专利名称：通过在衣藻中异源表达ⅱ型nad(p)h脱氢酶来生产氢气的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种提高莱茵衣藻(CWaw;;cfowcw氾"z'w/za^to')制氢的技术。
背景技术：
氢气是化学工业的基本原材料，并且也是一种据称将在下一个十年扮演主要角色的燃料。 注氢燃料电池有可能通过氢气与空气中的氧反应，从而以不产生污染的方式来产生电能，同 时产生的废物仅仅是水蒸汽。在燃料电池领域的技术进步使得它们的大规模应用可日益预见。
然而，当前使用的大多数氢气是从矿物能资源比如石油或碳制造出来的，该技术本身会 产生污染，比如由天然气或者裂解石油或碳来催化转化碳氢化合物。
所以人们渴望提供一种有成本效率的工艺，用于从可更新的并且是清洁的一次能源来生 产氢气(不释放温室气体)。
某些属于栅藻属(Sce"eA^mw)、绿球藻属(C7z/oracocciW7)、小球藻属(C/z/we〃a)(绿 球藻目(order Chlorococcales))、叶被藻属(丄o6oc/z/a，)禾口衣藻属(C/z/薩少(io腳腿)(团 藻目(order Volvocales))的单细胞绿藻，比如莱茵衣藻(C/z/awycfowo"cw w/"/za^to')，能够 使用水作为电子和质子供体从太阳能生产氢气。
在这些藻类中，通过具有很强的特异活性的铁氢化酶生产出氢气。该酶经由通用的电子 传送体铁硫蛋白与PSI光合电子传递链相联系。制氢所需电子可以通过PSII活性(路径A)、 或者通过经由质体醌的非光化学还原使用碳储备(路径B)而提供给PSI。这两个路径如
图1 所示。
图l说明实线所示为依赖PSII的路径A;虚线所示为非PSII依赖性的基于质体醌还 原的路径B。
PSI:光系统I; PSII:光系统II; RuBP:核酮糖1，5-二磷酸酯；LHC:集光复合体； FNR:铁硫蛋白NADP还原酶；Fd:铁硫蛋白；Pc:质体蓝素；Cytb6:细胞色素b6; cytf:
细胞色素F; NDH: NADH-脱氢酶；PQ(H)2:质体醌醇；Qa:苯醌a; P680和P700: PSI和 PSII的反应中心。
在自然条件下，H2生产仅仅是瞬时现象。实际上，氢化酶对02很敏感。现在，水的光 解作用发生在光系统II内部，其供给电子用于经由路径A的H2生产，也产生02，这会导致
氢化酶的快速抑制。
为了解决这些问题，人们提出了多种解决方案。第一种方案是在黑暗中生产，其余的方 案是基于部分路径B使用光进行生产，其不同于路径A，不会导致氧的产生。
例如，美国专利4,532,210描述了一种工艺，交替进行光照和黑暗阶段。在光照期间，藻 类产生02，并且累积通过光合作用产生的烃基储备物。然后在黑暗阶段在缺氧状态下使用这 些储备物，以便生产氢气。该方法要求用氮气吹扫，以便完成厌氧生活。在黑暗中生产H2 的效率也受到限制，比在光下生产低一个数量级。
美国专利申请2001/0053543描述了一种基于利用缺硫实现光系统II可逆抑制的工艺。 该工艺包含光照下于具有普通含硫量的培养基中培养绿藻、以便使得基于碳氢化合物的储备 物形成累积的步骤，以及包含在密封容器内于缺硫培养基中进行光照培养的步骤。光系统II 的抑制导致通过光合作用产生氧气的延滞。当藻类(其呼吸不受缺硫抑制)耗尽所有培养基 中的氧时，它们变为厌氧性，并且消耗由于光合作用而产生的基于碳氢化合物的储备物，从
而生产出H2。存在硫和缺硫的培养阶段的交替，使得暂时分离产生02和产生H2的光照阶段
成为可能。
美国专利申请2003/0162273提出了一种用于导致缺硫而抑制光系统II的交替方法；其 包括使用叶绿素体硫酸盐渗透酶表达不足的基因修饰藻类。
如上所述的方法使得通过分离02的生产和H2的生产来防止铁氢化酶抑制成为可能。然 而，通过如上所述三种方法制氢有一定限制。第一方法是基于藻类在黑暗中的发酵活力，是 一种导致仅有勉强够格产量氢气的相对无效的现象。第二和第三种方法是基于路径A和B的 并列功能。路径A伴随有氧气释放，必须保持在低于呼吸的02消耗水平，以便保持缺氧状 态。路径A因此受藻类呼吸量的限制。路径B的贡献显著但有限。
发明内容
本发明的目的是提高第二路径(B)的产率。为此目的，本发明人想到在叶绿体中使用 II型NADH脱氢酶用于促进质体醌还原反应。
I和II型NADH脱氢酶是能够还原电子传递链的醌类的酶。它们与线粒体和细菌呼吸链 相联系(KERSCHER， Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283， 2000)。
I型NADH脱氢酶(NDH-I)是多体跨膜复合物，包括14至约50个亚基。该类复合物 仅氧化NADH，并且具有相关联的质子泵活性。
II型NAD(P)H脱氢酶(NDH-II)是氧化还原酶类的单体酶，分子量在30和60 kDa之
间，并且通过氧化NADH或NADPH，能够还原植物和酵母细菌呼吸链或线粒体链的醌类。 也有人建议将它们与植物和藻类的光合链相结合，但迄今为止未见描述。该类酶在动物界不 曾有描述。
在高等植物叶绿体中，功能性NDH-I复合物的存在已经被论证(BURROWS等，EMBO J. 17: 868-876， 1998; SAZANOV等，Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 1319-1324， 1998; HORVATH 等，Plant Physiol.123: 1337-1349， 2000)，并且也有人建议了 NDH-II型活性的存在 (CORNEILLE等，Biochim. Biophys. Acta 1363: 59-69， 1998)。在莱茵衣藻中，缺乏编码叶 绿体NDH-I复合物的基因。然而，有人建议了 NDH-II型活性的存在(COURNAC等，Int. J. Hydrog. Energy 27: 1229-1237， 2002; PELTIER禾卩COURNAC， Annu. Rev. Plant Biol. 53: 523-550， 2002)。
因此本发明的一个目的在于使用II型NAD(P)H脱氢酶(NDH-II)，或者使用编码所述 蛋白质的多聚核苷酸，以提高绿藻生产氢气的能力。
根据本发明的一个优选实施方式，所述绿藻是单细胞绿藻，优选选自绿球藻目，进一步 优选为栅藻属(&e"ec/e^z^)、绿球藻属(CWoracocawz)和小球藻属(CWwe〃a)，以及团 藻目(Fo/wca/es)，更进一步优选为叶被藻属(丄o6ocWaww)和衣藻属(CWam少ctowo"tw)。 根据本实施方式的一个优选方案，所述藻类属于衣藻属。优选所述藻类属于莱茵衣藻 (CWamjY/omo/itxs1 reZn//(m//7/)。
"NDH-II"定义为任何一种下述黄素酶，其具有
a) 对所有NAD(P)H脱氢酶通用的特性，即i)能够使用FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)或 者FMN (黄素单核苷酸)作为黄素辅助因子，通过NADH或NAD(P)H的氧化来催化电子传 递链的醌类的还原，以及ii)其序列中存在至少一个拷贝的共同基序(consensus motif) GxGxxG，其对应于黄素辅助因子和NAD(P)H的结合部位，其中"G"代表甘氨酸，而"x" 代表任何氨基酸；
b) 对II型NAD(P)H脱氢酶特异的特性，即呈30 60kDa单体形式或同源二聚体的活性， 不进行任何跨膜质子转运的行为，以及具有对鱼藤酮不敏感的活性。
关于NDH-II的详细文献，尤其可以参考YAGI的文献(J. Bioenergetics Biomembranes 23: 211-224， 1991)、 KERSCHER的文献(Biochim. Biophys. Acta 1459: 274-283， 2000)，以 及MELO等的文献(Microbiol Mol Biol Rev. 68: 603-616， 2004)。
因此本发明人使用了来源于根癌农杆菌(NCBI的登记编号AI2824; SWISSPROT登记 号Q8UDU6)的NDH-II、也是指下文中的Agtundh2。编码该酶的核苷酸序列表示为附后
的序列表中编号SEQIDNO: l所示序列，并且编号SEQIDNO:2所示为推导的多肽序列。 实施本发明可以使用的其它NDH-II，该NDH-II源于但不限于下述例子安氏嗜酸两
面菌(爿c/A'a"i^ aw6/va/e/w， AJ489504 )、 谷氣酸棒杆菌 (Gorj^e6tfcfc〃.WAw g/wZ"m/cw/n,
CAB41413.1)、大肠杆菌(&c/zmWz/aco//，NP_415627)、集胞藻(Sywec/wc^fe平，HOWITT
