专利名称：：通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法通过rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白抑制纤维发生的方法发明领域本发明涉及通过施用肝星形细胞活化和成纤维细胞活化的拮抗剂来抑制纤维发生(尤其是肝纤维发生)的方法。本发明还涉及制备融合蛋白构建体和生产融合蛋白。
背景技术：
：关于肝纤维化，纤维化在结构改造的最终共有途径中起着性的作用，所述结构改造减少了损伤后的正常器官功能。它是针对发育或炎症疾病的最具根本破坏性和最不需要的应答中的一种，而且在暴露于高氧压后的数百万的处于许多不同疾病进程的晚期阶段的个体中被观察到，所述疾病包玩者如囊性纤维化、间质性肾炎、肝硬化和肺纤维化。肝纤维化的特征在于肝中的细卜基质组分的过量沉积。如S丄.Friedman在题为"MolecularRegulationofHepaticFibrosis,anIntegratedCellularResponsetoTissueInjuiy，"JBiolChem2000;275:2247-2250的文章中所述，有几种肝细胞类型参与基i^沉积，主要类型是如B.Tuchweber等在题为"ProliferationandPhenotypicModulationofPortalFibroblastsintheEarlyStagesofCholestaticFibrosisintheRat，"LabInvest1996;74:265-278的文章所述的肝星形细胞(HSC)和门成纤维细胞。在过去的10年间，已有大量注意力关注于造成肝中的纤维发生细胞活化的刺激物。如以上Friedman之文章i，，主要焦点是在生长因子和氧化剂应itt。纤维发生经典地是由器官成纤维细胞介导的，所述细胞^ii足量的I和m型胶原蛋白。肝中纤维发生的表达已是以前几年详尽研究的主题。该过程的细胞因子调节是复杂的。一般认为i和m型胶原蛋白是主要的纤维变性胶原蛋白，而且它们由肝星形细胞(HSC)和成纤维细胞良好地表达。这些胶原蛋白的表达由细胞因子复^调节。例如，肿瘤坏死因子P1CTGF(31)叙l」^a程中是早期而且关键的组分。一般认为，在肺、肝和肾中TGF(31是针对这些胶原蛋白基因的调节分子。(Wahl，S.M.，1992J.Clin.Immunol.12:61-74;Sh羅a^K.和Ziyadeh,F.N.，1993SeminarsinNephrology13:116-128;Roberts等，1986Proc.Nat'lAcadSci,USA83:4167-4171。)最重要的肝纤维化硬化的成因是慢性乙型和丙型肝炎的感染和长期酗酒。肝硬化是肝纤维化的临床终点。直到目前，没有可用的回OT硬化的有效方法，而那些受到威胁到生命的肝功能损伤的人只能指望肝移植5fe抢救。可是，每年新硬化病例的数目为可用于移植的肝的数目5至10倍。所以，防止纤维发生和早期治疗纤维化是硬化的最佳疗法(AchordJL.1991，ComprTher.17:57-64，Habib等，2001，PostgradMed.109:101-13)。抑制纤维发生的策略可以分成如下几组(a)抗炎齐诉n抗氧化剂；(b)细胞因子或细胞因子受体的拮抗抓(c)M^细胞活化的抑制抓和(d)抗胶原蛋白剂p.MontgomeryBissell，2001，EXPERIMENTALandMOLECULARMEDICINE,Vol.33:179-190)。可是，这些试剂中的大部分在治疗纤维化中并不是很有效或者有严重的副作用。因此需要开发新的用于抑制肝纤维发生和治疗肝纤维化的方法。其他背景有，如美国专利5,824,655所述，核心蛋白聚糖己被用于通过利用基因治疗来限制TGF-P活性。另外，如美国专利6,436,900戶腿，核心蛋白聚糖已被用于治疗病理学。可是，后一个专利没有讨论肝疾病的治疗。核心蛋白聚糖是小的富含亮氨酸的多功能蛋白聚糖，而且它由核心蛋白和共价连接的糖胺聚组成。人的核心蛋白聚糖核心蛋白质的大小和^f量是359个氨基酸；39746Da，猪的是360个tt酸。该分子的原始功能涉及原纤维形成。核心蛋白聚糖体内结合I、n和IV型胶原蛋白并^S具有增加的稳定性并改变了溶解度的纤维形成。(Krusius和Ruoslahti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83:7683-7687(1986);Day等，Biochem.J.，248:801-805(1987);Pearson等，J.Biol.Chem,，258:15101-15104(1983);Vogel等，Biochem,J.223:587-597(1984)。)有证据显示，核心蛋白聚糖在细胞生长调控中起着作用。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中核心蛋白聚糖的表达已经被证明会导致斷氐的生顿率、降低的饱和密度禾口改变的形态学(Yamaguichi和Ruoslahti.Nature336:244-246(1988))。核心蛋白聚糖的这些生长抑制性质包括(a)在静止期核心蛋白聚糖的表达显著地提高；(b)活跃增殖的或经转化的细鹏艮少親核心蛋白聚糖；(c)舰病毒转化能消除核心蛋白聚达；和(d)在各种致瘤的细胞系和肿瘤组织中通过其控制区的甲基化而抑制核心蛋白聚糖的基因转录(Iozzd，等CritRev.Biochem.Mol.Biol.32:141-174(1997))。核心蛋白聚糖通过结合EGFR的离散的区域而抑制肿瘤细胞生长，从而导致产生能抑制EGFR功能并活化EGF受#^MAP激,p21轴的蛋白质模拟物。(Moscatello等J.ClinInvest.15;101(2):406-12.(1998);Santo等，JBiolChem20;277:35671-81(2002》核心蛋白聚糖也通过抑制肿瘤细胞介导的血管发生抑制肿瘤生长(Grant等，Oncogene21:4765-77(2002》。据报道，核心蛋白聚糖通过干扰转化生长因子-卩(TGF-(3)~~纤维发生的主要刺激物的生物活ttt减少纤维发生。TGF-p不仅调节作为对组织损伤的正常应答部分的细M卜基质(ECM)积聚和沉积ECM，而且调节病理上的纤维化。