一种肝素黄杆菌肝素酶i、ii、iii的制备方法

专利名称：一种肝素黄杆菌肝素酶i、ii、iii的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种肝素酶I、II、III的制备方法，尤其涉及一种由氯化钙全程保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的特殊层析分离技术制备肝素酶I、II、III的方法。
背景技术：
肝素酶是指一类能够特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶，最初是从肝素黄杆菌中发现并分离出来的，其后，又陆续在一些微生物和动物组织中发现存在肝素酶。肝素酶的应用十分广泛，如清除血液中残存肝素、防止凝血、生产低分子肝素、研究肝素的结构。目前有学术论文报道的肝素酶大约有10多种，得到较为细致研究的只有来自肝素黄杆菌的3种酶，分别是肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III。肝素酶I、II、III分别是分子量大约 43、78、66kd的单体蛋白质，其等电点均在9. 0左右，应用和研究非常广泛。肝素酶的纯化工作有许多研究报道，但因肝素酶是一种很容易失活的酶，已报道的纯化工艺中大都存在活性损失很大、收率低等缺点。Yang等人(J Biol Chem, 1985, 260(3) :1849-1857)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖柱层析、等电聚焦、凝胶过滤等四步纯化，制得纯肝素酶I，活性收率大约；Daniel等人(J Bio Chem, 1992, 267(34) =24347-24355)用羟基磷灰石吸附/洗脱处理、QAE-葡聚糖凝胶层析、羟基磷灰石 HPLC,Mono-S FPLC、GPC_HPLC等五步纯化，最终获得纯的肝素酶I，活性回收率10. 8% ；马小来等人(食品与药品，2005，32 (5) =446-450)使用羟基磷灰石吸附/解吸、DEAE-kpharose 柱层析、CM-Cellose柱层析等三步纯化法，纯化得到肝素酶I，活性收率13. 4% ；Xiaolai Ma 等人(J Chrom B, 2006,843 (2) :209-215)通过硫酸铵沉淀、octyl-s印harose 柱层析、 CM-650柱层析、SP-650柱层析、s印hadex G-100柱层析等五步纯化法获得纯化的肝素酶I， 收率达到17.8%，为所见的肝素酶I最高纯化收率。马小来等在2009年5月提交的“一种肝素黄杆菌肝素酶I制备方法”(专利申请号 200910039360. 1)中，建立了一种全新的纯化制备工艺，使肝素酶I在纯化过程中始终处于氯化钙的保护之下，从而获得高达30%的纯酶活性收率，制备的肝素酶I比活高达223IU/ mg，与已有最高技术相比，比活增加了两倍多，纯化收率增加将近一倍。本发明给出一种同时制备纯化出肝素酶I、II、III的方法，在氯化钙保护之下、并含肝素缓冲液洗脱的多步层析分离技术，最终制备肝素酶I、II、III的方法。方法高效、可重复，所得酶纯度极高。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肝素酶I、II、III的制备方法，该方法可同时纯化出3种酶，制备的肝素酶I、III比活高达417和235IU/mg，肝素酶II比活为 15. 3IU/mg。与已报道方法相比，酶I、III比活增加两倍，酶II比活接近最高报道。本发明包括下述步骤(1)肝素酶的粗酶液的发酵制备
将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C， 150rpm，培养1天。然后按5 %接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天。菌液 10000rpm，4°C离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM iTris-HCl@缓冲液中，冰浴超声1小时(150W，5s，5s)。4°C，10000rpm，离心30min，向其中滴加0. 5g/ml的鱼精蛋白8ml, 搅拌，4°C，IOOOOrpm,离心30min，上清即为粗酶液。(2)粗酶的SP柱分离将步骤⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCl@平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰I和II ；将活性峰II (靠后的那个)洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl @缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的TriS-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰III和IV ；(3)肝素酶I的纯化步骤( 活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl③缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I。(4)肝素酶III的纯化步骤( 活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl④缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶III。(5)肝素酶II的纯化步骤(2)活性峰I洗脱液透析后上一根用IOmM Tris-HCl⑤缓冲液平衡过的HEP 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. IM洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA 柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl@缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管， 洗脱液合并、透析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。其中，步骤⑴所述的种子培养基的组成为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，酵母粉 0. 5%, NaCl 为 0. 5%, pH7. 0。步骤(1)所述的发酵培养基组成(g/L)为肝素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5， NH4Cl2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素(NaMoO3, CuCl2, FeCl2, CoCl2, MnCl2, CaCl2, IX IO^4M) ο