等，J. Bacteriol 181 (13): 3994-4003， 1999; ORF slrl743: BAA17783)、莫氏单胞发酵菌 (Zymowo"cw wo6/fc， AAD56918)、枯草杆菌(5ac/〃w ra6"to， NP_389111)、葡萄固氮菌 (v4zoto6a"er W"e/a滅，AAK19737)、布氏锥虫(7)"，膽o扁6潔e/， AAM95239.1)、马铃
著(So/anwm rt/6eraswm， CAB52796.1， CAB52797.1)、酉良酒酵母(Sacc/ aram少ces cerevWae， (YML120C (NP—013586)、 YMR145c (NP—013865.1 )、 YDL085w (NP—010198.1 ))、粗糙
链孢霉(A^wm^oracra^a， CAB41986、 EAA27430)和解脂耶氏酵母(:FamnWa/*o/_y"ca，
XP一505856)。
有利的是，也可以使用内源性莱茵衣藻NDH-II。编码假定的NDH-II的序列已经在莱 茵衣藻基因组的完整序列中得到鉴定，该完整序列参见网址 "http:〃genome,jgi-psf.org/chlre2/chlre2.home.html" ， NDH-II序列标识符为C—310108 、 C—1170009、 C_5950001、 C_1890016、 C_1450028、 C—1450029和C—270109。以该序列为基 础，本发明人鉴定了有效编码NDH-II的序列。以下简称该序列为N2Cr2，在附后的序列表 中由编号SEQIDNO: 3表示，并且推导的多肽序列，称作N2Cr2，由编号SEQ ID NO: 4 表示。
本发明人克隆并表达了对应于序列SEQ ID NO: 3第199-1857位核苷酸的N2Cr2片段(因 此编码对应于序列SEQ ID NO: 4的第67-619位氨基酸的多肽)，并且显示出由该相应于定 位于叶绿体的NDH-II的片段编码的多肽。
NDH-II的N2Cr2和显示出NAD(P)H脱氢酶活性的任何蛋白质片段，以及编码所述 NDH-II或者所述片段的多聚核苷酸，也是本发明主题的一部分。
如上所述的某些NDH-II具有对NADH的优先亲和性。虽然NADH和NADPH都存在 于叶绿体中，但NADPH为主要表现形式。为了提高在叶绿体的环境中优先使用NADH的 NDH-II效率，本发明人想到对这些酶进行修饰，以便提高它们的用于NADPH的效率。
本发明人进行了对Agtundh2的定点突变，并且显示出在优先使用NADH的酶中，用中 性的极性残基取代酸性残基(对Agtimdh2而言为谷氨酸)的取代物定位于吡啶-核苷酸结合 的卩-a-(3基序(也称为"Rossman motif (罗斯曼基序)")的第二卩-折叠(卩-sheet)末端， 正如在优先使用NADH的酶中于相同位置遇到的情况，这使得提高它对NADPH的亲合力成
因此本发明的一个主题也是从优先使用NADH的NDH-II得到的NDH-II突变体，该突 变是通过用中性的极性残基取代位于吡啶-核苷酸结合的(3-a-|3基序的第二 P-折叠末端的谷氨 酸或天冬氨酸残基而实现，优选谷氨酰胺或者天门冬酰胺残基。
这些残基例如对应于Agtundh2序列(SEQIDNO: 2)的201位，并且对应于N2Cr2序 列(SEQIDNO: 4)的285位。
图2所示为在吡啶-核苷酸结合位点水平上的多种NDH-II的序列对比。(3-a-P基序的共 有序列(consensus sequence)表示在序列对比下面；①代表亲水残基；A代表疏水残基，#代 表位于第二P-折叠末端的残基；正是NDH-II中的酸性残基优先使用NADH，并且NDH-II 中的中性极性残基优先使用NADPH (例如，如图2对比所示，NDH-II如ST - NDB1和 NC-NDE1在该位置具有谷氨酰胺残基)。
本发明的一个目的在于提供了一种用于提高绿藻生产氢气的能力的方法，其特征在于， 包括用编码如上限定的NDH-II的多聚核苷酸对所述藻类进行基因转化，以及在所述藻类中 表达所述NDH-II。
为了实施本发明，将使用普通的基因工程技术。 一般通过将编码希望表达的NDH-II的 多聚核苷酸设置于合适的表达调控序列(特别是转录启动子和终止子)支配之下，从而构造 出表达盒(expression cassette)。优选将所述编码NDH-II的多聚核苷酸融合于叶绿体靶向序 列。
另外，该表达盒也可以包含转录和/或翻译调控元件，其中，特别提到由转录加强基因或
者沉默子、前导序列、聚腺苷酸化序列等制成的调控元件。
然后将这样得到的表达盒插入到合适的载体中，用来转化选择的宿主生物体或细胞。 可以用来转化绿藻的多种工具和方法已知在它们本身之内，并且可以用于实施本发明(请
参照ROCHAIX等，衣藻中叶绿体和线粒体的分子生物学，KluwerAcademic出版社，荷兰，
1998)。
作为可用于本发明的表达调控序列(启动子、终止子等)和叶绿体耙向序列的非限制性
实施例，将由下述成员制成
-对于细胞核表达，有启动子、终止子和编码RUBISCO (二磷酸核酮糖羧化酶/氧合酶) 的RbcS2基因的耙向肽小亚基(GOLDSCHMIDT-CLERMONT和RAHIRE， J. Mol. Biol. 191: 421-432， 1986)、编码叶绿体ATP合成酶的Y亚基的AtpC基因(QUINN和MERCHANT, Plant Cell 7: 623-638， 1995; KINDLE禾卩LAWRENCE Plant Physiol. 116: 1779-1791， 1998)
和编码质体蓝素的Pe伍基因(QUINN和MERCHANT, 1995，同上；KINDLE, Plant Mol. Biol. 38: 365-377， 1998)，它们可以进行不同的组合；并且
-对于在叶绿体内表达，有启动子、终止子和编码RUBISCO大亚基的RbcL基因的靶向 肽、编码ATP合成酶的p亚基的AtpB基因和编码光系统II的Dl亚基的PsbA基因 (BATEMAN和PURTON， Mol. Gen. Genet 263: 404-410， 2000)。
作为可以用于本发明的可选择标记的非限制性实施例，将由下述成员制成 -对于细胞核表达，有编码衣藻精氨琥珀酸裂解酶的Arg7基因，其与缺乏精氨酸因此是 精氨酸营养缺陷型的突变体互补(DEBUCHY等，EMBOJ. 8: 2803-2809, 1989);编码衣藻 硝酸还原酶的Nit 1基因，其与因缺乏而因此不能用硝酸盐作为唯一氮源生长的突变体互补 (KINDLE等，J. Cell Biol. 109: 2589-2601， 1989);编码源于衣藻的烟酰胺涉及生物合成的 酶的Nic7基因，其与因缺乏而因此为烟酰胺营养缺陷型的突变体互补(FERRIS， Genetics 141: 543-549， 1995);编码衣藻光系统II的亚基的Oeel基因，其与严格异养型的突变体互补 (MAYFIELD和KINDLE, Proc. Natl, Acad. Sci. USA. 87: 2087-2091， 1990);编码源于大肠 杆菌的氨基糖苷腺嘌呤转移酶的aadA基因，其使任何衣藻属菌株具有大观霉素和链霉素抗性 (CERUTTI等，Genetics. 145: 97-110， 1997);编码源于辛氏链异壁菌(S,丰oa胁Zc/m /n'm/^tom^)的博来霉素结合蛋白的ble基因，其使任何衣藻属菌株具有腐草霉素抗性 (STEVENS等，Mol. Gen. Genet. 251: 23-30， 1996);而编码抗生素抗性的基因必须是在源 于衣藻的调控序列比如RbcS2的支配下表达；并且
-对于在叶绿体内表达，有突变体补体，该突变体通过在编码光合链蛋白质的基因中删 除或者插入嵌合DNA片段所携带的天然基因而得到，例如编码PSII亚基的psbH基因 (BATEMAN和PURTON， Mol. Gen. Genet. 263: 404-410， 2000);编码源于大肠杆菌的氨 基糖苷类腺嘌呤转移酶的aadA基因，其使菌株具有链霉素和大观霉素抗性；和编码源于鲍曼 不动杆菌"c/"Wo^"w 6做m朋/0的氨基糖苷类磷酸转移酶的a-6基因，其使菌株具有卡那 霉素和氨丁卡霉素抗性。
绿藻的转化可以通过多种方法进行，例如，通过玻璃珠转化将DNA插入细胞核基因组 (KINDLE, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 1228-1232， 1990)，通过基因枪法(biolistics) 转化(DEBUCHY等，EMBOJ. 8: 2803-2809， 1989)，以及通过电穿孔法(electroporation) 转化(SHIMOGAWARA等，Genetics, 148: 1821-1828， 1998)。
