专利名称：菜豆炭疽病菌的检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
本申请涉及生物技术领域，尤其是生物检测领域。具体而言，本申请涉及菜豆炭疽病菌的检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
菜豆炭疽病是由菜豆炭疽病菌(Colletetrichum lindemuthianum)引起的一种真菌性病害，属半知菌亚门刺盘孢属，病菌的有性世代是菜豆小丛壳菌(Glomerella lindemuthianum)属于真菌子囊菌亚门小丛壳属，能对菜豆的子叶、幼茎、真叶、茎、荚及种子发生危害，而一旦发生病害，就会严重减产，甚至绝收。同时该病在采后也造成菜豆的腐烂变质，使菜豆不能储藏和运输，因此，造成巨大的经济损失。该病在世界各国菜豆产区均有发生，在我国，北京、天津、河北、陕西、内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江、山东、江苏、浙江、江西、福建、台湾、河南、湖南、广东、广西、陕西、青海、四川及云南等二十几个省市均有发生。
因此，准确在发病前或初期对病菌进行鉴定、监测，及时采取有效的防治方法控制病原菌的传播、流行和采后病害的发生，减少经济损失，具有十分重大的意义。从传统检测手段上，炭疽病菌的分类、鉴定主要基于形态学特性，例如培养学特征、分生孢子盘、分生孢子和附着孢的形态和大小、致病性测定等。这种传统的病原菌鉴定方法耗时长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强，从发病初期植株中分离并鉴定病原菌需要几天时间，如果这几天中遇见病害有利天气即可迅速蔓延，错过病害的最佳防治时期，难以做到对病害发生的及时监测，控制病原菌的传播和流行。同时，造成菜豆不能长期储藏和远距离运输的主要原因就是菜豆采后腐烂变质，而采后腐烂变质的主要原因是由于菜豆炭疽病菌在采收前侵染，采收后储藏和运输过程中引起发病。因此，在菜豆采收后储运前必须对菜豆炭疽病的潜伏侵染情况进行检测。传统的菜豆炭疽病检测方法一般需要6～8天，并且需要在产生症状后进行，所以在储藏和运输之前，不能明确炭疽病菌潜伏侵染的情况，造成已被炭疽病菌侵染的菜豆在储运过程中大量腐烂，产生巨大损失。
随着分子生物学的发展，不同分子技术用于真菌的检测，它们包括核糖体转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、线粒体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析、同工酶分析等。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性等优点。
近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的鉴定、检测及病害诊断中，核糖体转录间隔区(ITS)，是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域进化速率较编码区快，在种内不同菌株间高度保守，而在真菌的种间存在着丰富的变化。SCAR(Sequence-characterized amplified regions)标记是在RAPD技术上发展起来的方法，它根据筛选到的特异的RAPD片段的序列来设计引物，再进行PCR扩增，这样可以把与原来片段相对应的单一位点SCAR鉴定出来，具有比RAPD更高的稳定性。可以为研究真菌的系统发育、分类鉴定和分子检测提供丰富的遗传信息。
Zhengguangzhang等利用ITS序列差异设计出引物Fn-1/Fn-2和Mn-1/Mn-2来分别对F.oxysporum f.sp.niveum与M.melonis进行检测。还有不少学者应用ITS来研究Phytophthora、Pythium、Verticillium、Fusarium、Botryosphaeria和Hypoxylon等真菌的系统发育和检测。
对于Colletotrichum spp.的检测，已有一些报导。NataliaA.R.Peres等根据ITS区序列设计出引物CgInt以及CgInt2，其中CgInt和真菌通用引物ITS4组合的引物对能对Colletotrichum gloeosporioides检测，而CgInt2和ITS4组合的引物对能对Colletotrichum acutatum检测；D.W.Cullen等根据ITS区域设计了两套引物进行巢式PCR，其中外引物是能扩增普通的炭疽菌属，得到447bp得片断，内引物特异性地扩增Colletotrichum coccodes。
A.L.Dauch等利用RAPD转SCAR标记来检测生防菌Colletotrichum coccodes(183088)，P.V.Martinez Culebras等通过RAPD技术随机扩增80株炭疽病菌，找出C.fragariae的特异条带，转SCAR标记后对其进行检测。
目前，对Colletetrichum lindemuthianum进行分子检测，尚未见国内外有关报道。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中对菜豆炭疽病菌检测和鉴定主要基于形态学特性，方法耗时长、程序繁琐、灵敏度低以及经验性强，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行以及采后病害造成腐烂变质的问题。提供一种对菜豆炭疽病进行快速PCR检测的试剂盒和检测方法，检测时间短、灵敏度高、准确性强。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种用于特异性检测样品中菜豆炭疽菌的组合，所述组合包括两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’(SEQ ID NO1)下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；(SEQ ID NO2)第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’(SEQ ID NO3)下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’(SEQ ID NO4)。