TGF-P体内稳态的改变对于多种组织的纤维化疾病是重要的(WellsRG.AmJPhysiolGas加intestLiverPhysiol.279:G845-50.(2000》。作为TGF画卩抑制剂，核心蛋白聚Wl其蛋白质部分特异结合并中和TGF-p配体以以剂量依赖的方式体外干扰TGF-p生物活性。在体内，TGF-p的超表达导致显著的肺纤维化，其可通过伴随的核心蛋白聚糖超，而显著降低(Yamaguchi等，Nature346:281-284，(1990);Kolb等，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.280:L1327-34(2001》。核心蛋白聚糖参与细胞凋亡的调节。已发现，核心蛋白聚糖减少在胶原蛋白网格中培养的内皮细胞的细胞凋亡(Schonherr等，EurJCellBiol.78:44-55(1999))。核心蛋白聚糖在EC中作为信号传导分子并M3！Akt1性和非,性途径影响细胞的存活(Schonherr等，AnnNYAcadSci.973:149-52(2002》。在扩大生物活性的努力中，Fc融合蛋白已经得到关注。已注意到，重组蛋白是正出现的一类治疗剂。一种这类llt布是使用免疫球蛋白Fc区制备融合蛋白。抗体包含两个功能独立的部分，即被称作"Fab"的可变结构域，其结合抗原，和被称作"Fc"的恒定结构域，其提供了与诸如补体或吞噬细胞的效应子功能的连接。免疫球蛋白的Fc部分具有长的血浆半衰期，而Fab是短命的。(Capon，等.，Nature337:525-531(1989))Fc融合蛋白应保持亲本蛋白的生物活性并具有比其亲本更长的半衰期，这是因为IgG能循环几天(WO99/25044)。注意到，美国专利6,277,375提及突变的Fc片段来延长生物半衰期，美国专利6,660,843也一样。可是，这些专禾瞎殿有将Fc片，用于核心蛋白聚糖上。发明M研究对与TGFpi所i秀发的肝星形细胞活化和肝纤维化相关的纤维变性条件的拮抗作用，已经发现特定配制的核心蛋白聚糖融合蛋白通过更有效地抑帝岍纤维发魏提高肝纤维化的弱化。在该蛋白质中，用肽接头将{針布的Fc片段加到rh核心蛋白聚糖上。发现产生的蛋白质能更有效地治疗肝纤维化并具有延长了50%的生物半衰期。更具体地，发测針布的核心蛋白聚糖拮抗齐鹏ihl干纤维化的发展，尤其在病毒性肝炎病程中，如慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎。在一个实施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白包含rh核心蛋白聚糖、肽接头和f針布的人IgGFc片段或结构i爽表示为IgGlFc)。也发现，,使用长度为约20或更少的氨基酸的柔性肽接头，而且柔性肽接头含两个或更多的选自甘氮酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。IgGFc变体具有非裂|#寺性，其带有舰用10个新的氨基酸替代通常!柳的4个氨基酸而制成的斷布的Fc片段。因为l顿了l針布的Fc片段和肽接头，所以发现rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的生物学半衰期比单独使用核心蛋白聚糖的长50%。在本发明的另一个实施方案中，公开了用于从诸如Cos-7细亂系的哺乳动物细胞系制备或生产主题重组融合蛋白的方法。如所观察到的，rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白特征在于并显示出相对于rh核心蛋白聚糖增强的生物学活性并延长了血清半衰期而无不希望的副作用，从而导致改善的药物代谢动力学和药物动力学。因此，只需要更低的齐暖和更少的注射就能获得相似的功效。总之，本发明涉及通过直接施用重组的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白来体外和/或体内抑制肝纤维发生的方法。在一个实施方案中，在核心蛋白聚糖和Fc铰链片段之间提供接头以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加了核心蛋白聚糖的生物学活性，并增加了结合TGF-(3的能力，并延长了核心蛋白聚糖在血清中的寿命，其中Fc铰链片段是斷布的Fc形式，其包括用IO个不同的氮基酸替代4个N-末端氨基酸，戶/M替彻每核心蛋白聚糖-Fc蛋白的絲延长50%。附图简述本发明的这些和其它特征将结合详细说明、结合附图来更好地理解，其中图1A和IB显示了在用CCl.sub.4(四氯化碳)处理8周(苏7^f和曙红(HE)染色)后核心蛋白聚糖处理,肝纤维化的作用，其中图1A显示了对单独用CC1.sub.4处理的大鼠的作用，而图IB显示了对用CCl.sub.4和rh核心蛋白聚糖处理的大鼠的作用。(X100);图2A和2B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF|31诱发的肝星形细胞增殖的作用，其中LX-2细胞(人HSC细胞系)^^虫地或在2n^mlTGF(31存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小时，而且其中通过测量染料3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2，5二苯基四P^MIT)的减少来评估细胞数目，其中图2A显示了rh核心蛋白聚糖对由TGF卩1诱发的LX-2细胞增殖的作用((C;对照；D:rh核心蛋白聚糖(4ug/ml);T:TGF(31(2ng/ml);T+D:TGF卩l(2n^ml)加rh核心蛋白聚糖(4pg/ml))。(*指对照对TGF卩1p<0.05;#指TGF卩1对TGF(31加rh核心蛋白聚糖p<0.05。N=4)，而且其中图2B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF|31诱发的LX-2细胞增殖的作用((C;对照；T:TGF卩l(2ng/ml);D-Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGF(31(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml))。