一种表达肝素酶的方法及其专用表达载体的制作方法

专利名称：一种表达肝素酶的方法及其专用表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达肝素酶的方法及其专用表达载体。
背景技术：
肝素酶(heparinase)是一类作用于肝素的多糖裂解酶，在许多种微生物中发现，包括棒杆菌Corynebacterium sp.(高宁国等，肝素酶产生菌的筛选及发酵条件，微生物学报1999 Vol.3964-67)、鞘胺醇杆菌Sphingobacterium sp.(高宁国等，鞘胺醇杆菌肝素酶的产生，微生物学报2003 Vol.43813-816)、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis(王忠彦等，肝素酶产生菌的筛选及其粗酶性质的研究，四川大学学报(自然科学版)2002 Vol.39777-779)、环状芽孢杆菌Bacillus circulans(Yasutaka Tahara et al.，Purification andcharacterization of heparinase that degrades both heparin and heparinsulfate from Bacillus circulans BioSci.Biotechnol.Biochem.2002Vol.661181-1184)、解肝素拟杆菌Prevotella heparinolytica(KazuyukiSugahara et al.，Characterization of heparinase from an oral bacteriumPrevotella heparinolytica J.Biochem.1998 Vol.123283-288)、粪便拟杆菌Bacteroides stercoris HJ-15(Dong Hyuu Kim et al.，Purification andcharacterization of a novel heparinase from Bacteroides stercoris HJ-15J.Biochem.2000 Vol.128323-328)和肝素黄杆菌Flavabacterium heparinum(Sasiekharan，R.1991 Ph.D.Thesis，Havard University)。但是来自肝素黄杆菌的肝素酶是商业化的唯一来源。来自肝素黄杆菌的肝素酶主要有三种，分别命名为肝素酶I(EC 4.2.2.7)、II(NO EC code)和III(EC 4.2.2.8)(RobertJ.Linhardt et al.，Purification and characterization of heparin lyasesfrom Flavobacterium heparinum JBC 1992 Vol.26724347-24355)。
其中肝素黄杆菌的肝素酶I(hepA)是目前为止研究最充分的肝素酶之一，其在低分子肝素的生产和体外血液循环中肝素的去除上的应用已有报道，具有巨大的市场开发价值。由于肝素黄杆菌产肝素酶I的表达量低并且纯化操作繁琐且费用较高，因而重组菌生产肝素酶I受到极大的关注。
在肝素酶I的生产工艺优化中，肝素酶I酶活的快速检测对于过程的优化十分重要。目前，肝素酶I酶活的检测方法主要有两种，分别为天青A法(Victor CY，Robert J L，et al.Purification and characterization of heparinase fromFlavobacterium heparinum.J.Biol.Chem.1985，2601849-1857)和232nm的光吸收法(Ram S，Bulmer M，et al.Cloning and expression of heparinase Igene from Flavobacterium heparinum.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1993，903660-3664)。在这两种方法中天青A的测量方法适合粗酶液，并且受到其他能够降解肝素的多糖裂解酶的影响，使得测量结果偏大。而232nm光吸收法适合于纯化的酶液的测量。由于产生的不饱和糖醛酸的种类比较多，ε＝3800M-1是平均值，因此酶活的测量也不十分精确。从以上所述的两种检测酶活存在的问题可以看出，为了研究开发高效的肝素酶I生产工艺，建立能够快速准确定量酶活的高效表达体系和方法具有重要意义。
GFP，自从1994年Chalfie等(Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，Ward WW，Prasher DC Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science 1994，263802-805)首次在大肠杆菌细胞中表达出来后，由于该荧光蛋白稳定、对细胞无毒性、荧光检测简单，而且产荧光不需要底物等特点，已成为在生理学和生物技术的研究和开发中应用最广泛的报告蛋白之一。但是，目前为止GFP在生物学和生物技术中的应用主要侧重于各种定性解析，将其应用于蛋白质生物生产过程的定量监测及过程优化是一个新的领域。Poppenborg等(Poppenborg L，Friehs K，Flaschel E The green fluorescent protein is aversatile reporter for bioprocess monitoring.J.Biotechnol.1997，5879-88)首次证明了将GFP融合到一亲和靶物上可以实现诸如培养、色谱分离等过程的快速监测。因此，GFP是用于定量快速监测细胞培养、发酵过程优化以及追踪固定化酶使用过程特性的具有极大潜力的工具。