对于叶绿体DNA的转化以及在叶绿体内表达，使用由与叶绿体基因组序列同源的序列 所决定、并且对应于基因组中性区(neutral zones,非编码和非调控性区)的DNA，该插入
物可以优选通过同源重组制备，并且使用如上所述转化技术用于插入细胞核基因组中，特别 是使用基因枪法产生了最好的收率。
本发明还涉及用编码如上限定的NDH-II的多聚核苷酸转化的绿藻。
根据本发明的绿藻可以在与未转化的绿藻相同的条件下用于制氢。它们例如可以用于比 如是如上所述专利US4,532,210或者专利申请US2001/0053543所描述的工艺。
通过以下附加的描述，可以更彻底地理解本发明，以下内容是指非限制性实施例，其显 示了农杆菌"gra6""en'ww)的NDH-II与莱茵衣藻光合作用电子传递链的互相作用能力， 以及还原质体醌的能力，并且阐明了用编码所述NDH-II的多聚核苷酸转化莱茵衣藻的技术。
具体实施例方式
实施例l:在大肠杆菌中克隆和表达根癌农杆菌NDH-II I-分离NDH-II基因
使用下述引物对，从根癌农杆菌(菌株C58)基因组DNA扩增编码根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens， NCBI登记号No.: AI2824; SWISSPROT登记号No.: Q8UDU6) 的NDH-II的Agtundh2基因 上游N2Ag.mfe.F
CGCC^r7UATGCAAGAACATCATGTT (SEQIDNO: 5) 下游N2Ag.6His.PstR
6)
将m/el和尸Wl (斜体)限制性酶切位点插入上游和下游引物中，分别位于起始和终止密 码子(粗体)的上游和下游。由6个组氨酸密码子(下划线)组成的标签插入终止密码子上 游。在下列条件下进行扩增 -疲源她
含有1.5 mM MgCl2的特定反应缓冲液
引物终浓度0.5 ^iM
dNTP混合物终浓度200 pM
300 ng的DNA
1.5单位的高保真耐高温Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(罗氏公司)
-r谱条伴，
95 。C下3 min， 80 。C下1 min: 1个循环
95。C下lmin， 70 。C下1 min (每循环-0.5。C)， 72 。C下2 min: 20个循环 95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 。C下2 min: 10个循环 72。C下6min: 1个循环。
扩增产品包括编码NDH-II的序列，以及，6个组氨酸密码子所组成的标签的编码序列 的3'端。
II-在大肠杆菌中表达和纯化
1- 克隆
用m/e/和尸W/消化扩增产品(新英格兰生物实验室(New England Biolab)，供应商的推 荐方案)并且通过连接反应(连接酶购自新英格兰生物实验室，供应商的推荐方案)导入用 五coi /禾Q尸W/消化的表达载体。
该载体pSD80，携带有氨苄抗性盒(ampicillin-resistance cassette),强有力的Taq启动子 和LaqiQ抑制基因(Laq iQ repressor gene) (PATEL禾P DUNN， J. Bacteriol. 177: 3917-3922， 1995; SMITH等，Biochem.35: 8805-8814， 1996)。
然后通过电穿孔将连接反应产品导入大肠杆菌E co//DH10p。
然后通过使用如上所述相同引物和相同条件的PCR筛选氨苄抗性转化体证实，以便证实 爿g加"W2基因的存在。
然后使用对pSD80载体具有特异性的引物以及^g/w"^2基因内的引物，通过测序来检 验该构建体。
pSD80.F 5'陽GAGCTGTTGACAATTAAT-3' (SEQIDNO: 7)
pSD80.R 5'-AGGACGGGTCACACGCGC - 3' (SEQIDNO: 8)
N2Ag.307.F 5'-TGGCCACCGGCGCGCGT陽3' (SEQIDNO: 9) N2Ag.650.f 5'-TGCGAAGGAAGCGCTTGA-3' (SEQIDNO: 10) N2Ag.901.R 5'-TTCCTGATTGACCGCGG陽3' (SEQIDNO: 11)
在证实序列并且校正插入物后，将该质粒命名为pSDN2Ag6H，并且用来通过电穿孔方 法，与携带有6条大肠杆菌中最稀有的tRNAs的载体(pRare， Novagen) —起共转化 (cotransform) co//DH10(3菌株。
挑选出一种有氨苄青霉素和氯霉素抗性的共转化体(cotransformant)，用于表达并且纯化 NDH-II6His蛋白质。
2- 表达
在2.5 L锥形烧瓶中装入体积为1 L的含氨苄青霉素和氯霉素LB(LuriaBertani)培养基， 将预培养15 h的培养物按1/50的体积比接种，并于37 °C下振荡培养，直至0.5倍的光密度。 用0.5 mM异丙基-(3-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导NDH-II 6His表达，进行2h。 然后通过离心收集细胞，并且用新培养基冲洗，并在-80。C下储藏。 3-纯化
纯化方案已由BJOERKLOEF等公布(FEBS Letts.， 467: 105-110， 2000)。 细胞解冻并且再悬浮于2.5mMEDTA、 0.2 mM PMSF (苯基亚甲基磺酰基氟化物)、200
mMpH8的Tris-Cl中，浓度大约为1 g每10 ml。添加300吗/ml溶菌酶，并且在冰浴中将
混合物保温1 h。
然后将悬浮液在120 000 x g下离心60 min。通过在10 mM磷酸钾缓冲液，pH 8中再悬 浮，对所得小粒进行渗透性振荡处理，该缓冲液含有2 mM EDTA和0.2 mM PMSF，并且用 珀特匀浆器(Potterhomogenizer)匀浆，然后再次离心(60min， 120 000xg)。
细胞膜部分在上述缓冲液中被吸收，并且被珀特匀浆器珀特均质化。然后通过添加十二 垸基麦芽糖苷(DM)使细胞膜溶液化，终浓度为0.2% (重量/体积)，并且清洁剂/蛋白质比 率为0.1 ，并且NaCl终浓度为500 mM。搅拌悬浮液并且冰浴保温30 min，然后离心(60 min， 120 000 x g)。
在4。C下，利用色谱系统(Ak仏FPLC， Amersham Biosciences, Uppsala)，通过在镍柱 (HiTrap螯合柱5 ml， Amersham Biosciences， Uppsala)上的中压亲和色谱法进行酶的纯化。 用含有500 mMNaCl、 0.2% DM和20 mM咪唑的50 mM磷酸钾缓冲溶液(pH7.5)对该柱 进行第一次预平衡。加载样品后，用不含咪唑的上述溶液冲洗该柱(溶液A)，以便除去全部 未结合的蛋白质。最后用浓度提高的含有250 mM咪唑的溶液(溶液B)洗脱柱子。在多种 比例的浓縮咪唑溶液(10%、 15%、 50%、 100%)下，各收集5ml洗脱液。
通过荧光检测到的蛋白质峰出现在咪唑浓度125 mM的色谱上(图3A)。通过13%丙烯 酰胺凝胶电泳，在变性条件(SDS-PAGE)下，分析了各收集组分(26-29)的蛋白质含量(图 3B)。为了作对比，也分析了对应于起始总洗脱组分(T)并且也对应于可溶性组分(S)和 细胞膜(M)组分的样品。
然后将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，并且用指示聚组氨酸(polyhistidine sequence)序 列的单克隆第一抗体(Sigma公司)，通过免疫印迹作标记，标记lh，然后用指示小鼠IgGs 的第二抗体与碱性磷酸酶偶联，也偶联1 h。
在图3B (29)中，可观察到有用抗体标记的明显条带存在，其分子量中小于50kDa，相
应于预期大小的蛋白质(44 kDa)。该蛋白质发现于细胞膜组分(M)，并且不存在于可溶性 组分(S)中。
通过超滤将组分29浓缩至体积900)^1。添加220ial体积的纯甘油，并且将酶在-80 °C下 储藏。在SDS-PAGE凝胶上，通过与BSA (牛血清白蛋白)标准范围相比，估计出酶浓度。 III-酶的表征 1 -辅酶分析
通过FANG和BEATTIE描述的荧光测定法(Biochem. 41: 3065-3072， 2002)测定辅酶 的性质。将纯化的酶加热至沸腾保持3 4min，然后离心。