(**指对照对TGFpip<0.01;弁指TGF(31对TGF卩1加rh核心蛋白聚糖p<0.05。N=4);图3A和3B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处舰用TGF卩l刺激的HSC细胞的MMP-2(基质金属蛋白酶-2)mRNA水平的作用，图3A和3B中用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^^魁也或在2ng/mlTGF(31存在的情况下处理LX-2细胞24小时，收获细胞用于总RNA提取，进行RT-PCR以检测rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGF卩1朿微的LX-2细胞的MMP-2mRNA水平的作用，而且其中将GADPH用作为对照，图3A显示了rh核心蛋白聚糖处MMMP-2的作用，而图3B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc处自MMP-2的作用((C;对照；D:rh核心蛋白聚糖；T:TGF卩l(2ng/ml);D+T:TGF卩l(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4p^ml);I>Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGF卩l(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml))。图4A和4B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚H-Fc处W"用TGF(31刺激的HSC细胞的TTMP-l(基质金属蛋白酶组织抑制剂-l)mRNA7jC平的作用，其中在图4A和4B中，LX-2细胞分别用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^4魁也或在2ng/mlTGFpi存在的情况下处理24小时，其中收获rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处理过的细胞用于总RNA提取，其中进行RT-PCR以检测rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGF-(3刺激的LX-2细胞的T1MP-1mRNA水平的作用，其中将GADPH用作对照，图4A显示了rh核心蛋白聚糖处舰TMP-1的作用，而图4B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc处舰TIMP-1的作用。((C;对照；D:rh核心蛋白聚糖；T:TGF卩1(2n^ml);D+T:TGF(31(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖(4pg/ml);D-Fc:rh核心蛋白聚糖-Fc(1pg/ml);T+D-Fc:TGFpi(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1Mg/ml).);图5A和5B显示了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc处M用TGF(31刺激的HSC细胞的胶原蛋白m蛋白7jC平的作用，其中LX-2细胞用rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc在2ng/mlTGF(31存在的情况下处理24小时，而且收获培养基，图5A显示，进行蛋白印迹以评估rh核心蛋白聚糖禾口rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGFpi刺激的LX-2细胞的胶原蛋白IE蛋白K平的作用，而图5B显示了定量结果。T:TGF(31(2ng/ml);T+D:TGF(31(2n^ml)加rh核心蛋白聚糖(4|ag/ml);T+D-Fc:TGF卩1(2ng/ml)加rh核心蛋白聚糖-Fc(1Hg/ml)。T+Fc:TGF卩1(2n^ml)加Fc(1pg/ml))。图6显示了rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白构建体，其包括1:核心蛋白聚糖；2:接头；3:免疫球蛋白Fc片段；4:二硫键。图7A和7B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc核酸分子的蛋白表达，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重会M粒转染Cos-7，用G418(0.6mg/ml)筛选，其中收集培养基用于蛋白印迹，而且其中将核心蛋白聚糖重会服粒用作对照，图7A显示了抗-IgGFc，而图7B显示了抗人核心蛋白聚糖抗体，其与用于检测rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的HRP缀合，其中对于图7A，M:丰gi己；泳道l-3:转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的培养基。泳道4:来自Sigma的核心蛋白聚糖对照，而且其中对于图7B，M:^H己；泳道1-3:转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的细胞溶解产物，泳道4-6:转染了rh核心蛋白聚糖、rh核心蛋白聚糖-Fc和载体的细胞的培养基，泳道7:来自Sigma的杨L、蛋白聚糖对照；禾口图8A和8B显示了rh核心蛋白聚糖-Fc寿命的50%延长，其中用rh核心蛋白聚糖-Fc重会M粒转染Cos-7，并且其中收集培养基并于37'C温育从0天到5天的不同时间，其中将rh核心蛋白聚糖用作对照，并且其中用蛋白印迹来测定rh核心蛋白聚糖的稳定性，其中对于图8A的泳道l、3、5、7、9和11:于37。C温育核心蛋白聚糖0、1、2、3、4禾口5天。》爐2、4、6、8、10和12:于37。C温育核心蛋白聚糖-Fc0、1、2、3、4禾口5天，而且其中图8B显示了蛋白印迹的定量。