本发明第二方面提供了一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本发明第三方面提供了一种检测样品中菜豆炭疽菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用本发明上述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在442bp和638bp的DNA片段，则表明所述样品中有菜豆炭疽菌。
本发明还有一个方面涉及本发明所述的PCR检测试剂盒在检测样品中菜豆炭疽菌中的应用。
与现有技术相比，本发明技术方案的优点和积极效果表现在1)实用性强菜豆炭疽病菌的快速检测，具有重要的实际应用价值。菜豆采后腐烂变质的主要原因是菜豆炭疽病菌在采收前侵染，但未显现症状，再采收后储运过程中出现症状引起发病。传统的菜豆炭疽病检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，对病原物进行分离、纯化、鉴定等一系列繁琐的过程，一般需要6～8天，而且病原物在分离时也存在一定的困难，给快速而精确地检测病原物增加了难度。使采收后储藏和运输前，不能明确炭疽病菌潜伏侵染的情况，造成已被侵染得菜豆在储运过程中大量腐烂，产生巨大损失。同时由于不能在前期及时进行田间的群体动态监测，也给农业生产的防治延误时机。因此，现有的技术无法满足农业生产的要求。采用本发明，在没有病症出现的情况下，就可以进行检测，并且在4～6小时就能准确地完成检测工作，大大提高了工作效率，为菜豆的长期储运提供了可能，也为病害的防治创造了先机。
2)准确性高本发明利用GeneBank中Colletetrichum属的24个种的ITS系列比较，设计出一对引物CY1/CY2，将Colletetrichum lindemuthianum、Colletetrichumorbiculare这两个种的菌和其它菌分开。进一步利用RAPD反应随机扩增Colletetrichum lindemuthianu和Colletetrichum orbiculare，找出在Colletetrichumlindemuthianu中的特异性条带，经过克隆、测序后，设计出引物CD1/CD2，将Colletetrichum lindemuthianu和Colletetrichum orbiculare分开。继而利用上述两对引物组合成复合PCR检测体系，能够直接将Colletetrichum lindemuthianu和其它相似或相关种分开。本发明者对与炭疽菌相近和相关的真菌、植物体、土壤中的常见真菌等189个菌株进行了扩增，结果发现，准确率高达100％。
3)灵敏度高传统的菜豆炭疽病检测方法一般是在植物出现症状后，借助其发病症状，进行病原物的分离、纯化、鉴定等，需要病原菌产生足够多的菌丝或孢子，一般需要每克植物组织或土壤中含有500～800个分生孢子或相当的菌丝体，才能分离出来。本发明提供的菜豆炭疽病菌检测试剂盒及其检测方法，能检测到10pg/μl的DNA，也就是说，可以在病害显现症状前，检测出每克植物组织或土壤中含有5～10个分生孢子或相当的菌丝体，灵敏度相当高。本发明的其它目的优点可从以下的详细描述结合附图后获知。
图1显示了在本发明的一个实施方案中对菜豆植株叶片中炭疽菌的检测结果，图中泳道1阴性对照；泳道2阳性对照；泳道3、4发病菜豆叶片；泳道5健康菜豆植株。
图2显示了本发明另一实施方案中对菜豆豆荚中炭疽菌进行检测的结果，图中泳道1阴性对照；泳道2阳性对照；泳道3至4发病菜豆豆荚；泳道5-7西瓜炭疽病叶；泳道8健康菜豆豆荚；泳道9健康西瓜叶片；泳道10辣椒炭疽菌；泳道11白菜炭疽菌；泳道12大豆炭疽菌；泳道13菜豆褐斑病菌；泳道14枯萎镰刀菌；泳道15大豆疫霉菌。
图3显示了本发明另一实施方案中对菜豆田土壤中的菜豆炭疽菌进行检测的结果，图中泳道1阴性对照；泳道；2、3阳性对照；泳道4发病菜豆叶片；泳道5发病菜豆田土壤；6、7非菜豆田土壤；8、9健康菜豆叶片。
具体实施例方式
本发明属于农作物防病治病及植物检疫范畴。本发明者根据菜豆炭疽菌的ITS基因序列设计出的一对特异寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)，再进一步利用RAPD反应，经过对特异性条带克隆、测序后，转SCAR标记，设计出另一对特异寡聚核苷酸引物(SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。利用上述两对引物组合成复合PCR检测体系，从而为菜豆采前和采后炭疽病的快速、灵敏和准确的检测提供了技术和方法。
具体而言，本发明第一方面了一种用于特异性检测样品中菜豆炭疽菌的组合，所述组合包括两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本发明的引物可用任何已知的方法产生，例如Matteucci等人[J.Am.Chem.Soc.(1981)1033185]的三酯合成方法或Urdea等人[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)807461]的方法，或用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。另外，还可以根据偏好选择引物的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，还可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，改变RNA亲和力，增加核酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer(1995)Curr Opin Biotechnol 612-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14376-387]；还可采用类似物如肽核酸[例如参见Corey(1997)TIBTECH 15224-229；Buchardt等人(1993)TIBTECH 11384-386]。