使用150 x 4.6 mm的Supelcosil LC-DP柱(Supelco)，通过高压液相色谱分析上清液。流 动相由80%含0.1% TFA的水和20%含0.1% TFA的40%乙腈组成。室温下在柱中的流量是1 ml/min。将荧光检测器的激发和发射波长分别调节在450和525 nm。平行分析了 FAD (Sigma 公司)和FMN (Sigma公司)标准样。
在图4中可见，酶样(N2Ag)的发射峰精确地对应于FAD标准样的峰。
这些结果表明，根癌农杆菌NDH-II的辅助因子是FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)。 2-测量细菌细胞膜上的酶活性
在接下来的实验中，测定该酶把电子转运到大肠杆菌呼吸链的能力。
使用来源于缺乏NDH-I和NDH-II的大肠杆菌菌株细胞膜，分析根癌农杆菌NDH-II的 活性"wo5::丰7)。
在50 ml LB-四环素中培养大肠杆菌菌株ANN0222(亲本AN398; WALLACE和YOUNG， Biochim.Biophys. Acta. 461: 84-100， 1977)，直至指数生长期结束(OD = l)。然后通过离心 (15 min， 3200 x g)收集细胞，并且用10 ml含有200 mM pH 8的Tris-Cl、 2.5 mM EDTA 和0.2 mM PMSF的溶液洗涤两次。然后使它们在16 000 psi的压力下两次通过French压机， 使其破壁。
通过离心(30 min， 48 500 x g)回收细胞膜组分，并且再悬浮于200 分析用缓冲液(50 mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，禾B 150mMNaCl)。
通过克拉克电极(Clark electrode, DW2/2， Hansatech， King's Lynn，英国)的手段测量 大肠杆菌ANN0222细胞膜的O2消耗。在添加纯化酶后，该方法使得测定其特异活性成为可 能。
含有10 |al细菌细胞膜和1.5 pi纯化酶(保持在1 mg/ml)的反应混合物在用990 ^分析 用缓冲液(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，和150 mM NaCl)稀释前，在冰浴中预保温lOmin，
并且由吸量管导入电极的分析腔。在提高作为电子供体的NADH或NADPH浓度情况下，25 °C下进行反应。
通过以下无细菌细胞膜时的反应，可以看出该酶显示出了直接的02摄取活性。在SOD 和过氧化氢酶存在情况下进行了较大程度还原的后者，与活性氧种类的形成有关系(图5)。
为了仅仅测量细胞膜相关联的呼吸性氧化酶活性，在反应混合物中添加了过氧化氢酶 (1000U/ml)和超氧化物歧化酶(SOD) (500U/ml)。当存在酶-细胞膜混合物时，在冰浴中 保温10 min后，使二苯撑碘翁(DPI)的抑制效果定量化。在200 NADH或者2 mM NADPH 存在情况下，测定抑制动力学。
农杆菌NDH-II的最大活性(Vmax二5(^Tiol02.min".mg-'蛋白质)是在文献中描述的其 它NDH-II的相同数量级范围之内。在生理pH下，该酶具有对NADH较强的亲合力(Km = lOpM)(图6A)，和对NADPH并非无关紧要的亲合力(Km=50pM)(图6B)，这对于细 菌酶来说很少见。就在叶绿体中产生该酶功能而言，这一特性是有利的，因为该细胞室含有 丰富的NADPH。显然酶受到普通的NDH-II抑制剂的影响，并且特别是受具有I5o的10 |iM DPI影响(图6C)。
实施例2:通过农杆菌NDH-II验证莱茵衣藻质体醌的还原
通过测量叶绿素荧光性分析了农杆菌NDH-Il还原质体醌的活性。在存在弱的无光化性 照明情况下，叶绿素荧光性的测量提供了质体醌氧化还原态指示信号。 I -制备类囊体膜
在指数生长期(大约5xl()S个细胞.mr1)取样200ml莱茵衣藻(野生型137c)培养液， 然后离心(5min， 1000xg)。将细胞在35 mM HEPES-NaOH缓冲液(pH7.2)中洗涤，再悬 浮于10ml溶菌缓冲液(50mMTricine-NaOH， pH8; 10mMNaCl; 5mMMgCl2; 1。/。BSA; 1 mM苯甲脒和1 mMPMSF)，并且冷却黑暗下储藏，用于下述步骤。
使悬浮液在2000 psi下两次通过French压机。溶菌液进行首次离心(5 min， 4 。C， 500 x g)，以便除去未溶解的细胞，然后在10 000xg下离心10min将类囊体膜制成粒状物，并且 再悬浮于250 500 |al的分析用缓冲液(50 mM Tricine-NaOH， pH 7.2; 10 mM NaCl和5 mM MgCl2)。 II-质体醌还原
通过使用调制光荧光计(modulated light fluorimeter， PAM 101-103， Walz， Effeltrich，德
国)测量光系统II荧光性。
使用无光化性调制光(650 nm， 1.6千赫兹)以测定叶绿素荧光性水平F。。在1秒钟饱 和闪光下测量叶绿素荧光性最高水平Fm (大约1000 nmol光子.m—2.5—1)。为了防止质体醌再 次氧化，实验在厌氧条件下进行，该厌氧条件是通过向反应混合物添加葡萄糖(20mM)、葡 萄糖氧化酶(2mg.mr1)和过氧化氢酶(1000单位.mr1)形成的。
在有或者没有NDH-II (终浓度1.5吗.1111")情况下，将类囊体膜在冰浴中保温10min， 并且在添加200 pM的NADH前后比较质体醌还原速率。其结果如图7所示(图中，NDH2Ag =有农杆菌NDH-II;对照样=仅有天然酶；DPI-DPI的抑制效果)。
图7显示，在添加NADH后，测量的源于衣藻的类囊体膜上叶绿素荧光性提高了。这种 提高相应于PQs被藻类天然酶的非光化学还原。然而，当存在纯化的农杆菌NDH-II (NHD2Ag)时，荧光性增加更快并且更强。因此质体醌的还原比仅有天然酶(对照样)来 得强。这证明了农杆菌NDH-II与光合电子传递链相互作用的能力。
为了定量这种农杆菌NDH-II对于从NAD(P)H到PSI受体的电子流的影响，在甲基紫 精(PSI受体)、DCMU (二氯苯基二甲脲，PSII的一种抑制剂)和NADH (200 )或NADPH (2mM)电子供体存在时进行氧消耗测量。
将衣藻属类囊体(50(^1，对应于85吗.ml"叶绿素)置于克拉克电极(Clark electrode) 中，该电极含有900 |al分析用缓冲液(50 mM Tricine-NaOH， pH 7.2; 10 mM NaCl和5 mM MgCl2; 25|aMDCMU; 50)aM甲基紫精；SOD (500U.ml");过氧化氢酶(1000U.ml"); 4
粘噻唑菌醇(myxothiazol)禾B 800 SHAM (水杨基氧肟酸)。添加后两个化合物是为 了抑制呼吸性02摄取。
在这些条件下，对细胞色素b6f抑制剂DNP-INT (2-碘-6-异丙基-3-甲基-2',4,4'-三硝基二 苯基醚；lO^M)敏感的光子引起的氧摄取部分，与NAD(P)H和光合链之间的电子传递成比 例。
当NADPH用作供体时，添加1.5吗纯化根癌农杆菌NDH-II促进了这种电子传递由20 增加到45 nmol.min".mg"叶绿素，并且当NADH用作供体时，电子传递由21增加到67 nmol.min".mg"叶绿素。
由于根癌农杆菌NDH-II的添加，因此该实验使得NADPH (或者NADH)和类囊体质 体醌之间电子传递促进作用定量化成为可能。对NADPH而言，该促进作用的因子数约为2， 并且就NADH而言，因子数约为3。
这些体外实验结果使得在莱茵衣藻(并且一般地说，在任何能够生产氢气的藻类)中异 源表达NDH-II这一设想成为可能，其是否是叶绿体性NDH-II、或具有耙向叶绿体的细胞
核性NDH-II，都可以提高叶绿体内部(intrachlor叩last)质体醌还原酶活性，并且关联到H2 的生产。
实施例3:用编码根癌农杆菌NDH-II的序列转化莱茵衣藻 I -质粒pSADN2Ag的构建
使用下述引物，通过PCR从根癌农杆菌U. ^附e/ac7'era，菌株C58)基因组扩增^g加"W2 基因
ndhAgTu.F
5' -TCCCCCGGGATGCAAGAACATCATGTT- 3' (SEQ ID NO: 12) (Tm 66.5 °C)
禾口
ndhAgTu.R
5' -CCGCAATTGTCAGGCCTCGTCCTTCAG- 3' (SEQ ID NO: 13) (Tm69.5 °C)
并且在下列条件下进行
含有1.5 mM MgCl2的特定反应缓冲液
引物终浓度0.5
dNTP混合物终浓度200