详细说明1.rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对纤维化(尤其是肝纤维化)的作用首先研究rh核心蛋白聚糖对四氯化碳(ccg诱发的大鼠肝纤维化的作用。如图1A中所示，与X寸照相比，用CCU处理8周诱发出了显著的纤维化，形成了缺少中央静脉的小结并消失了肝小叶的正常结构。如图2B中所示，最初用CC^处理后2周，在余下的6周将rh核心蛋白聚糖与CC^一慰妇寸。如所观察到的，加入rh核心蛋白聚糖显著减少了纤维发生的病理学改变。也研究了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF-p诱发的肝星形细胞(HSC)活化的作用。HSC活化是肝纤维发生的基本过程。纤维发生呈现为HSC的增殖禾啣卜基质的改造，包括，肝细胞基底膜中的胶原蛋白IV的降解和过量细卜基质组分(如胶原蛋白i和胶原蛋白m)粗干中的沉积。在该过程中，基质金属蛋白酶2(MMP-2)和金属蛋白酶组织抑制剂l(TMP-l)的皿在mRNA7K平被上调。胶原蛋白IV是MMP-2的底物。HMP-1是MMP-1的抑制剂，其能清除胶原蛋白I和m的沉积。发现rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-FcM抑制细胞增殖、胶原蛋白m产生和由TGF-J3刺激的MMP-2和TIMP-1，来消除TGF-p对肝TO细胞的作用。根据这些结果并考虑到rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc有非常好的安全特征的事实，可将rh核心蛋白聚糖-Fc用作抛干纤维发生的药物。肝纤维发生是活跃的过程，其导致肝中过量的细麟基质组分的沉积。其已在许多状况下观察到，如慢性乙型和丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、药物诱发的肝病、血色素沉着症、自身免疫性肝炎、Wilson病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、肝血吸虫病等。纤维发生可在其它器官中类似地发生，如肺、肾、胰、心和舰。本发明尤其有助于治疗肝纤维化。"肝纤维化"是肝中的细卜基质组分已确定的过量沉积。其终点是肝硬化。在本发明，的实施方案中，rh核心蛋白聚糖-Fc用于防止肝纤维化的发展，所述肝纤维化可在已感染了肝炎病毒(如乙型肝炎病毒(HBV)、或丙型肝炎病毒(HCV))的患者中发生。更具体地，慢性病毒幽干炎尤其是针对乙型慢鹏干炎禾吶型慢性肝炎。术语"需要该治疗的患者"指的是任何患有器官疾病的人受试者或哺乳动物，包括绵羊、牛、狗、猫、啮齿类动物、兔或山羊，在戶脱疾病中观察到了纤维发生或通常由疾病发展导致纤维发生。术语"治疗"和"防止"包括在任何现象发展阶段或在其发生前治疗和预防纤维发生。本发明的目的尤其是防止、或减少或减轻患有器官疾病的患者的肝纤维化。根据本发明，治疗有效量的rh核心蛋白聚糖-Fc的4OT有效M^或防liJ干纤维化发展。2.rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的分子结构本发明提供了用于防止纤维化的融合蛋白。本发明的融合蛋白和/或编码该融合蛋白的核酸可直接向需要用抗纤维化蛋白治疗的哺乳动物施用。因而，本发明掛共了融合蛋白，其包含本文中被称为杨H、蛋白聚糖的靶蛋白、人工接头和免疫球蛋白Fc区或片段。因为二聚体构建体是优选的，所以主题融合蛋白特征为二聚体，其ilil相邻亚基中半胱氨酸间的一对二硫键交联。在图6中，将二硫键描述为M每个重链内的部分免疫球蛋白铰链区或片段将两个免疫球蛋白重链Fc区、片段或结构域连在一起，并因此具有该分子天然形式的特征。应当理解，免疫球蛋白Fc区或片段包括至少一部力，链区、CH2结构域和CH3结构敏参见SEQ.ID.NO.1和2)。在本发明中，Fc区N-末端的核酸序歹提轻微斷布的，从cctgtctocgggtaaa至atcactagtgaa加gcggccgctcgagtctag(参见8￡(^.10^0.3)。注意至1」，在Fc区或片段《封布中，用IO个氨基酸ITSEFAAARV(参见SEQ.ID.NO.4)替代4个驢酸SPGK。通體性接头将Fc区附着到核心蛋白聚糖的c-末端。本文中所用的术语"多肽接头"被理解为指能将两个并不天然连在一起的蛋白质连在一起的肽序列。多肽接头包含多种氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸或这些氨基酸的组合。多3太接头包含一系列长度为约19个残基的甘氨酸和丝氨MI太(参见SEQ.ID.Na5和6)。可是，预计最佳的接头长度和氨基酸组成可由常规实验来确定。本文中所用的重组分子具有构型X-Fc，其中X是革E分子。例如，免疫球蛋白Fc区可通过链间二硫键结合以产生图6中所示类型的构建体。本文中所用的术语"核心蛋白聚糖"被離为指錄核心蛋白聚糖(参见SEQIDNO:7禾口8)。实施例:过rh核心蛋白聚糖抑制大鼠的肝纤维发生材料和方法，动物和实验设计禾,可接受的伦理指导方针行所有实验。该研究中4顿重量为200-250g的雄性Wistar大鼠(北京医科大学)。动物能自由微食物和t畑7jC。舰将CC14与橄榄油混合来制备40%CC14(Sigma)。通过以3ml/kg体重皮下注射给予40。/。CC14，一周两次，进行8周，来诱发出肝损伤和纤维化。CC14的对照动物仅接受橄榄油。每天以20ug/kg/d体重的齐糧胸莫内^ffirh核心蛋白聚糖。/Affl核心蛋白聚糖转染的Cos-7细胞的培养基中提取rh核心蛋白聚糖。这样，可区分3组，每组包括7只动物。组I:只有橄榄油；组II:40%CC14;组m:40%CC14加rh核心蛋白聚糖。在第三周开始rh核心蛋白聚糖治疗并持续6周。在指定的时间点，处死动物。从几个叶中取肝样品并在液氮中冷冻。也收tt清样品。肝功能测试在自动分析仪上进行常规肝功能血液测试，包括透明质酸糖胺多糖(hyaluronan)、IVMjK原酶、YGT和转氨酶。纤维化iffe在用福尔马林固定的、石蜡包埋的、用苏木精和曙红(HE)染色的切片，行纤维化评估。用图像分析系统获取图片。将来自一系歹赎验的所有样品同时染色。由高级病理学者判断肝纤维化沉积并用METAVIR等级分级，期各纤维化分级为F0沃纤维化)到F4(硬化)。METAVIR等级是广泛j顿的等级，其具有极好的观测者间的可靠性。