发明内容
本发明的目的是提供一种肝素酶表达载体。
本发明所提供的肝素酶表达载体，是在多克隆位点插入有由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的原核细胞表达载体。
所述在多克隆位点插入有由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的原核细胞表达载体能在大肠杆菌中表达外源基因。
所述大肠杆菌可为大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌JM109或大肠杆菌TB1等。
所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白是在肝素酶的氨基酸残基序列的氨基端或羧基端紧密连接有至少具有序列表中序列1的第1-238位氨基酸残基序列的绿色荧光蛋白片段。
所述肝素酶为肝素酶I，它的氨基酸残基序列在GenBank的检索编号为A47479。
所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有绿色荧光蛋白和肝素酶活性的蛋白质。
序列表中的序列2由626个氨基酸残基组成，自氨基端第1位至第238位氨基酸残基为绿色荧光蛋白，自氨基端第264位至第626位氨基酸残基为肝素酶I。
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
序列表中的序列3由1881个碱基组成，其编码序列为自5′端第1至1881位脱氧核苷酸。
所述肝素酶表达载体优选为pGFP-hepA，pGFP-hepA是将由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因插入pMAL-c2x的多克隆位点中的NdeI和HindIII识别位点间得到的重组表达载体。
本发明的第二个目的是提供一种表达肝素酶的方法。
本发明所提供的表达肝素酶的方法，是将上述的肝素酶表达载体导入大肠杆菌中，将筛选得到表达肝素酶的菌株作为工程菌，培养所述工程菌，诱导表达肝素酶。
该方法中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌JM109或大肠杆菌TB1；所述肝素酶表达载体优选为pGFP-hepA；所述诱导表达条件为在含有0.3-1mM IPTG的培养基中5-25℃诱导培养5-15小时。
本发明利用基因工程技术成功地构建了GFP-肝素酶I融合蛋白的高效可溶表达质粒pGFP-hepA，含该质粒的重组大肠杆菌能表达出可溶性的GFP与肝素酶I融合蛋白。通过荧光强度、细胞浓度和酶活的测定建立了利用GFP快速检测大肠杆菌浓度和肝素酶I酶活的方法，为肝素酶I的规模化生产优化提供新的手段。
本发明提供了一种能够可溶表达和正确折叠，防止包涵体形成，并能快速定量菌体浓度和肝素酶酶活的融合表达载体(pGFP-hepA)。本发明表达肝素酶的方法实现了高效可溶表达由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白(GFP-hepA)，肝素酶I的表达量高达350IU/L培养基，该表达方法并能利用荧光测量对工程菌浓度及肝素酶I酶活进行快速定量追踪，有利于肝素酶I生产过程的优化和控制，有利于肝素酶的保存和应用过程的快速评价，有利于解析大分子肝素的结构和降解机理。本发明的肝素酶表达载体和表达方法具有广阔的工业应用前景和实际应用价值。


图1为表达载体pMal-hepA的构建过程示意2为从肝素黄杆菌中PCR扩增得到的肝素酶I基因电泳图谱图3为表达载体pGFP-hepA的构建过程示意4为BL21(DE3)/pGFP-hepA诱导表达的GFP-hepA荧光显微镜照片图5为BL21(DE3)/pGFP-hepA不同条件诱导表达的蛋白质电泳图谱图6为细胞破碎后上清液的荧光强度、总酶活和OD600随时间的变化曲线图7为相对荧光强度与OD600的关系图8为相对荧光强度与肝素酶I酶活的关系具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、表达载体pGFP-hepA的构建1、含有肝素酶I编码基因的表达载体pMal-hepA的构建表达载体pMal-hepA的构建过程如图1所示，具体过程如下从肝素黄杆菌Flavabacterium heparinum(购买自IAM)的染色体组DNA中扩增肝素酶I基因，所用的上下游引物分别为5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’(带下划线的碱基为BamHI的酶切位点)，5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’(带下划线的碱基为PstI酶切位点)，分别引入BamHI和PstI酶切位点，50μL扩增反应体系为50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液(北京天为生物技术有限公司)，200μmol/L每种dNTP，1单位高保Pfu酶；扩增程序为95摄氏度变性5分钟，50-60摄氏度引物退火45秒，72摄氏度引物延伸90秒，30个循环后，72摄氏度延伸5分钟结束反应。该PCR结果如图2所示，表明扩增得到1.1kb的肝素酶I基因片段。图2中，1-6分别为引物退火温度为50、51、53、55、58或59℃扩增结果，7为分子量marker 15kb，箭头所指处为1.1kb目标片断。