300 ng的DNA
1.5单位的高保真耐高温Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(罗氏公司) -f谱姿伴，
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1个循环
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 °C下2 min: 30个循环
72 °C下6 min: 1个循环
用Smal/w/el消化扩增产品。
用iVaeIAEcoRI消化质粒pGEND2 (FISHER和ROCHAIX， Mol, Genet. Genomics. 265: 888-894， 2001)，以便切除编码除叶绿体靶向肽之外的PsaD蛋白的序列。切除的片段替换为 从N2Ag基因扩增产品得到的Sm"I/m/el片段。
得到的质粒称为pSADN2Ag，因此其含有编码根癌农杆菌NDH-II的序列，受PsaD基
因启动子的调控，并且与PsaD蛋白的叶绿体靶向肽进行翻译融合。
II-转化莱茵衣藻
使用因缺乏精氨琥珀酸裂合酶而因此为精氨酸营养缺陷型的莱茵衣藻突变体(CC-2852 arg7cwl5mt+，衣藻属中心，杜克大学，达拉谟，美国)。将该藻类置入200 ml的TAP培养 基(HARRIS,衣藻原始资料，学术出版社，圣地亚哥，1989)中，培养基中补充有100 mg/L 精氨酸，在25。C温度下、并且在大约35pmol光子.m^"的连续光照下进行振荡培养。
在指数生长期末尾(浓度为大约107个细胞/1111)，通过离心浓縮藻类，并且取出后置于 TAP培养基中，得到3xl()8个细胞/ml的悬浮液。
质粒pSADN2Ag与质粒p389 (衣藻中心，杜克大学，达拉谟，美国； http:〃chlamy.org/strains/plasmids.html) —起使用，其中质粒p389由衣藻的核DNA片段组成， 大小7.1kb，包含有Jrg7基因，并且将它们克隆于载体pBR329内的BamHI，以便共转化藻 类。在试管内混合300 mg的0.5 mm玻璃珠(Sigma公司)、10 |al质粒pSADN2Ag (= 1吗)、 2 (al质粒p389 (= 0.2 pg)和350 pl藻类悬浮液(=大约108个细胞)。将试管在最大速度下 旋转振动15秒。然后添加650 ^ TAP，在搅匀后，该悬浮液用于接种到两个含有无精氨酸 TAP培养基U5g/L琼脂)的陪氏培养皿(Petri dish)上(每皿450mu1)。
在连续光照G5pm0l.m2.S")和25。C下培育10天后，将藻类在相同的培养基上继代培 养。在2次继代培养后，获得在无精氨酸下生长的转化体。
通过PCR法检测基因来挑选具有整合iVZ4g基因的转化体。
根据下面的方案溶化菌落
挑取每个菌落置于100 |al无菌水(milliQ⑧过滤)。在1.5 ml试管中混合5 pl的10 x PCR 缓冲液、1 ^的0.01% SDS、 1 |al的200 mM DTT (二硫苏糖醇)、3 pl细胞和39的H20。 进行5个冷冻/解冻循环(在液氮和55 。C水浴之间进行)。 添加2 nl的10 |ag/ml蛋白酶K，并且将混合物在55 。C下保温1 h。 95 。C下处理5分钟使蛋白酶K失活。
使用ndhAgTu.F和ndhAgTu.R为引物、并且在下列条件下进行PCR: -反应混合物假定终体积为25mull时 2.5 pl的10X缓冲液 2mul的dNTP混合物 每个引物1.25mul
2.5 nl的10XBSA
3 pi细胞菌溶液
0.3 (x的Taq聚合酶(Qiagen公司) 12.2 pl的H20 -f谱姿伴，
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1个循环
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 。C下2 min: 30个循环
72 °C下6 min: 1个循环
通过用已用于转化的质粒替换衣藻基因组DNA,来进行阳性对照。 通过1%琼脂糖凝胶迁移分析了扩增产品，并且用溴乙锭(ethydium bromide)染胶后显
像(图8)。将分子量标准参照物(marker)平行载于凝胶上，以便出估计得到的扩增产品大小。
具有整合NDH-II基因的转化体显示出大约1.2 kb的条带，在阳性对照上也观察到该条 带。共转化体的比例(=整合了两个质粒的共转化体)是大约50%。 III-NDH-II表达
通过对6个共转化体进行RT-PCR(实时定量PCR)，证实了农杆菌NDH-II基因的表达。 根据供应商的说明(Qiagen公司)，用脂^盯@试剂盒从25 ml指数生长期的培养物中提取总 RNA。根据供应商(Quigen公司)的推荐方案，使用Omniscript⑧试剂盒，制备互补DNA (cDNA)，调节各种RNAs体积，以便在每个反应中得到2 ^g。
使用ndhAgTu.F和ndhAgTu.R为引物，并且在下列条件下进行PCR: -f应船激，
含有1.5 mM MgCl2的特定反应缓冲液
引物终浓度0.5 pM
dNTP混合物终浓度200
300 ng的cDNA
1.5单位的高保真耐高温Taq聚合酶(Expand High Fidelity Taq polymerase)(罗氏公司)
-r谱餘-
95 °C下3 min， 80 °C下1 min: 1个循环
95 。C下1 min， 60 。C下1 min， 72 °C下2 min: 30个循环
72 °C下6 min: 1个循环
进行阴性对照，以便证实观察到的扩增子不是来自于在RNA提取方案所包含的消化步骤 后存留的细胞核DNA的扩增。为进行对照，将逆转录酶步骤后得到的300 ng cDNA反转录 酶用5 ^该步骤前的RNA溶液来替换。
为了控制提取方案的效率和NDH-II表达水平，对组成性并且大量表达的肌动蛋白1 (actin 1)的cDNA进行平行扩增。
通过1%琼脂糖凝胶电泳分析了扩增产品，并且通过溴乙锭染胶进行显像(图9)。将分 子量标准参照物(marker)平行载于凝胶上，以便出估计得到的扩增产品大小。
表达NDH-II基因的共转化体显示出大约1.2kb的条带，对应于插入物大小。阴性对照 未显示任何条带，这意思着RNA制备品未被基因组DNA污染，反之清楚地显示出肌动蛋白 扩增产品。所有测试的共转化体在不同水平上表达NDH-II基因，但与表达肌动蛋白是在相 同数量级上。
实施例4:缺乏NDH的大肠杆菌菌株的功能性互补 I-互补生长(complementation-growth)试验
通过测定其复原缺乏NDH-1和NDH-2的突变体大肠杆菌菌株ANN 0222生长的能力， 测试异源宿主内Agtundh2蛋白质的体内功能性。该菌株在LB培养基上正常生长，但不能在 补充甘露醇作为唯一碳源的基本培养基M9上生长。
用化学方法(CaCl2)将质粒pSDN2Ag6H转化大肠杆菌菌株ANN 0222。在含有氨节青 霉素(100ng/ml) LB琼脂培养基(补充有1%胰蛋白胨、0.5%酵母抽提物和0.5%NaCl， pH 7)上挑选转化体。在37。C下于液体含有氨苄青霉素(100pg/ml)的LB培养基中培养转化 体和原始菌株，直至指数生长期中间阶段。用无菌的补充有甘露醇作为唯一碳源的M9培养 基(1XM9盐、2 (10—3MMgSO4、 10—4 M CaCl2、 0.4%甘露醇)冲洗细胞。然后在M9培养 基/甘露醇中稀释细胞，并且接种在含有氨苄青霉素和多种浓度IPTG (异丙基-P-D-硫代半乳 糖苷)的固体M9/甘露醇/琼脂培养基上。将陪氏培养皿在37 。C下保温2天。作为对照，将 相同的细胞平行接种于含有氨苄青霉素和多种浓度IPTG的LB琼脂培养基的皿上，并且在 37。C下保温过夜。
结果显示于10A,图中显示了富集培养基(LB)和补充有甘露醇的基本培养基(M9 + 甘露醇)上形成的ANN0222菌落和表达Agtundh2的转化体菌落(注图上的AtuNdh2)。 IPTG 浓度指示于上述每个相应栏。
未转化突变株的在基本培养基上的生长颇受限制，不论有没有IPTG (0.1 mM)。另一方
面，表达Agtiindh2的菌株在基本培养基上的生长，在用0.1 mMIPTG诱导后得到恢复。甚至 在无IPTG时，可观察到突变体的部分互补，这意味着有一定水平的蛋白质非IPTG依赖性表 达。
II- 细胞膜NADH脱氢酶活性