表l显示了结果。统计学分析表1中的统计学分析通过WILCOXON进行，在其他表和图中使用SPSS11.0软件通过ANOVA进行。结果用rh核心蛋白聚糖对CC14-处理的大鼠进行处理造成纤维化的减少。在用CC14处理8周并用rh核心蛋白聚糖处理6周后的大鼠组中，与用CC14单独处理的相比，结果最显著(WDXOXON得出pO.Ol)。肝功能的生物化学测试如表2所示。表l.用CC14处理8周并用rh核心蛋白聚糖处理6周后的大鼠肝的病理学改变绍.<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表2中的结果标为平均值士lSD。CC14^^虫处理和CC14加rh核心蛋白聚糖之间的大鼠肝功肯她清生物化学测试的差异在统计学上是显著的。N=JOT的动物数。在肝纤维发生期间，由于有纤维组织广泛沉积，所以细M卜基质成分(如透明质酸(HA)、胶原蛋白VI(cIV)和许多它们的分解产物)的血清水平将由于改3t和复发的瘢痕形成而增加。血清丙氨酸和天冬氨酸转氨酶(ALT和AST)水平与纤维化并不良好相关。可是，具有记录的、持续正常ALT水平的患者，通常患有轻微，號的肝炎而没有或只有轻微阶段的纤维化。肝损伤(尤其是漫性肝损伤)状况中发现了Y-GT的增加。注意到Y-GT与纤维化良好相关。实施例2rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-FciM:抑制HSC细胞活化来抑制纤维发生为了阐明纤维发生中rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc的作用，检查了rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对由TGF-pi刺激的HSC细胞活化的作用。HSC活化是肝纤维发生的基本过程。它呈现为HSC的增殖和细胞外基质的改造，包括，基底膜中的胶原蛋白IV的,和过量细胞外基质组分(如胶原蛋白I和胶原蛋白m)的沉积，和MMP和TIMP表达的mRNA7K平的改变。TGF-pi是该过程中最重要的活化因子之一。材料和方法细胞本发明人《顿确立的被称作LX-2的人HSC细鹏。这些细胞己进行充分表征，并显示出许多与HSC初级培养物的相似性。rh核心蛋白聚糖从人成纤维细胞系中克隆全长核心蛋白聚糖基因，然后将基因插入pCDNA3.1载^(Invitrogen)并将基因与聚(组氨酸)(poly(histadine))尾在C-末端重组，以用于纯化。用重会顿粒转染Cos-7细胞。因为大多数核心蛋白聚糖被分泌入培养基，所以收集培养基并利用ProBond纯化系统(Invitrogen)进行核心蛋白聚糖纯化，其中用镍柱进行Ms-tag核心蛋白聚糖纯化。rh核心蛋白聚糖-Fc审!J备±核心蛋白聚糖-Fc的方法如实施例3戶腿。细胞增殖测定将LX-2细胞(2000/孔)接种于96L微量培养板中24小时。用补加有0.5%FBS的DMEM替代培养基并使细胞饥饿48小时。饥鹏，将培养基用补加了2%血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞单独地或在2n^mlTGF(31存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小时。通过测量染料3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-2,5二苯基四P^(MIT)的鈔来刑古细胞数目。基质金属蛋白膝2(MMP-2)的皿和基质金属蛋白酶组织抑制剂-l(TIMP-l)的mRNA水平MMP-2是能降解胶原蛋白IV的酶，而TTMP-1通过抑制由基质金属蛋白酶的降解而增加纤维化沉积。通过培养的LX-2细胞测量rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对MMP-2和TIMP-1mRNA表达的作用。将2><105个LX-2细胞接种于6-孑L细胞培养板24小时。然后用补加有0.5%FBS的DMEM替代培养基。使细胞饥饿24小时。饥饿后，将培养基用补加了2%血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞^^i也或在2ng/mlTGFpi存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc24小时。最后，收获细胞并用TRIZOL试剂(GIBCOL，MD，美国)裂解。然后根据厂商规程提取总RNA。进行RT-PCRo通过管,因——甘油醛-3-磷M5兑氢斷GADPH)，标准化MMP-2和TIPM-1的基因^ii7乂平。m型胶原蛋白蛋白水平的皿过量细胞外基质组分(如胶原蛋白m)的沉积是纤维发生期间的病理学过程。M培养的LX-2细胞测量rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc对胶原蛋白m表达的作用。将2xl05个LX-2细胞接种于6-孔细胞培养板24小时。然后用补加有0.5%FBS的DMEM替代培养基并使细胞饥饿24小时。饥饿后，将培养基用补加了2%血清的DMEM培养基替代。然后加入试剂处理细胞并将LX-2细胞在2ng/mlTGF(31存在的情况下暴露于rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc48小时。收获培养基并进行蛋白印迹以评估rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc对用TGF-pi处理的LX-2细胞的胶原蛋白m水平的作用结果增殖如图2所示，TGF-pi增加了LX-2细胞增殖。TGF-pi(2ng/ml)对LX-2的促有丝分裂作用被同时加入的rh核心蛋白聚糖(4ug/ml)或rh核心蛋白聚糖-Fc(lu^ml)消除了。因为lug/ml的rh核心蛋白聚糖-Fc育站到4ug/mlrh核心蛋白聚糖的同样效果，所以rh核心蛋白聚糖-Fc显示出增强的体外生物学活性，相对于核心蛋白聚糖为至少4倍。在不存在TGF-pi盼瞎况下，rh核心蛋白聚糖或rh核心蛋白聚糖-Fc^^虫都不对细胞增殖具有显著的作用。