本发明第二方面提供了一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
本发明中所用的术语“PCR”或“聚合酶链反应”指一种过程或技术(如美国专利No.4,683,195(1987年7月28日授权)中所述的那样)。通常，需要获得感兴趣区域两端或其外延的序列信息，从而可以设计寡核苷酸引物；这些引物应与待扩增模板相反链的序列相同或相似。两个引物的5′端核苷酸可以与扩增材料的两端恰好重合。PCR技术可用来扩增全部基因组DNA中的、从全细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录获得的cDNA中的特定RNA序列、特定DNA序列。见Mullis等，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51263(1987)；Erlich编辑，PCR Technology(Stockton Press，NY，1989)。
聚合酶链反应技术是本领域技术人员熟知的一种检测少量靶核酸的手段。类似试验在Mullis等人[Meth.Enzymol.(1987)155335-350]；美国专利4,683,195和4,683,202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便的限制性位点。为了检测出靶核酸的存在，特异性引物的选择是至关重要的。
本领域技术人员能够根据熟知的技术合适的选择本发明试剂盒中的PCR反应体系。在本发明的一个较佳实施方案中，所述反应体系还可包含PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶等。PCR缓冲液可以由本领域技术人员根据公知技术来确定，例如可以是100mM Tris HCl(pH 8.3)；500mM KCl；1.0％Triton X-100。在一个更佳的实施方案中，所述反应体系由以下组分组成以1毫升溶液计，100μl10×PCR反应缓冲液，80μl 2.5mM Mg2+，4种浓度为2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500单位Taq酶，20μM·L-1的两对上、下游引物各20μl，余量为超纯水。
另外，本发明的PCR检测试剂盒中还可附带操作说明书。
本发明的的PCR检测试剂盒可用于特异性地检测菜豆炭疽菌的存在与否。因此，本发明另一方面涉及所述PCR检测试剂盒在检测样品中菜豆炭疽菌中的应用。
本发明另一方面还提供了一种检测样品中菜豆炭疽菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用本发明上述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在442bp和638bp的DNA片段，则表明所述样品中有菜豆炭疽菌。
在所述方法中，样品可以是例如，但不局限于，菜豆植株的子叶、幼茎、真叶、茎、荚及种子，较佳的是上述菜豆植株组织的DNA提取物。所述DNA提取物可用市售的DNA提取试剂盒或其他常规的DNA提取方法获得。在另一较佳的实施方案中，所述样品也可以来自土壤或其他怀疑含有菜豆炭疽菌的任何样品。
在上述方法中，首先在PCR检测试剂盒所附说明书的条件或是由本领域技术人员根据常规实验确定的条件下，用本发明所述的两对菜豆炭疽菌特异性引物对样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物。然后，用常规方法，如凝胶电泳(如琼脂糖凝胶电泳)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小。如果可以的话，还可以采用更为精确的测定方法，如对产物进行测序等。如果结果显示上述两对引物成功扩增出了具有预计长度(442bp和638bp)的条带，则表明所述样品中有菜豆炭疽菌。应当理解的是，菜豆炭疽菌的DNA序列可能会发生各种变异(如缺失、增加或取代)，因此实际测得的扩增产物的长度可能会与上述长度有一定的差别。所以，本发明说明书通篇中所用的长度“442bp和638bp”的含义并不仅仅表示这些长度本身，而是包括了在所述长度附近(例如相差20个bp或更多，较佳为相差10个bp，更佳为相差5个bp的)的长度。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。
实施例1、检测菜豆植株叶片中炭疽菌a)材料设计如下所示的菜豆炭疽菌的特异性引物序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
用DNA合成仪合成上述序列。
如下配制试剂盒反应体系1mL检测溶液包括100μl 10×PCR反应缓冲液，80μl 2.5mM Mg2+，4种浓度为2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500单位Taq酶，20μM·L-1的上述二对上、下游引物各20μl，加入超纯水至1mL检测溶液。
b)方法1)从菜豆植株叶片中提取菜豆炭疽菌的DNA取叶背的叶脉呈红褐色条斑的菜豆叶片，每克组织加入20μl 0.5N NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μl直接用于PCR反应。
2)菜豆炭疽菌的复合PCR检测取1μl上述DNA粗提溶液，加入24μl试剂盒溶液总体积为25μl。PCR扩增程序为94℃预变性5min，进入循环，94℃变性45S，62℃退火30S，72℃延伸1min，共计32个循环。最后72℃延伸7min。