由对照菌株的LB培养基培养物、和导入质粒pSDN2Ag6H的菌株在含有0.1 mM IPTG 的LB培养基上培养的培养物，制备出两批大肠杆菌ANN 0222膜组分。培养一直进行到600 nm下光密度为1 。然后通过离心(15 min， 3200 x g)收集细胞，并且用10 ml缓冲液A (200 mMTris-Cl， pH8; 2.5 mM EDTA和0.2 mM PMSF; (30))再悬浮并冲洗两次。然后使该细 胞在16 000 psi压力下两次通过French压机，使其破壁。将通过离心(30min， 4 。C， 48 500 x g)收集的细胞膜组分，取出后置入200 pl的缓冲液B (50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5和 150mMNaCl)。用1 ml缓冲液A稀释该膜组分的2 )al等分，在25 °C并且存在NADH下， 通过使用克拉克电极(DW2/2， Hansatech， King's Lynn，英国)测量02摄取量。
结果如图10B所示，图上显示了当NADH存在时，由参考菌株(对照样)和由表达 Agtundh2的菌株制备的肠杆菌ANN0222细胞膜的02摄取量。
虽然在响应于添加NADH的对照样菌株细胞膜中未检测到02摄取活性，但另一方面， 在同样的条件下，在用pSDN2Ag6H转化的菌株细胞膜上检测到相当高的02摄取量(图IOB)。 当在大肠杆菌细胞膜中表达时,Agtundh2能够以同数量级的最大速率氧化NADH和NADPH， 但其对于NADH的亲合力要大得多。
III- 蛋白质表达
通过免疫检测，证实了 Agtundh2蛋白质在转化的ANN 0222菌株中表达。 制造兔血清用于抗纯化的Agtundh2蛋白质(Agro-Bio公司，Villeny，法国)。按如上所 述方法提取可溶性蛋白组分和膜蛋白组分。将这些蛋白质组分以及等分的纯化Agtimdh2蛋白 质加载到10y。SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转印到硝酸纤维素膜上。然后将硝酸纤维素 膜在牛乳(3%脱脂奶粉分散于水中，添加0.P/。TBST)中，孵育30分钟，然后用0.1%TBST 冲洗，接着再次与稀释至1/10 000的抗Agtundh2抗体一起孵育1 h30min。然后用0.1%TBST 冲洗纤维素膜三次，每次10分钟，接着然后用稀释至1/10 000的接合有碱性磷酸酶的抗兔第 二抗体孵育lh。根据供应商(Sigma公司)的推荐方案检测反应。
结果如图11所示左边的区域大肠杆菌菌株ANN0222的可溶性蛋白质组分(S)和 细胞膜(Mb)蛋白质组分的免疫检测，该菌株或者用"空的"pSD80载体转化，或者用携带 有^g加"W2的构建体转化，并且用O、 0.1或者0.5 mM IPTG诱导。加载于凝胶上的量最终
相当于在OD6(K) = 1时获得的50 ml培养物的可溶性组分和膜组分稀释至1/400 (即对应于膜 组分泳道上的2.5 ng蛋白质和对应于可溶性组分条带上的30 pg蛋白质)。右侧区域纯化 Agtundh2的免疫检测，从左至右为O.l、 0.2和0.3吗/泳道。
发现大多数蛋白质存在于膜组分，可溶性组分中仅检测到少量蛋白质。甚至在无IPTG 时也检测到显著表达的Agtundh2，这与这些条件下观察到的部分互补情况相一致(参见图 IOA)。
为了测定在大肠杆菌中表达Agtundh2的催化效率，从通过Western blotting (蛋白质印迹 法)测定的含量来估计特异活性。
根据得到的纯化Agtundh2蛋白信号和膜组分信号的相对强度，将10B所示实验中 Agtundh2蛋白含量估计为0.6吗蛋白质。在这些条件下，这样估计的最大02摄取量为13.2/0.6 二22nmol02min".吗"蛋白质，即44 nmol NADH min".ng"蛋白质。
实施例5: Agtundh2对于NADH和NADPH的相对特异性的修饰 I-Agtundh2基因的扩增
使用下述引物对，从质粒pSDN2Ag6H扩增^g^m^2基因 *上游N2Ag.Nco1
v47X7Gyi4GAACATCATGTTGTCGTC (SEQIDNO: 14)
引物中如此插入Ncol (斜体)限制性酶切位点并且改变序列的第四个碱基(将C变成G) 是为了重叠基因的起始密码子(粗体)。 *下游N2Ag.Xbal
CCGrCM 04TCAGGCCTCGTCCTTCAGCGT (SEQ ID NO: 15)
将XbaI (斜体)限制性酶切位点插入基因的终止密码子(粗体)下游引物下游。
在下列条件下进行扩增
IX特定反应缓冲液 MgS04终浓度1.5 (iM 引物终浓度0.5 pM dNTP混合物终浓度200 |aM 200 ng的DNA
1单位的Pfx铂(Invitrogen公司)
2-，姿氛-
94 °C下2 min: 1个循环
94 。C下30 sec， 55 。C下1 min， 68 。C下3 min: 25个循环 68。C下10min: 1个循环。 II- E201O突变子导入Agtundh2基因序列
通过'TCR融合"定点突变技术，将Agtundh2基因的E201Q突变子导入基因序列。使用 质粒pSDN2Ag6H作为模板，得到了对应于第一扩增步骤的片段。使用的引物对如下所示 *上游N2Ag.Ncol; *下游N2Ag.E201Q.R
AGGGCCGGCCTGCACAAGCAA (SEQIDNO: 16)。 该N2Ag.E201Q.R引物使得导入E201Q突变子(粗体)成为可能。 这两个引物使得得到含有E201Q突变子的5'端片段成为可能。 *下游N2Ag.Xbal; *上游N2Ag.E201Q.F
TTGCTTGTGCAGGCCGGCCCT (SEQIDNO: 17)。 该N2Ag.E201Q.F引物使得导入E201Q突变子(粗体)成为可能。 这两个引物使得得到含有E201Q突变子的3'端片段成为可能。 -《应船激，
IX特定反应缓冲液 MgS04终浓度1.5 pM 引物终浓度0.5 nM dNTP混合物终浓度200 pM 200 ng的DNA
1单位的Pfk铂(Invitrogen公司)
-r潜姿伴，
94 。C下2 min: 1个循环
94 。C下30 sec， 55 。C下1 min， 68 。C下3 min: 25个循环 68 。C下10min: 1个循环。
这两个扩增片段含有借助于引物N2Ag.E201Q.F和N2Ag.E201Q.R导入的相关突变子。 通过混合前一步骤得到的两个扩增片段，进行第二扩增步骤。这两个片段借助于它们的共有序列(TTGCTTGTGCAGGCCGGCCCT) (SEQIDNO: 17)进行杂交，这样构成了模板。 使用两个引物N2Ag.Nco1和N2Ag.Xbal，在下列条件下进行扩增 -友細合激，
IX特定反应缓冲液
MgS04终浓度1.5 pM
引物终浓度0.5 (aM
dNTP混合物终浓度200
200 ng N2Ag.NcoI/N2Ag.E201Q.R片段
200 ng N2Ag.Xbal/N2Ag.E201Q.F片段
1单位的Pfx钼(Invitrogen公司)
94 °C下2 min: 1个循环
94。C下30sec， 55 。C下1 min， 68。C下6min: 30个循环 68 。C下10min: 1个循环。 m-构建体克隆
用NcoI和XbaI消化扩增产品(新英格兰生物实验室，供应商的推荐方案)，并且通过连 接反应(T4DNA连接酶购自新英格兰生物实验室，供应商的推荐方案)导入用NcoI和XbaI 消化的载体pBAD24。该载体携带有氨苄抗性盒、以及阿拉伯糖诱导的pBAD型启动子。然 后通过电穿孔法将扩增产品导入大肠杆菌E co//DH10(3。挑选氨苄抗性转化体，并且通过质 粒DNA的提取和Ncol与Hindm的消化，证实了插入体的存在。
然后通过使用Agtundh2基因内的引物(N2Ag.E201Q.F; N2Ag.NcoI; N2Ag.E201Q.R; N2Ag.Xbal)的测序，证实了这两个构建体。
该测序显示，预期的突变子(E201Q)的确己经导入。将该质粒称为E201Qcl。 IV-修饰蛋白质的活性
测定修饰蛋白质对于NADH和NADPH的亲合力。
结果如图12所示。野生型蛋白质(A)显示出，与使用200 nMNADPH记录的活性相比 较，使用200 ^MNADH明显具有更大的活性；而修饰蛋白质(B)显示出对于两个底物具有 类似的活性。
实施例6:来源于莱茵衣藻的定位于叶绿体的NDH2的鉴定
I- 基因的扩增
根据供应商的指导，使用QIAGENRNeaSy 植物微型试剂盒，从莱茵衣藻TAP培养基的 培养物(在1"06和lxlO"个细胞/ml之间取出)分离总RNA。使用具有寡聚dT引物的 OmniscriptTM逆转录酶系统(Qiagen公司)，进行cDNA合成。使用turbo pfu聚合酶，在PCR 机器OmniGene Hybrid thermocycler上扩增反应产物。 -cD崩^潜条伴，