MMP-2禾口TIMP-1如图3和4所示，TGF-(31(2ng/ml)提高了LX-2中的MMP-2和TMP-l表达，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc抑制该提高。m型胶原蛋白图5显示了TGF-pi(2ng/ml)增加LX-2细胞培养基中m型胶原蛋白的蛋白水平，而rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc消除TGF-(31的作用。实施例3l.构建编码h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的基因融合蛋白从几个DNA片段组装而成。为了获得编码前导肽和人核心蛋白聚糖成熟蛋白的基因，从人成纤维细胞中提取总RNA，并进行RT-PCR以克隆核心蛋白聚糖。表3显示了用于克隆h核心蛋白聚lt-Fc融合蛋白的寡核苷列。根据厂商说明书，将产生的长度为约1077bp的DNA片随翻入定向TOPO克隆载体中，如pCDNA3.1(Invetrogen)。fflilDNA测序确证人核心蛋白聚糖基因序列。禾,从人淋巴细胞中帝恪的RNA和誠的5邻3'弓卿(表3)通过反转录禾卩PCR来获得编码人IgGl的Fc区或片段(Fc.sub..gamma.l)的基因。产生的Fc.sub..gamma.lDNA片段含IgGl的铰链、CH2和CH3结构域的部分序列，将该片MM入pGEM-TEasy载^(Promaga)中。通过DNA测序确证Fc基因序列。为了制备h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.l融合基因，用NotI从Fc质粒上切下Fc片段并琼月^^电泳*^屯化。用NotI在核心蛋白聚糖C-末端对核心蛋白聚糖质米i^行单1^刀割。然后将纯化的Fc片段插入核心蛋白聚糖质粒的切口以形成h核心蛋白聚糖-Fc.sub..gamma.l融合基因(图6)。融合基因包含核心蛋白聚糖、柔啦太接头和{針布的Fc.sub..gamma.l基因。用以下方齒針布Fc片段在RT-PCR期间fflil3'引物从Fc片段的C-末端去除4个氨基酸。在Fc片段l細入核心蛋白聚糖质粒中的切口后，将来自pGEM-TEasy和pCDNA3.1载体并编码10个氨基酸的序列引入到Fc片段C-末端。终止密码子也被弓l入到Fc片段C-末端(参见SEQIDNos.3和4)。表3引物名称序列核心蛋白聚糖正向弓|物5'CACCATGAAGGCCACTATCATCCTC3'核心蛋白聚糖反向弓l物5'CTTATAGTTTCCGAGTTGAATGGC3'IGG1FC正向引物5'ACTCACACATGCCCACCGT3'IGG1FC反向引物5，GAGAGGCTCTTCTGCGTG3'由pGEM-TEasy和pCDNA3.1载体J^共的杨。、蛋白聚糖C-末段和Fc片段N-末端之间的序列形成了柔啦太接头。核心蛋白聚糖和Fc部分之间存在肽接头增加了核心蛋白聚糖结构域的灵活性。对于本发明，肽接头具有以下有益特征它由长度为19的氨基酸乡贼，并包含2种颇多以下氨基酸甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸(SEQDDNo,6)。2在转染的细胞系中皿融合蛋白将重组pCDNA3.1表达载体质粒转染到哺乳动物宿主细胞系中，以获得hDecrin-Fc融合蛋白的表达。为了稳定的高水平的表达，的宿主细胞系是Cos-7。优选的转染方法是lipofectin^(Iiwitrogen)。转染后2天，将培养基用含0.6mg/ml的G418的生长培养基替换。M抗人核心蛋白聚糖和Fc蛋白印迹测试^^择药物的转染子的融合蛋白分泌(图7A和B)。产生高水平h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的孔被亚克隆。在Cos-7细胞中产生的重组h核心蛋白聚糖-Fc显示出与天然核心蛋白聚糖中发现的非常相似的糖胺聚糖模式。当在摩尔基础上与rHuEPO进行比较时，根据本发明表达并产生的h核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出增强的生物学活性。3.体外生物学测定在LX-2细胞中进行体外生物学测定以测试rh核心蛋白聚糖-Fc^3制HSC细胞活化而抑制纤维发生的作用(参见实施例2)。4.体外稳定性研究因为免疫球蛋白的Fc部分有长的半衰肌所以预计Fc融合蛋白能保持亲本蛋白的生物活性并比其亲本有更长的半衰期。M以下方法进行rh核心蛋白聚糖-Fc的稳定性测定收集转染了rh核心蛋白聚糖-Fc的Cos-7细胞的培养基并在37t:温育不同时间。将rh核心蛋白聚糖用作对照。用蛋白印迹测定rh核心蛋白聚糖-Fc和rh核心蛋白聚糖的稳定性。图8显示了，核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的糊军率低于核心蛋白聚糖，其中50%的rh核心蛋白聚糖在5天后降解，而仅有25%的rh核心蛋白聚糖-Fc在5天后(^军。SEQIDNo.1长度660类型DNA生物智人(Homosapiens)序列1actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctc60ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg120gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtg180gaggtgcataatgccaagacaaagecgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg240gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaag300gtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag360ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccag420gtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag480agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggc540tccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtc600ttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctca660SEQIDNo.2长度220类型PRO生物智人(Homos叩iens)序列2ThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGlyGlyPro151015SerValPheIxuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSer202530ArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAsp354045ProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsn505560.AlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgVal65707580ValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGlu859095TyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys100105110ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyrThr115120125LeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSerLeuThr130135140CysLeuValLysGlyPheTyrProSerAspHeAlaValGluTrpGlu145150155160SerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProValLeu165170175AspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLys180185l卯SerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGlu195200205AlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSer210215220SEQIDNo.3长度33类型DNA生物人工的接头序列3atcactagtg肌ttcgcggccgctegagtctag33SEQIDNo.4长度10类型PRO生物人工的序列4lieThrSerGluPheAlaAlaAlaArgVal1510SEQIDNo.5长度57类型DNA生物人工的序列5aagggtcaagacaattctgcagatatccagcacagtggcggccgcgggaattcgatt57SEQIDNo.6度19型PRO物人工的列6LysGlyGinAspAsnSerAlaAsplieGinHisSerGlyGlyArgGly151015AsnSerlieSEQIDNo.7长度1077类型DNA生物智人(Homosapiens)序列7atgaaggccactatcatcctccttctgcttgcacaagtttcctgggctggaccgtttcaa60cagagaggcttatttgactttatgctagaagatgaggcttctgggataggcccagaagtt120cctgatgaccgcgacttcgagccctccctaggcccagtgtgccccttecgctgtcaatgc180catcttcgagtggtccagtgttctgatttgggtctggacaaagtgccaaaggatcttccc240cctgacacaactctgctagacctgcaaaacaacaaaataaccgaaatcaaagatggagac300tttaagaacctgaagaaccttcacgcattgattcttgtcaacaataaaattagcaaagtt360agtcctggagcatttacacctttggtgaagttggaacgactttatctgtccaagaatcag420ctgaaggaattgccagaaaaaatgcccaaaactcttcaggagctgcgtgcccatgagaat480gagatcaccaaagtgcgaaaagttactttcaatggactgaaccagatgattgtcatagaa540ctgggcaccaatccgctgaagagctcaggaattgaaaatggggctttccagggaatgaag^00aagctctcctacatccgcattgctgataccaatatcaccagcattcctcaaggtcttcct660ccttcccttacggaattacatcttgatggcaacaaaatcagcagagttgatgcagctagc720ctgaaaggactgaataatttggctaagttgggattgagtttcaacagcatctctgctgtt780gacaatggctctctggccaacacgcctcatctgagggagcttcacttggacaacaacaag8;0cttaccagagtacctggtgggctggcagagcataagtacatccaggttgtctaccttcat900aacaacaatatctctgtagttggatcaagtgacttctgcccacctggacacaacacc咖960aaggcttcttattcgggtgtgagtcttttcagc助cccggtccagtactgggagatacag1020ccatccaccttcagatgtgtctacgtgcgctctgccattcaactcggaaactataag1077长类生序SEQIDNo.8长度359类型PRO生物智人(Homosapiens)序列8MetLysAlaThrlieHeLeuLeuLeuLeuAlaGinValSerTrpAla151015GlyProPheGinGinArgGlyLeuPheAspPheMetLeuGluAspGlu202530AlaSerGlylieGlyProGluValProAspAspArgAspPheGluPro354045SerLeuGlyProValCysProPheArgCysGinCysHisLeuArgVal505560ValGinCysSerAspLeuGlyLeuAspLysValProLysAspLeuPro65707580ProAspThrThrLeuLeuAspLeuGinAsnAsnLyslieThrGluUe859095LysAspGlyAspPheLysAsnLeuLysAsnLeuHisAlaLeulieLeu100105110ValAsnAsnLyslieSerLysValSerProGlyAlaPheThrProLeu115120125ValLysLeuGluArgLeuTyrLeuSerLysAsnGinLeuLysGluLeu130135140ProGluLysMetProLysThrLeuGinGluLeuArgAlaHisGluAsn145150155160GlulieThrLysValArgLysValThrPheAsnGlyLeuAsnGinMet165170175HeVallieGluLeuGlyThrAsnProLeuLysSerSerGlylieGlu180185190AsnGlyAlaPheGinGlyMetLysLysLeuSerTyrlieArglieAla195200205AspThrAsnlieThrSerHeProGinGlyLeuProProSerLeuThr210215220GluLeuHisLeuAspGlyAsnLyslieSerArgValAspAlaAlaSer225230235240LeuLysGlyLeuAsnAsnLeuAlaLysLeuGlyLeuSerPheAsnSer245250255HeSerAlaValAspAsnGlySerLeuAlaAsnThrProHisLeuArg260265270GluLeuHisLeuAspAsnAsnLysLeuThrArgValProGlyGlyLeu275280285AlaGluHisLysTyrlieGinValValTyrLeuHisAsnAsnAsnlie2卯295300SerValValGlySerSerAspPheCysProProGlyHisAsnThrLys305310315320LysAlaSerTyrSerGlyValSerLeuPheSerAsnProValGinTyr325330335TrpGluHeGinProSerThrPheArgCysValTyrValArgSerAla340345350lieGinLeuGlyAsnTyrLys355尽管本发明已结合各种附图的优选实施方案进行了描述，然而要理解的是，可用其他相似的实施方案，或可对所述实施方案进行修改或添加从而执行本发明的相同功能，而不偏离它。所以，本发明不应限于倒可单一的实施方案，而可根据附加权禾腰求书所弓间的宽度和范围来解释。权利要求1.用于抑制肝纤维发生的方法，该方法包括向需要该治疗的患者施用有效量的肝星形细胞活化的rh核心蛋白聚糖-Fc拮抗剂。2.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂防止病毒性肝炎和域诱发的肝损伤病程中肝纤维化的发展。3.权利要求1的方法，其中所述拮抗剂防止慢性肝炎和域诱发的肝损伤病程中肝纤维化的发展。4.权利要求1的方法，其中所述拮抗齐提与肝星形细胞活化相关的纤维变性状况的拮抗剂。5.权禾腰求l的方法，其中戶诚拮抗剂是核心蛋白聚糖融合蛋白。6.权利要求5的方法，其中所述融合蛋白是由核酸分子编码的，其包含通过肽接头相连的核心蛋白聚糖和IgGI1Fc片段。7.权利要求6的方法，其中所述含19个氨基酸的肽接头出现在rh核心蛋白聚糖和其中的人IgGlFc之间；而^js;M肽接头含8销自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的氨基酸。8.权利要求6的方法，其中所述人IgGlFc含有N-末端调节的人IgGl的铰链、Cffi和CH3结构域的部分。9.权利要求6的方法，其中戶脱rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出增强的体外生物学活性，其相对于核心蛋白聚糖为至少4倍。10.权禾腰求6的方法，其中所述rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白显示出比其亲本蛋白——核心蛋白聚糖更长的寿命。11.生产rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的方法，其包括使用能在其生长培养基中以在48小时时间段内超过每百万细胞10.mu,g来产生rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白的Cos-7细胞系。12.制备含rh核心蛋白聚糖、柔啦太接头和{針布的人IgGlFc的重组融合蛋白的方纟去，其包括以下步骤产生Cos隱7细鹏；禾口，在其生长培养基中以在48小时时间段内超过每百万细胞lO.mu.g来皿重组蛋白的条件下，使细胞系生长，其中所述重组融合蛋白显示出增强的体外生物学活性，其相对于核心蛋白聚糖为至少4倍，而没有不希望的副作用。13.权利要求12的方法，其中所述人IgGFc包含N-末端有l針布的人IgGl的铰链、CH2、和CH3结构域的部分，其中IgGlFcN-末端的4个氨基酸SPGK被10个氨基酸ITSEFAAARV替代。全文摘要本发明涉及通过直接施用重组的rh核心蛋白聚糖和rh核心蛋白聚糖-Fc融合蛋白来体外和/或体内抑制肝纤维发生的方法。在一个实施方案中，提供了介于核心蛋白聚糖(Decorin)和Fc铰链片段之间的接头，以形成融合蛋白，所述融合蛋白增加核心蛋白聚糖的生物学活性，并增加与TGF-β结合的能力，以及延长核心蛋白聚糖在血清中的寿命，其中Fc铰链片段是Fc的修饰形式，其包括用能延长核心蛋白聚糖-Fc蛋白寿命50％的10个不同的氨基酸替换4个N-末端氨基酸。文档编号C12N15/12GK101115839SQ200580037190公开日2008年1月30日申请日期2005年7月18日优先权日2004年8月30日发明者孔祥复,张碧源,张雅鸥,杨梦甦,郑思敏申请人:杨梦甦;孔祥复;张雅鸥;郑思敏;张碧源