将pMal-p2x和pMal-c2x载体(购自NEB公司))和PCR产物分别用BamHI和PstI双酶切，用T4DNA连接酶连接，转化JM109，以5’GCCTGGATCCCAGCAAAAAAAATCCGGTAAC 3’和5’GCTTCTGCAGTCTGGCAGTTTCGCTGTAC 3’为引物，通过菌落PCR筛选转化子，提取可得到1.1kb PCR产物的转化子中的质粒通过BamHI和PstI双酶切验证。将通过BamHI和PstI双酶切得到1.1kb片段的质粒进行测序，将含有具有序列表中序列4的核苷酸序列的质粒命名为pMal-hepA。
2、由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的表达载体pGFP-hepA的构建表达载体pGFP-hepA的构建过程如图3所示，具体方法如下以质粒pSG1729(Bacillus Genetic Stock Center)为模板，用Pup5’AAAGGAGATTCGACATATGGGTACCCTGCATATGAGTAAAGGA(NdeI)3’(划线部分碱基为NdeI的识别位点)和Pdo5’CATCGGAGCTCGAGGTACCTTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTG(SacI)3’(划线部分碱基为SacI的识别位点)为引物PCR扩增GFP基因(gfp)，并插入到pMAL-c2x(购自NEB公司)的酶识别位点NdeI和SacI之间，构建得到了重组载体pGFP-c2x。然后利用EcoRI和HindIII酶切pMal-hepA，回收约1100bp的hepA片段，与经EcoRI和HindIII酶切pGFP-c2x得到的载体大片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，蓝白斑筛选阳性克隆。重组质粒经酶切鉴定并通过序列测定确认(上海生工)，将含有具有序列表中序列3的由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的重组载体命名为pGFP-hepA。
实施例2、表达肝素酶I
1、诱导表达提取实施例1中含有pGFP-hepA的大肠杆菌DH5α中的质粒，按照常规方法转化大肠杆菌BL21(DE3)，经过氨苄青霉素筛选和利用引物Pup和Pdo进行菌落PCR鉴定，得到含有pGFP-hepA的大肠杆菌BL21(DE3)，即BL21(DE3)/pGFP-hepA作为表达GFP-hepA的工程菌。
将BL21(DE3)/pGFP-hepA在LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)37℃培养2小时，加入1mM IPTG分别在32℃、20℃和15℃进行诱导培养。工程菌BL21(DE3)/pGFP-hepA诱导培养8小时，菌体表达GFP-hepA融合蛋白，如图4所示。分别取诱导12h后菌液40ml，10000rpm离心10min，用20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)洗涤两次，重悬在4ml 20mmol/L Tris-HCl(pH 7.4)中进行超声破碎(输出功率为300W，每次超声3秒和间歇3秒的处理99次)，分别取上清液50μl和细胞破碎沉淀做全细胞SDS-PAGE电泳。结果如图5所示，表明不同诱导温度对GFP-hepA活性的影响比较明显，在32℃诱导，GFP-hepA以无活性包涵体的形式存在较多，而15℃诱导，可溶性GFP-hepA的量则明显增加。图5中，箭头示GFP-hepA条带，70kDa；32度诱导不溶为32℃诱导温度下的细胞破碎后沉淀；32度诱导可溶为32℃诱导温度下的细胞破碎后上清液；20度诱导不溶为20℃诱导温度下的细胞破碎后沉淀；20度诱导可溶为20℃诱导温度下的细胞破碎后上清液；15度诱导不溶为15℃诱导温度下的细胞破碎后沉淀；15度诱导可溶为15℃诱导温度下的细胞破碎后上清液。
2、酶活检测分析按照以下方法测定肝素酶I的酶活将细胞离心分离、用Tris-HCl(pH7.0)洗涤两次后，重悬在5ml Tris-HCl(pH7.0)中，用步骤1的超声条件进行细胞破碎。将破碎液离心后，测上清液中的肝素酶活。酶活的分析采用232nm光吸收法，一个国际单位(1IU)的酶活的定义为30℃，pH 7.4条件下，每分钟产生1μmol 4，5不饱和糖醛酸所需的蛋白量。
结果表明BL21(DE3)/pGFP-hepA在LB培养基(含100μg/ml Amp)37℃培养2小时，加入1mM IPTG分别在32℃、20℃和15℃进行诱导培养12小时的细胞破碎上清液肝素酶I的酶活分别为0.0425IU、0.105IU、0.175IU，换算得到的肝素酶I的表达量分别为85IU/L、210IU/L、350IU/L培养基。