步骤(1)、(2)、(3)、(4)所述Tris-HCl @②缓冲液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0，优选 PH 范围为 7. 0-7. 5。步骤(3)、(4)所述Tri s-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5%，氯化钠含量的优选范围为25-45mM，肝素含量的优选范围为0. 1-0. 2%，肝素的种类优选为高
纯度肝素。本发明还包括以下内容(6)肝素酶活性测定在5ml石英比色皿中加入在30°C预热过的2. 5ml肝素浓度为 lmg/ml 的 Tris-HCl@ (50mM，含 CaCl2 IOmM, ρΗ7· 0)缓冲液，移取 5-20 μ 1 酶液，摇勻后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。(7)硫酸乙酰肝素酶活性测定在Iml石英比色皿中加入在30°C预热过的0. 5ml 硫酸乙酰肝素浓度为lmg/ml的1Tris-HCl @ (50mM，含CaCl2 IOmM, pH7. 0)缓冲液，移取 5-20 μ 1酶液，摇勻后在232nm测定吸光值，读取每分钟的变化量。根据摩尔消光系数计算单位时间产生的双键的摩尔数，并由此计算酶液的单位活性(IU/ml)。(8)蛋白质测定向5ml考马斯亮蓝溶液中加蛋白0. 1ml，摇勻，测定A595，根据标准曲线换算蛋白浓度本发明所述制备方法中，所有肝素酶I、III纯化步骤都保证了保护剂CaCl2的存在，极大地保持了肝素酶I、III的稳定。肝素酶I经过纯化最终得到比活高达416. 67IU/ ml的酶，整个过程活性收率为35%，提纯了 73. 88倍，从IL发酵液的菌体中得到50IU的肝素酶I纯酶。肝素酶III纯化最终得到比活235IU/ml (硫酸类肝素底物)的酶，整个过程活性收率为4%，提纯了 34. 36倍，从IL发酵液的菌体中得到7. 52IU的肝素酶III酶。肝素酶II纯化最终得到比活15. 33IU/ml (肝素底物)的酶，整个过程活性收率为22%，提纯了 2. 72倍。从IL发酵液的菌体中得到2. 76IU的肝素酶II较纯酶。与已报道方法相比，酶I、III比活提高两倍多，酶II比活接近最高报道。酶I、III 纯化工艺活性收率也远高于已有报道的最高值。本发明所述制备方法，还具有工艺简单、结果易重复的特点，可放大后用于工业大规模制备高纯度肝素酶I、II、III。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。实施例1 a、将肝素黄杆菌接到50ml种子培养基中，23°C，150rpm，培养1天；b、按5%接种量接入发酵培养基，23°C，150rpm，培养2-3天，4°C，10000rpm，离心 15-30分钟，收集沉淀；C、沉淀悬浮在100ml、25mM的1^8-!1(1@缓冲溶液中，冰浴超声1小时，4°C， lOOOOrpm，离心 30min，滴加 0. 5g/ml 的鱼精蛋白 8ml，搅拌，4°C，lOOOOrpm，离心 30min，取上
清液；d、上一根用Tris-HCl@缓冲液平衡过的SP柱，以同样的缓冲液平衡3个柱体积， 以Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性，呈两个活性峰I、II分布的若干管；
e、活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 2M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的组分，呈两个活性峰III、IV分布的若干管；f、活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HClcg^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I。g、活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl 缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶 III。h、活性峰I洗脱液透析后上一根用IOmM Tris-HCl @缓冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. IM洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1. 5M洗脱，收集洗脱液若干管， 洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl②缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。其中，所述的肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，其特征在于步骤a中所述种子培养基的组成为牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%, NaCl为0. 5%,pH7. 0。步骤b中所述发酵培养基组成为肝素8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0， MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMoOpCuClyi^eClyCoClyMnClyCaCh* IXlO-4M,单位为 g/L。所述Tris-HCl @②缓冲液含 IOmM CaCl2, ρΗ6· 5-8. 0。所述Tri s-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 01-0. 5 %，肝素的种类为高纯