扩增反应的电泳检测取8μl扩增后的溶液，在1.5％的琼脂糖凝胶于1×TAE中电泳，电压5V/cm，电泳30分钟后在紫外灯下观察检测结果。结果显示，发病菜豆叶片(泳道3和4)扩增出442bp和638bp两条DNA谱带(结果如图1所示)，而健康菜豆植株(泳道5)则没有。这说明检测的叶片中含有菜豆炭疽病菌。
实施例2、检测菜豆豆荚中炭疽菌采用与实施例1a)相同的反应体系。
取有褐色小点状病斑的菜豆豆荚表皮组织，每克组织加入25μl 0.5NNaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的Eppendorf管中，12000rpm离心5min，取8μl上清液加入492μl 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μl直接用于PCR反应。
按照实施例1的方法进行PCR扩增和电泳检测，结果显示发病菜豆豆荚(泳道3和4)与阳性对照(泳道2)一样在638bp和442bp处见到两条清晰的菜豆炭疽菌的特异谱带，西瓜炭疽病叶显示出有442bp的条带，其他泳道则未见条带(如图2所示)。这表明本发明的方法能够将菜豆炭疽菌与其他相似或相关的菌种区分开来。
实施例3、检测菜豆田土壤中的菜豆炭疽菌取1g上年菜豆炭疽病发病较重的菜豆田土壤，样品中加入10ml提取液(0.5mM葡糖醇，15％聚乙二醇6 000，2％焦碳酸二乙脂，100mM EDTA和50mM三羟甲基氨基甲烷，pH 8.0)，混合5min，再加入600mg PVPP，120μl 50mg·ml-1溶菌酶和120μl 200mg·ml-1β-葡聚糖酶，混合后放置冰上2h。然后加入细胞溶解提取液(4.0ml 4％ SDS，100mM EDTA，60μl·ml-1蛋白酶K和50mM Tris pH8.0)，混合后放置冰上18h。离心10min，上清液加入3M醋酸钾置冰上2h，离心留上清液，加入两倍体积的100％乙醇沉淀DNA，溶于TE缓冲液。取1μl直接用于PCR反应。按照实施例1的方法进行PCR扩增，结果在442bp和638bp处可见两条明亮的菜豆炭疽菌的特异性条带(图3)，这表明检测的土壤中含有菜豆炭疽菌。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>华东理工大学<120>菜豆炭疽病菌的检测试剂盒及其检测方法<130>058655<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1ctttgtgaac atacctaacc 20<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2ggttttacgg caggagtg 18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3acctggacac ataagtcaaa g 21<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4caacaatgcc agtatcagag 20
权利要求
1.一种用于特异性检测样品中菜豆炭疽菌的组合，所述组合包括两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物 5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物 5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
2.一种PCR检测试剂盒，所述试剂盒包含PCR反应体系，所述反应体系包含两对特异性引物，所述特异性引物选自以下序列第一对上游引物5’CTTTGTGAACATACCTAACC 3’下游引物 5’GGTTTTACGGCAGGAGTG 3’；第二对上游引物5’ACCTGGACACATAAGTCAAAG3’下游引物 5’CAACAATGCCAGTATCAGAG3’。
3.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系还包含PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP和Taq酶。
4.如权利要求2所述的PCR检测试剂盒，其特征在于，所述反应体系由以下组分组成以1毫升溶液计，100μl 10×PCR反应缓冲液，80μl 2.5mM Mg2+，4种浓度为2.5mmol·L-1的dNTP各40μl，500单位Taq酶，20μM·L-1的两对上、下游引物各20μl，余量为超纯水。
5.一种检测样品中菜豆炭疽菌的方法，该方法包括以下步骤，a)用权利要求2所述的PCR检测试剂盒对所述样品进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；b)测定步骤a)获得的PCR扩增产物的大小，若产物中存在442bp和638bp的DNA片段，则表明所述样品中有菜豆炭疽菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品是菜豆植株的子叶、幼茎、真叶、茎、荚、种子及其DNA提取物。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述样品是土壤。
8.权利要求2所述的PCR检测试剂盒在检测样品中菜豆炭疽菌中的应用。
全文摘要
本发明提供了用于特异性检测样品中菜豆炭疽菌的引物组合以及含有该引物组合物的PCR检测试剂盒。本发明还提供了检测样品中菜豆炭疽菌的方法。本发明方法具有检测时间短、灵敏度高、准确性强的优点。
文档编号C12Q1/04GK1814803SQ20051011077
公开日2006年8月9日 申请日期2005年11月25日 优先权日2005年11月25日
发明者王伟, 唐建辉, 魏鸿刚, 沈国敏, 李元广 申请人:华东理工大学