实施例3、荧光定量追踪菌体浓度和酶活用含100μg/ml氨苄青霉素的LB(NaCl 10g/L，胰化蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，pH7.0)培养基对BL21(DE3)/pGFP-hepA进行培养，在37℃培养大约两小时(至OD600为0.25)后，加入0.3mM IPTG，并将培养温度改为15℃进行诱导培养。每隔1小时，取1ml菌液分别测其细胞浓度(OD600)、肝素酶I的酶活和荧光强度(荧光分光光度计HITACHI F-2500)，一直测定至诱导培养14小时。
按照实施例2中步骤2的方法测定肝素酶I的酶活，结果表明肝素酶I的酶活随着诱导时间的延长，表达量逐渐增加。荧光强度的测定是按照实施例2中步骤2的方法将该1ml菌液中的细胞离心分离、用Tris缓冲液(pH7.0)洗涤两次后，重悬在5ml Tris缓冲液(pH7.0)中，用实施例2中步骤1的超声条件进行细胞破碎。将破碎液离心后，测上清液中的荧光强度，将诱导0小时的荧光强度定为0，得出其它诱导时间的相对荧光强度。培养过程的细胞浓度(OD600)、肝素酶I的酶活(IU/L培养基，)和荧光强度(RFU)的变化如图6所示。结果说明，GFP蛋白可以提高肝素酶I在大肠杆菌中的可溶性，且随着诱导时间的增加，荧光量增加，但由于存在细胞的散射，需要稀释或者破碎细胞以准确测量荧光量(如图7、图8所示)。
为进一步研究利用GFP蛋白实现菌体浓度和酶活的快速在线检测，研究了OD600与荧光强度以及酶活与荧光强度的关系。上述15℃诱导培养14小时的OD600与荧光强度的关系如图7所示，表明细菌浓度和荧光之间存在良好的线性关系，在较低的OD600范围内，稀释或者不稀释对拟合的结果影响不大，但稀释后的相关性及斜率明显增加，说明细胞对荧光散射的影响在高细胞浓度条件下必须考虑。实验结果表明可以利用荧光强度实现培养过程中细菌浓度的快速定量。
同时研究了荧光量与酶活之间的关系，上述15℃诱导培养14小时的肝素酶I的酶活与荧光强度的关系如图8所示，表明荧光量与酶活之间也存在良好的线性关系。
上述结果说明在发酵培养过程中可以通过检测荧光强度以快速获得菌体浓度和肝素酶I的酶活的变化，从而实现高效生产肝素酶I的培养过程优化和控制。
序列表<160>4<210>1<211>238<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1 5 1015Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Val202530Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser354045Val Ser Gly Glu Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu505560Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu65707580Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Glu Leu Pro Val Pro859095Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Glu100 105 110Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu115 120 125Gln Cys Phe Glu Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe130 135 140Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Val Met Ala Asp Lys Pro Lys Asn Gly145 150 155 160Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Ile Met Ala Asp Lys165 170 175Pro Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Ile180 185 190Met Ala Asp Lys Pro Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg195 200 205
His Asn Ile Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val210 215 220Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys225 230 235<210>2<211>626<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val1 5 1015Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser Val Ser Gly Val202530Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly Gln Lys Phe Ser354045Val Ser Gly Glu Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu505560Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu65707580Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Glu