度肝素。所述Tris-HCl 缓冲液含氯化钠5_75mM、含肝素0. 1-0. 5%，肝素的种类为高纯度肝素。
权利要求
1.一种肝素黄杆菌肝素酶的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)肝素酶的粗酶液的发酵制备将肝素黄杆菌从平板或斜面上刮取两环菌接到50ml种子培养基中，23°C，150rpm，培养1天，然后按5%接种量接入发酵培养基，230C，150rpm,培养2-3天。菌液lOOOOrpm，4°C 离心15-30分钟，收集沉淀，悬浮在100ml、50mM Tris-HCl①缓冲液中，冰浴超声1小时； 40C，lOOOOrpm,离心30min,向其中滴加0. 5g/ml的鱼精蛋白8ml，搅拌，4°C，lOOOOrpm,离心 30min，上清即为粗酶液；(2)粗酶的SP柱分离将步骤⑴所得粗酶液上一根用10-50mM的Tris-HCli1^衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，然后以缓冲液中氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，两种酶呈两个活性峰I和II ；将活性峰II洗脱液透析后上一根用50mM Tris-HClt^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 2M洗脱，分别收集洗脱液中具有肝素酶活性和硫酸乙酰肝素酶活性的洗脱液，呈两种酶呈两个活性峰 III 禾口 IV ；(3)肝素酶I的纯化步骤( 活性峰III洗脱液透析后上一根用Tris-HClcg^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有肝素酶活性的组分，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶I ；(4)肝素酶III的纯化步骤( 活性峰IV洗脱液透析后上一根用Tris-HCl④缓冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl 缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；上一根用50mM Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以同样浓度的Tris-HCl缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液中具有硫酸乙酰肝素酶活性的组分以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶 III ；(5)肝素酶II的纯化步骤⑵活性峰I洗脱液透析后上一根用IOmM Tris-HClcs^冲液平衡过的HEP柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，Tris-HCl⑤缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. IM洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用50mM磷酸-磷酸钠缓冲液平衡过的HA柱，以同样缓冲液平衡3个柱体积，以缓冲液中含氯化钠线形梯度0-1. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析；然后上一根用Tris-HClc^l冲液平衡过的SP柱，以同样缓冲液平衡 3个柱体积，Tris-HCl@缓冲液中含氯化钠线形梯度0-0. 5M洗脱，收集洗脱液若干管，洗脱液合并、透析，以截留分子量IOkd的超滤离心管浓缩，得到肝素酶II。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述种子培养基的组成为牛肉膏0. 5%、蛋白胨1%、酵母粉0. 5%, NaCl为0. 5%,pH7. 0。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述发酵培养基组成为肝素 8，K2HPO4 2. 5，NaH2PO4 2. 5，NH4Cl 2. 0，MgCl2 0. 5，组氨酸 0. 5，甲硫氨酸 0. 5，微量元素 NaMo03、CuCl2, FeCl2, CoCl2^MnCl2, CaCl2 共 1 X 1(Γ4Μ，单位为 g/L。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HClsx^l冲液含IOmMCaCl2, pH6. 5-8. O0
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HClc^l冲液含氯化钠 5-75mM、含肝素0. 01-0. 5%，肝素的种类为高纯度肝素。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述Tris-HCl 缓冲液含氯化钠 5-75mM、含肝素0. 1-0. 5 %，肝素的种类为高纯度肝素。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于肝素酶I、III纯化步骤都有保护剂 CaCl2的存在。
全文摘要
本发明提供肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的制备方法，以肝素黄杆菌为原料，将肝素黄杆菌接到种子培养基中培养、再接到发酵培养基、离心收集沉淀、沉淀超声破碎、离心得到肝素黄杆菌肝素酶I、II、III的粗酶液，先将粗酶液通过一次SP-Sepharose FF层析分离为酶II和酶I、III，再将酶I、III再次过SP-Sepharose FF分离为肝素酶I和肝素酶III；将得到的酶I和酶III分别各再过SP-Sepharose FF两次，纯化得到高纯度的肝素酶I和III；将得到的酶II分别过HEP-Sepharose 4B、HA-Ultrogel、SP-Sepharose FF，得到高纯度的肝素酶II。
文档编号C12N9/42GK102286448SQ201110241260
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月22日 优先权日2011年8月22日
发明者史绍鹏, 李锂, 马小来 申请人:深圳市海普瑞药业股份有限公司