94。C下变性5min
94。C下30s， 72。C下40s禾n72。C下2min: 5个循环 94。C下30s， 68。C下40s禾P 72。C下2min: 5个循环 94。C下30s， 65。C下40s禾B72。C下2min: 5个循环 94。C下30s， 62。C下40s和72。C下2min: 15个循环 72。C下延伸5min。 用于N2Cr2扩增的引物是
5'-ATGCATAGCCTTGATGGCCAAAAC-3' (SEQIDNO: 18)和 5'-TCACACTCGCGAGATGTCGCG-3' (SEQIDNO: 19)。
这两个引物使得通过RT-PCR扩增cDNA (1662 bp)成为可能。这样鉴定出的新序列命 名为N2Cr2。对应于N2Cr2的cDNA编码一个有533个氨基酸的多肽，预测质量为60.5 kDa。
在将该序列cDNA与商业购买的莱茵衣藻基因组序列相比较时，记录到事实上该序列相 应于在N-端第65位氨基酸截断的蛋白质。
N2Cr2的完整cDNA序列在附后的序列表中由编号SEQIDNO: 3表示，并且推导的多 肽序列编号为SEQIDNO: 4。克隆的cDNA相应于序列SEQIDNO: 3的第196-1857位核 苷酸，并且编码对应于序列SEQIDNO: 4第67-619位氨基酸的多肽。
通过克隆的1662bp的cDNA序列编码的蛋白质，虽然在N-末端被截断，仍然编码出一 有效地显示出NADH脱氢酶活性的蛋白质，并且如下所述，该蛋白质使产生识别衣藻N2Cr2 蛋白质的抗体成为可能。
II- pSD80中的基因克隆
使用对应于N-末端和C末端部分的序列的引物，通过PCR扩增1662 bp的cDNA序列 的N2Cr2编码区，通过具有Ecoi /和Sw"/限制性酶切位点性能的附加碱基和6-组氨酸编码 序列而使N2Cr2编码区延伸。将五coi /和Sma/位点(下划线)插入正向(F)和反向(R) 引物中，分别位于起始和终止密码子的上游和下游。将6-组氨酸编码序列(斜体)插入N2Cr2
编码区起始密码子的引物下游。因此低聚核苷酸的序列是
* F-EcoRI:
NO: 20)和
* R - Smal:
5'-TCCCCCGGGTCACACTCGCGAGATGTCGCG-3' (SEQIDNO: 21)。 扩增的cDNA用五coR/和Sm"/消化，并且将其插入有羧苄青霉素抗性的、预先用五coi / 和Swa/消化的pSD80表达载体中(Patel和Dunn， 1995)。将得到的质粒称为pSD80-N2Cr2， 通过测序进行证实，然后用来通过电穿孔法转化大肠杆菌菌株DH10(5。将带有pSD80-N2Cr2 的细胞称为DH10(3 (pSD80-N2Cr2)。在2公升LB培养基接种10 ml DH10(3 (pSD80-N2Cr2) 的过夜培养物，然后放置于摇床(140rpm)，在37。C下和存在羧苄青霉素(50)^g.mr1)时， 进行6-His标记的N2Cr2的表达。大约在接种4 h后，对达到ODeoo nm 0.5的细胞，通过添 加100 |aM异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(IPTG)而启动6-His标记的N2Cr2的表达。在诱导5 h 后，收获细胞，用25 ml LB培养基冲洗细胞(在4355 g下4 。C离心1 min)，并且在-80 。C 下储藏。
III-标记蛋白质的柱纯化
根据BJOERKLOEF等的方案(2000，如上所述)，进行N2Cr2-6His的分离和镍亲合纯 化。在冰上解冻DH10P (pSD80-N2Cr2)细胞，并且取出后置入含有2.5 mM EDTA、 0.2 mM PMSF和200 mM pH 8的Tris-Cl的缓冲液，浓度大约为1 g每10 ml。添加溶解酶，并且将混 合物在冰上搅拌lh。此后，使该细胞两次通过French压机(16 000 psi)而破壁。溶菌液在 12 000g下离心lh，然后收集上清液，并且用于纯化N2Cr2-6His，该纯化使用Histr叩HP树 脂(爱默生生命科学公司(Amersham Bioscience))通过镍亲合色谱法而进行。使用含有20 mM 三乙醇胺、500mMNaCl和25mM咪唑、pH二7.5的缓冲液(缓冲液A)使柱预平衡。在加载 样品后，用两个柱容积的缓冲液A将柱冲洗两次，并且用相近体积的50 mM Tris-Cl、 0.2% (w/v)十二烷基麦芽糖苷、pH二7.5缓冲液(缓冲液B)冲洗，并且最后，用一个柱容积的 50mMTris-Cl、 0.2% (w/v)十二基麦芽糖苷、10 mM CaCl2、 pH = 7.5缓冲液(缓冲液C) 冲洗。在该"钙洗"后，再次用三个容积的缓冲液B和两个容积的缓冲液A冲洗柱子。然后使 用由20mM三乙醇胺、500 mMNaCl、 300 mM咪唑、pH = 7.5制备的梯度咪唑溶液，洗脱 N2cr2-6His。在大约180 mM的咪唑时从柱上分离出N2Cr2-6His;使用"Amicon Ultra 30 kDa" 系统(Millipore公司)通过超滤浓縮相应组分。添加甘油至终浓度50% (v/v)，并且将酶在
-80 °C下储藏。
IV- 抗重组蛋白的抗体的生产
使用上述纯化方案，得到了2mg蛋白质。在考马斯亮蓝染色凝胶上检验蛋白质纯度，并 且通过将该材料免疫兔，用于指示N2Cr2的血清的生产。
V- 细胞分级分离 取得总的、线粒体的可溶性组分
为了测定莱茵衣藻细胞内蛋白质的亚细胞位置，进行细胞分级分离，使得我们能够分离 碎片组分、线粒体组分和可溶性蛋白质组分。为此，我们使用无细胞壁的菌株(CW15)，使 得通过叶达加压溶菌(Yeda-press lysis)进行"温和的"细胞分级分离成为可能。
将400 ml的莱茵衣藻指数生长期的CW15培养物在4 °C、 500 g下离心5 min;然后将颗 粒状物取出后加入50 ml的35 mM HEPES， pH 7.2中，并且在4 °C、 500 g下再次离心5 min。 将颗粒状物取出后加入12.5 ml溶菌缓冲液(50 mM Tricine-NaOH、 10 mM NaCl、5 mM MgCl2， pH = 8)中，导入Yeda压机(Yeda press),以便进行分级分离。将细胞在8 bar的N2气压下 保温6min，并且逐滴回收。
然后将样品在4 °C、 500 g下离心5 min。收集颗粒状物，并且取出后置入2 ml的1% SDS 中。在4。C、 3220 g下，将上清液离心8min。该颗粒状物含有类囊体，因为它们被线粒体膜 污染，因而其未被回收。在4。C、 100000g下将上清液离心1小时。该颗粒状物含有线粒体， 并且用lml的iy。SDS取出。上清液构成了可溶性组分。用丙酮(80%丙酮用于总蛋白和膜 蛋白，并且60%丙酮用于可溶性组分)沉淀这三个组分。使用二辛可宁酸技术(BC分析试 剂盒，UptimaUP40840A， INTERCHIM公司)分析样品的每个组分。 类囊体提取
为了得到未被线粒体膜污染的叶绿体组分，进行Percoll密度梯度(Percoll gradient)纯 化(COURNAC等，J.Biol. Chem.， 275， 23， 17256-17262， 2000)。
为此，将600ml在指数生长期中期的CW15培养物在4。C、 500g下离心5min。将颗粒 状物在50 ml的35 mM HEPES， pH = 7.2中洗涤一次，并且在4 。C、 500 g下再次离心5 min。 将颗粒状物取出后置入12.5 ml缓冲液A(0.3 M山梨糖醇，50 mM HEPES-KOH、pH 8.2， 2 mM EDTA， 5 mM MgCl2)中，并且导入Yeda压机中3 min，压力4.5 bar。所得材料加载到Percoll 密度梯度溶液(40 60%)上，并且在4000 g下离心20 min。收集对应于完整叶绿体的梯线 (ring),并且用10倍体积的缓冲液A稀释。将样品在3220g下离心15min，并且将颗粒状 物取出后置入3.5 ml的0.2% SDS中，然后用80%丙酮沉淀。
根据二辛可宁酸法分析样品。 VI - Western blotting:
通过在10 000 rpm时将合适体积的液体离心10 min，并且将颗粒状物再悬浮于IX的加 载缓冲液，制备出每个组分各100pg。将5pl (即5iag)每个组分加载到10。/。SDS-PAGE凝 胶上。而对照样，大约O.l ng纯化蛋白质也被加载到凝胶上。电泳后，将蛋白质转移到(半 干转印)到硝酸纤维素膜(Life sciences, BioTrace NT公司)上。