Leu Pro Val Pro859095Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Glu100 105 110Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ala Tyr Gly Leu115 120 125Gln Cys Phe Glu Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe130 135 140Ala Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Val Met Ala Asp Lys Pro Lys Asn Gly145 150 155 160Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Ile Met Ala Asp Lys165 170 175
Pro Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Ile180 185 190Met Ala Asp Lys Pro Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg195 200 205His Asn Ile Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Leu Leu Glu Phe Val210 215 220Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Thr225 230 235 240Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile245 250 255Glu Gly Arg Ile Ser Glu Phe Gln Gln Lys Lys Ser Gly Asn Ile Pro260 265 270Tyr Arg Val Asn Val Gln Ala Asp Ser Ala Lys Gln Lys Ala Ile Ile275 280 285Asp Asn Lys Trp Val Ala Val Gly Ile Asn Lys Pro Tyr Ala Leu Gln290 295 300Tyr Asp Asp Lys Leu Arg Phe Asn Gly Lys Pro Ser Tyr Arg Phe Glu305 310 315 320Leu Lys Ala Glu Asp Asn Ser Leu Glu Gly Tyr Ala Ala Gly Glu Thr325 330 335Lys Gly Arg Thr Glu Leu Ser Tyr Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Asp Phe340 345 350Lys Lys Phe Pro Pro Ser Val Tyr Gln Asn Ala Gln Lys Leu Lys Thr355 360 365Val Tyr His Tyr Gly Lys Gly Ile Cys Glu Gln Gly Ser Ser Arg Ser370 375 380Tyr Thr Phe Ser Val Tyr Ile Pro Ser Ser Phe Pro Asp Asn Ala Thr385 390 395 400Thr Ile Phe Ala Gln Trp His Gly Ala Pro Ser Arg Thr Leu Val Ala405 4l0 4l5Thr Pro Glu Gly Glu Ile Lys Thr Leu Ser Ile Glu Glu Phe Leu Ala420 425 430Leu Tyr Asp Arg Met Ile Phe Lys Lys Asn Ile Ala His Asp Lys Val435 440 445Glu Lys Lys Asp Lys Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Val Ala Gly Lys Pro450 455 460
Asn Gly Trp Lys Val Glu Gln Gly Gly Tyr Pro Thr Leu Ala Phe Gly465 470 475 480Phe Ser Lys Gly Tyr Phe Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Asp Arg Gln Trp485 490 495Leu Thr Asp Lys Ala Asp Arg Asn Asn Ala Asn Pro Glu Asn Ser Glu500 505 510Val Met Lys Pro Tyr Ser Ser Glu Tyr Lys Thr Ser Thr Ile Ala Tyr5l5 520 525Lys Met Pro Phe Ala Gln Phe Pro Lys Asp Cys Trp Ile Thr Phe Asp530 535 540Val Ala Ile Asp Trp Thr Lys Tyr Gly Lys Glu