离子水)、上下游内引物和上下游内参引物(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下30循环95℃20s；61℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应。
(5)将扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30分钟)，将凝胶置于EB(溴化己锭)中染色20min后与紫外灯下观察，凡在460bp和160bp出都出现条带的样品为雄性胚胎所有，只有460bp出现条带的为雌性胚胎，均未出现带的为丢失样品。与目前的性别鉴定技术相比，本发明的优点在于(1)利用该巢式PCR引物和GAPDH内参引物进行多重PCR鉴定，可达到95％以上的鉴定准确率，并通过配置预混的PCR Mix液来简化操作，有效的减少污染率，大大提高胚胎性别鉴定中的灵敏度和准确性，通过这一技术途径可使性控胚胎生产工厂化。
(2)该方法与其他多种现代胚胎生产技术相结合进行奶水牛的繁育，可提高奶水牛的繁育效率，迅速增加良种奶水牛数量，提高奶水牛群质量，加速品种选育工作。
因此，使用性别鉴定技术进行繁育奶牛的效率将比无性别控制的提高一倍，从而可以节省近一半的时间，精力和费用。
图1为SRY基因巢式引物和GAPDH内参引物对已知性别水牛基因组DNA进行扩增的结果。
♀为母牛；♂为公牛；B为空白对照；M250bp梯度的分子量标准；130bp为公水牛特有的SRY基因的PCR扩增产物的电泳条带；460bp处为公、母水牛共有基因引物-GAPDH内参引物对水牛基因组DNA扩增的结果。
图2为SRY基因巢式引物与GAPDH内参引物对水牛胚胎性别鉴定的结果。
1，2，4，7，10泳道同时拥有130bp的公水牛特有基因-SRY基因扩增片段和460bp的公、母水牛共有基因-GAPDH基因的扩增片段的电泳带，所以性别鉴定为雄性胚胎；3，5，6，8泳道只有GAPDH基因扩增片段的电泳带，所以性别鉴定为雌性胚胎；11为空白对照；12为阳性对照；M250bp梯度的分子量标准；130bp为公水牛特有的SRY基因的PCR扩增产物的电泳条带；460bp为公、母水牛共有基因引物-GAPDH引物的PCR扩增产物的电泳条带。
具体实施例方式
实施例1通过对已知性别的水牛基因组DNA进行性别鉴定，检测引物的特异性。
(1)取新鲜水牛血液，用酚仿抽提法提取DNA；(2)新的EP管中加入2.5μL PCR缓冲液，0.5μL dNTP(50μM)，上下游外引物和上下游内参引物GAPDH(各50pM)，200ng基因组DNA、2U TaqDNA聚合酶，加入去离子水至总反应体积为25μL。在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下20循环95℃20s；62℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(3)取出0.5μL的上述PCR产物加入新PCR管中，再加入2.5μL PCR缓冲液，0.5μL dNTP(50μM)，上下游内引物和上下游内参引物GAPDH(各50pM)，2U Taq DNA聚合酶，加入去离子水至总反应体积为25μL。在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下30循环95℃20s；61℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(4)将扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，将凝胶置于EB(溴化己锭)中染色20min后与紫外灯下观察，2、4、5、6、8、9号公水牛基因组DNA样品在460bp和130bp均出现条带，1、3、7号母水牛基因组DNA样本只有460bp出现条带，鉴定结果完全符合(见附图1)。
实施例2水牛胚胎性别鉴定(1)使用显微操作仪或微针从囊胚切割胚胎一小部分获取少量胚胎样品。取样后的胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存。
(2)以上获取的胚胎样品在无钙镁的PBS(磷酸缓冲液)中洗涤三次，分别装入PCR管中，加入细胞裂解液(Lysis Solution)10μL，于室温放置5min后，98℃保温10min以灭活蛋白酶K，该处理后样品直接作为模板进行PCR反应。
(3)新的PCR管中加入23μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)，上下游外引物和上下游内参引物(各50pM)，总反应体积为25μL。在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下20循环95℃20s；62℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应。
(4)取出1μL的PCR产物加入新管中，再加入22μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)、上下游内引物和上下游内参引物(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃2min，然后进行以下30循环95℃20s；61℃30s；72℃30s，最后72℃延伸5min，停止反应。
(5)将扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30分钟)，将凝胶置于EB(溴化己锭)中染色20min后于紫外灯下观察，凡在460bp和130bp出都出现条带的样品为雄性胚胎所有，只有460bp出现条带的为雌性胚胎，均未出现带的为丢失样品(见附图2)。
权利要求
1.利用巢式PCR(聚合酶链式反应)进行水牛胚胎性别鉴定，其特征是下列步骤组成(1)在受精后第6、第7和第8天时回收囊胚，使用显微操作仪或手工切割获取少量胚胎样品，取样后的胚胎进行冷冻保存处理，然后置于液氮罐中贮存；(2)胚胎样品在无钙镁的PBS(磷酸缓冲液)中洗涤三次，转入PCR管中，加入细胞裂解液(Lysis Solution)，于室温放置5分钟，98℃灭活蛋白酶K后直接作为模板进行PCR反应；(3)在新的EP管中加入23μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)和上下游外引物、上下游内参引物(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃ 2min，然后进行以下20循环95℃ 20s；62℃ 30s；72℃ 30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(4)取出1μL的PCR产物加入新管中，再加入22μL PCR Mix液(包括PCR缓冲液，dNTP，Taq酶，去离子水)、上下游内引物和上下游内参引物GAPDH(各50pM)，在PCR仪中预解链94℃ 2min，然后进行以下30循环95℃ 20s；61℃ 30s；72℃ 30s，最后72℃延伸5min，停止反应；(5)将扩增产物于2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，将凝胶置于EB(溴化己锭)中染色20分钟后于紫外灯下观察，凡在460bp和130bp出都出现条带的样品为雄性胚胎所有，只有460bp出现条带的为雌性胚胎，均未出现带的为丢失样品。1、根据权利要求1所述的胚胎性别鉴定技术，其特征在于步骤(3)中的外引物为上游外引物5’AGG ACC ACA TCA AGC GAC CCA T 3’下游内引物5’CGG GTA TTT GTC TCT GTG TAT GG 3’2、根据权利要求1所述的利用巢式PCR进行水牛胚胎性别鉴定，其特征是步骤(4)中的内引物及内参引物为上游内引物5’AGG CAG CTG GGC TAT GAG TGG AA 3’下游内引物5’CGG GTA TTT GTC TCT GTG TAT GG 3’上游内参引物5’GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG 3’下游内参引物5’GGT CAT GAG TCC TTC CAC GAT 3’
全文摘要
本发明是一种利用PCR方法鉴定水牛胚胎性别的方法，根据水牛SRY基因测序结果设计三对引物，分别为SRY－HMG box特异性巢式引物和内参基因GAPDH引物，其中GAPDH引物用以扩增雌雄水牛共有的GAPDH基因(甘油醛脱氢酶基因)，以检测胚胎样品是否丢失；SRY－HMG box引物用以扩增雄性水牛特有的SRY基因保守段，用以鉴定胚胎性别。本发明在对水牛SRY全序列测序的基础上，设计的特异性引物能够稳定的扩增出相应基因序列，体系稳定，可大大提高检测的灵敏度和可行性。
文档编号C12Q1/68GK1990879SQ20051004830
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月27日 优先权日2005年12月27日
发明者张明, 卢克焕, 付强 申请人:广西大学