然后通过使用抗重组体蛋白(AGRO-BIO)而得到的抗体作为第一抗体进行免疫印迹， 从而将蛋白质进行标记。室温下孵育持续1小时。然后添加偶联于荧光染料的第二抗体(兔 抗IgG)保持一个小时。使用LICOR公司的Odyssey红外扫描仪进行检测。
结果如图13所示。
反应最明显的条带位于类囊体组分中。其比生产的重组体N2Cr2体积稍大。该大小差异 可能是因为与预测的衣藻成熟蛋白质序列相比较，重组蛋白N-末端发生截断之故。
实施例7:将Agtimdh2克隆入用于转化莱茵衣藻的质粒PXX6 I-待克隆片段的构建
为了能在莱茵衣藻中表达Agtundh2蛋白，创造出从莱茵衣藻RbcS2基因与根癌农杆菌 Agtimdh2基因融合而得到的产品。为此，使用融合PCR技术，将RbcS2的转位肽(transit peptide)序列设置于Agtundh2起始密码子上游，而将3'非翻译区(3' UTR region)序列设置 于Agtundh2终止密码子下游。 rbcS2转位肽的扩增
首先，使用下述引物对，由莱茵衣藻基因组DNA扩增rbcS2转位肽
* N2Ag.XhoI:
CGGC7m4GATGGCCGCCGTCATTGCCAAG (SEQ ID NO: 22)。 将XhoI酶的限制性酶切位点(斜体)导入RbcS2基因起始密码子上游(粗体)。
* TP.ndh.R:
23)。
对应于RbcS2转位肽序列的区域以斜体显示，并且对应于Agtimdh2延伸序列的区域以 常规字符显示。 -反应混合物
IX特定反应缓冲液 MgS04终浓度1.5 (^M 引物终浓度0.5 pM dNTP混合物终浓度200 nM 200 ng的DNA
1单位的Pfx铂(Invitrogen公司) -扩增条件
94 。C下2 min: 1个循环
94。C下30sec， 60。C下lmin， 68 。C下3 min: 30个循环 68 。C下10min: 1个循环 Agtundh2基因的扩增
使用下述引物对，从质粒pSDN2Ag6H扩增Agtundh2基因
* TP.ndh.F:
24) 。
将对应于转位肽rbcS2序列末端的延伸区(斜体)导入Agtimdh2的起始密码子上游(粗体)。
* rbcs2.3',R:
25) 。
将对应于rbcS2的3'非翻译区序列开始部分的延伸区(斜体)导入Agtundh2的终止密码 子的下游(粗体)。 -度应凝合激，
IX特定反应缓冲液
MgS04终浓度1.5 nM
引物终浓度0.5
dNTP混合物终浓度200 pM
200 ng的DNA
1单位的Pfx钼(Invitrogen公司)94 。C下2 min: 1个循环
94 °C下30 sec， 55 °C下1 min， 68 °C下3 min: 30个循环 68。C下10min: 1个循环 rbcS2的3'非翻译区的扩增
使用下述引物对，由从基因组DNA扩增rbcS2的3'非翻译区 rbcS2.3'.F
26)
N2Ag.Kpni:
CGGGGZ4CCCTGCAAATGCTGTCTCCA (SEQIDNO: 27)。
对于rbcs2.3'.F引物，将对应于Agtundh2的C末端区域的延伸区(斜体)导入rbcS2 3' 非翻译序列开始部分上游(常规字体)。
对于N2Ag.Kpnl引物，将对应于KpnI酶的限制性酶切位点(斜体)导入rbcS2 3'非翻译 序列末端下游(常规字体)。 -疲潔合激，
IX特定反应缓冲液
MgS04终浓度1.5 nM
引物终浓度0.5 nM
dNTP混合物终浓度200 pM
200 ng的DNA
1单位的Pfx钼(Invitrogen公司) -^谱餘'
94 。C下2 min: 1个循环
94。C下30sec， 60 。C下1 min， 68 。C下3 min: 30个循环 68。C下10min: 1个循环 rbcS2转位肽与Agtimdh2基因的融合片段的扩增
将对应于rbcS2转位肽扩增片段和对应于Agtiindh2基因的扩增片段混合，并用作模板， 使用下述引物对(参见上面)，进行融合片段扩增 N2Ag.Xho1 rbcs2.3'.R
反应混合物
IX特定反应缓冲液
MgS04终浓度1.5 pM
引物终浓度0.5 pM
dNTP混合物终浓度200 (aM
200 ngrbcs2转位肽片段
200 ng Agtundh2基因片段
1单位的Pfx钼(Invitrogen公司) -f潜条伴，
94 。C下2 min: 1个循环
94。C下30sec， 55 。C下1 min， 68。C下6min: 30个循环 68。C下10min: 1个循环。 rbcS2转位肽、Agtundh2基因和rbcS2的3'非翻译区之间融合片段的扩增
将上述得到的融合片段(rbcS2转位肽+ Agtimdh2基因)与对应于rbcS2的3'非翻译区 的片段混合，以便用作模板用于使用下述引物对的最后扩增步骤N2Ag.XhoI; N2Ag.Kpnl。 -厳船激.-
IX特定反应缓冲液
MgSO4终浓度1.5 pM
引物终浓度0.5 )iM
dNTP混合物终浓度200
200 ng"转位肽+ Agtundh2基因"片段
200 ng rbcS2的3'非翻译区片段
1单位的Pfx钼(Invitrogen公司)
-r谱姿伴，
94 °C下2 min: 1个循环
94 °C下30 sec 55 °C下1 min， 68 °C下6min: 30个循环 68。C下10 min: 1个循环。 II-将融合片段克隆入质粒PXX6:
用lo/和/^"/消化融合产物(新英格兰生物实验室，供应商的推荐方案)，并且通过连 接反应(T4DNA连接酶购自新英格兰生物实验室，供应商的推荐方案)导入预先用^zo/和
A:pw/消化的载体pXX6。
FUHRMANNM等(Plant Mol. Biol.， 55， 6， 869-881， 2004)对质粒PXX6进行了描述。 其携带有氨苄抗性盒、优化设置于下游的基因转录的莱茵衣藻强力的Hsp启动子区域、莱茵 衣藻rbcS2基因的组成性启动子、和莱茵衣藻rbcS2基因的第一内含子。
然后通过电穿孔将连接反应产品导入大肠杆菌E. coli DH10(3。
挑选氨苄抗性转化体,并且通过xhoi的提取和^zo/与ig^/酶的消化，证实了插入体的存在。
然后使用下述引物N2Ag.XhoI; N2Ag.Kpnl; TRndh.R; TP.ndh.F; rbcs2.3'.F，通过测
序检验构建体。
在证实了序列和插入体正确后，将该质粒称为pXX6N2Ag，将其通过玻璃珠技术，用于 与有巴龙霉素抗性的aphVIII质粒一起共转化衣藻菌株CW15，并且与携带编码精氨琥珀酸 裂解酶的Arg7基因的pArg —起共转化衣藻菌株388 (精氨酸营养缺陷型)。
权利要求
1.一种II型NAD(P)H脱氢酶(NDH-II)或者编码所述NDH-II的多聚核苷酸的用途，其用于提高绿藻生产氢气的能力。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述NDH-II是NDH-II突变体，所述突变 体是来自NDH-II且位于吡啶-核苷酸结合的p-oH3基序的第二卩-折叠末端的谷氨酸或谷氨酸 被中性的极性残基取代而得到的，所述NDH-II优先使用NADH。
3. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述NDH-II选自-来自根癌农杆菌并由序列SEQ ID NO: 2所限定的NDH-II Agtundh2，或者来自 Agtimdh2且序列SEQ ID NO: 2第201位处的谷氨酸残基被谷氨酰胺残基取代而得到的 NDH-II突变体；-来自莱茵衣藻、由序列SEQIDNO: 4或其含有序列SEQIDNO: 4第67-619位氨基 酸的片段所限定的NDH-II N2Cr2，或者来自N2Cr2、且序列SEQIDNO: 4第285位处的谷 氨酸残基被谷氨酰胺残基取代而得到的NDH-II突变体。
4. 一种用于提高绿藻生产氢气的能力的方法，其特征在于，包括用编码如权利要求l 3中任一项所限定的NDH-II的多聚核苷酸转化所述藻类，以及在所述藻类中表达所述 NDH-II。
5. —种用编码如权利要求1 3中任一项所限定的NDH-II的多聚核苷酸所转化的绿藻。
6. 如权利要求5所述的绿藻用于制氢的用途。
全文摘要
本发明涉及到II型NAD(P)H脱氢酶(NDH-II)或者编码所述NDH-II的多聚核苷酸的用途，其用于提高绿藻生产氢气的能力。特别是将所述多聚核苷酸用于转化所述绿藻，从而提高其制氢能力。
文档编号C12N9/02GK101103117SQ200580040697
公开日2008年1月9日 申请日期2005年10月11日 优先权日2004年10月11日
发明者利蒂希娅·贝尔纳, 卡里纳·西蒙德普拉, 吉勒·佩尔蒂埃, 弗洛朗斯·米斯, 斯特凡·屈内, 洛朗·库尔纳克 申请人:法国原子能总署