Ala Asn Thr Ile Leu545 550 555 560Lys Pro Gly Lys Leu Asp Val Met Met Thr Tyr Thr Lys Asn Lys Lys565 570 575Pro Gln Lys Ala His Ile Val Asn Gln Gln Glu Ile Leu Ile Gly Arg580 585 590Asn Asp Asp Asp Gly Tyr Tyr Phe Lys Phe Gly Ile Tyr Arg Val Gly595 600 605Asn Ser Thr Val Pro Val Thr Tyr Asn Leu Ser Gly Tyr Ser Glu Thr610 615 620Ala Arg625<210>3<211>1881<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>3atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggc60gatgttaatg ggcaaaaatt ctctgtcagt ggagtcccaa ttcttgttga attagatggc120gatgttaatg ggcaaaaatt ctctgtcagt ggagagctac ctgttccatg gccaacactt180gtcactactc tgacttatgg tgttcaatgc ttttcactac ctgttccatg gccaacactt240
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
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1.肝素酶表达载体，是在多克隆位点插入有由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的原核细胞表达载体。
2.根据权利要求1所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述在多克隆位点插入有由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的原核细胞表达载体能在大肠杆菌中表达外源基因。
3.根据权利要求1所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌JM109或大肠杆菌TB1。
4.根据权利要求1、2或3所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白是在肝素酶的氨基酸残基序列的氨基端或羧基端紧密连接有至少具有序列表中序列1的第1-238位氨基酸残基序列的绿色荧光蛋白片段。
5.根据权利要求4所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述肝素酶为肝素酶I，它的氨基酸残基序列在GenBank的检索编号为A47479。
6.根据权利要求5所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有绿色荧光蛋白和肝素酶活性的蛋白质。
7.根据权利要求6所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；4)与序列表中SEQID №3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
8.根据权利要求7所述的肝素酶表达载体，其特征在于所述肝素酶表达载体为pGFP-hepA；所述pGFP-hepA是将由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因插入pMAL-c2x的多克隆位点中的NdeI和HindIII识别位点间得到的重组表达载体。
9.一种表达肝素酶的方法，是将权利要求2至8中任一所述的肝素酶表达载体导入大肠杆菌中，将筛选得到表达肝素酶的菌株作为工程菌，培养所述工程菌，诱导表达肝素酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌JM109或大肠杆菌TB1；所述肝素酶表达载体为pGFP-hepA；所述诱导表达条件为在含有0.3-1mM IPTG的培养基中10-30℃诱导培养5-15小时。
全文摘要
本发明公开了一种表达肝素酶的方法及其专用表达载体。本发明所提供的肝素酶表达载体，是在多克隆位点插入有由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白的编码基因的原核细胞表达载体。本发明的肝素酶表达载体能够可溶表达和正确折叠，防止包涵体形成，并能快速定量菌体浓度和肝素酶酶活。本发明表达肝素酶的方法实现了高效可溶表达由肝素酶和绿色荧光蛋白构成的融合蛋白(GFP－hepA)，肝素酶I的表达量高达350IU/L培养基，该表达方法并能利用荧光测量对工程菌浓度及肝素酶I酶活进行快速定量追踪，有利于肝素酶I生产过程的优化和控制，有利于肝素酶的保存和应用过程的快速评价，有利于解析大分子肝素的结构和降解机理。
文档编号C12N9/24GK1757739SQ20051009087
公开日2006年4月12日 申请日期2005年8月18日 优先权日2005年8月18日
发明者邢新会, 陈银, 况莹, 叶逢春, 罗明芳 申请人:清华大学