专利名称：一种新型单宁酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种从海底淤泥宏基因组文库中分离筛选到的一个新型单宁酶基因、异源表达及其应用。
背景技术：
在茶饮料的生产过程中，茶叶的高温提取液冷却后会变浑浊，并产生絮状沉淀(茶乳酪)，这严重影响了茶饮料的口感和香气。茶乳酪的形成过程为温度较高时，茶提取液中的茶多酚及其氧化物、咖啡碱、蛋白质以及脂质等物质均以游离态存在，随着温度的降低，茶汤中多酚类(尤其是茶黄素、茶红素及没食子酸酯等)分别与咖啡碱的酮氨基、蛋白质的肽基氢键结合形成络合物，逐渐发生凝聚而沉淀下来。在茶饮料生产过程中，需要采取物理、化学或酶处理的方法来消除茶乳酪或使之形成可溶物。用来去除“茶乳酪”的方法有物理法、化学法和酶法。其中，由于酶法较物理法和化学法具有经济、高效和无二次污染等 优点，成为当今的主要研究热点。近些年来，利用纯培养技术已从环境中筛选到能产生单宁酶的微生物，但种类非常有限，主要集中在真菌类的曲霉属、青霉属和根霉属，并且筛选到的这些微生物酶量极少，酶活性也不高，造成生产成本的增加。于是，有研究者从已筛选到的这些微生物中(如米曲霉和植物乳酸杆菌)克隆单宁酶基因，然后将其在工程菌中表达。但是，这些重组降解酶的稳定性较差，在实际应用中有一定的局限性。到目前为止，所有的关于单宁酶的研究都是针对于环境中可培养微生物来展开的。我们知道，环境中蕴藏着大量的微生物资源，并且这些微生物中超过99%的微生物难以通过传统的微生物分离培养的方式进行研究，所以，传统的微生物分离培养技术已经大大的限制了人们对可产生单宁酶的微生物自愿的利用和开发。宏基因组学的出现，则解决了这方面的问题，因为它避开了环境微生物分离培养的难题，直接从环境样品中提取基因组总DNA，建立宏基因组文库，进而从中筛选新的基因或生物活性物质。宏基因组文库包含了环境中所有的(可培养的和不可培养的)微生物遗传信息，因此，在挖掘和利用环境中那些不可培养微生物资源方面，有着巨大的潜力，已成为当前国际上微生物学研究的前沿领域和热点。至今国内外学者已经通过该技术从环境中成功的筛选到了如淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶、纤维素酶、酯酶/脂肪酶等新基因，并且这些酶具有一些新酶学特性及工业应用潜力。到目前为止，尚未利用宏基因组技术从环境中筛选单宁酶基因的研究报道。
发明内容
本发明的第一个目的提供一种新型单宁酶及所述新型单宁酶的cDNA。本发明的第二个目的是提供一种上述新型单宁酶的宏基因组学的克隆方法。本发明的第三个目的是提供一种含有上述单宁酶cDNA的表达载体。本发明的第四个目的是提供一种利用上述表达载体构建的重组单宁酶及其制备方法，以及所述重组单宁酶的应用。
为实现本发明的第一个目的，采取的技术方案为一种新型单宁酶，所述单宁酶的氨基酸序列如如SEQ ID NO. 3所示。一种上述新型单宁酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。为实现本发明的第二个目的，采取的技术方案为一种上述新型单宁酶的宏基因组学克隆方法，包含以下步骤提取南海海洋淤泥总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切处理后，连接到pUC118载体上，电击转化导入大肠杆菌DH5 a中建立宏基因组文库，通过高通量筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。为实现本发明的第三个目的，采取的技术方案为一种包含如上所述的新型单宁酶的cDNA的表达载体。
为实现本发明的第四个目的，采取的技术方案为一种重组单宁酶的制备方法，包括以下步骤用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重
组单宁酶。优选地，上述所述重组单宁酶的制备方法中，所述寄主细胞是大肠杆菌。优选地，所述重组单宁酶的制备方法具体包括以下步骤用权利要求4所述的目的片段经BamHI和HindIII双酶切，与pET_28a (+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。优选地，上述所述重组单宁酶的制备方法中，所述的IPTG终浓度为0. 4禮，诱导温度为25°C。一种采用如上所述方法制备得到的重组单宁酶。一种上述所述的重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、单宁酸、素儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。所述重组单宁酶对儿茶素及其它底物有降解作用。本发明的有益效果为(I)本发明从海底淤泥宏基因组文库中筛选到一个单宁酶基因，通过基因工程技术对其功能研究，发现该基因在大肠杆菌中高效可溶表达，经蛋白纯化及SDS-PAGE电泳，得到一条单一的蛋白条带，减去融合蛋白，初步确定该单宁酶的分子量约为54kDa。(2)本发明将SEQ ID NO. I所示的DNA序列克隆到原核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组蛋白，研究其酶学性质，结果如下
①在大肠杆菌表达体系中，该重组蛋白具有高效可溶性表达。②以没食子酸丙酯为底物，测的重组蛋白的最适反应温度为30°C，在温度低于45°C时较为稳定，45°C保温12h仍保有75%的相对酶活性；最适反应pH为6. 4，在中性或弱酸性条件下保存稳定；4M的NaCl对其酶活性没有影响，表现出较高的耐盐性；测定金属离子和生化试剂对酶活力影响时发现，ImMCa2+, Cd2+和Mg2+对其酶活性有激活作用，ImM Mn2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Al3+、EDTA、尿素和Triton X-100对其酶活性没有明显的影响，而ImM Ag+、Cr2+、^ -巯基乙醇、Tween 80和PMSF对其的酶活性有强烈的抑制作用。(3)本发明在研究重组单宁酶以0. 5mg/mL没食子酸丙酯、单宁酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯为底物的降解作用时，经HPLC分析发现，30°C条件下，经过40min后，单宁酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸和阿魏酸乙酯已经完全水解，大约有88%的迷迭香酸被水解。
图I为本发明实施例I中的SDS-PAGE电泳图。图I中，M为标准蛋白分子量maker，I为重组蛋白粗提物，2为纯化的重组蛋白。图2为温度对重组单宁酶酶活性的影响图。图3为温度对重组单宁酶稳定性的影响图( 代表25°C ;籲代表35°C ;〇代表450C ;■代表 50°C ;□代表 55°C )。图4为pH对重组单宁酶酶活性的影响图。 图5为pH对重组单宁酶稳定性的影响图(■代表pH为5.0 ;A代表pH为6.0 ;口代表pH为7.0 ;〇代表pH为8.0 ; 代表pH为9.0 ; 代表pH为10. 0 ; 代表pH为11. 0)。图6为NaCl对Tan410酶活性的影响图。图7为没食子酸丙酯、单宁酸、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯降解的HPLC分析图。
具体实施例方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例I宏基因组文库的建立和阳性克隆子的获得、基因克隆与表达I、基因组DNA的提取(I)取海底淤泥样品4g，放入50ml无菌离心管中；(2)加入 13. 5ml DNA 提取液 buffer，37°C，220r/min 摇床震荡 30min ；(3)加入 I. 5ml 20% SDS ；(4) 65°C水浴2h，期间每隔20min上下轻轻颠倒离心管几次，混匀；(5)6000父8，4。(离心10111111;(6)取上清，加入等体积的氯仿，上下轻轻颠倒几次；(7) 16000 X g, 4°C离心 IOmin ;(8)重复(6)、(7)步骤两次；(9)取上清，加入0. 6v的异丙醇，轻轻混匀后，室温放置l_2h ；(10) 16000父8，4。(离心20111111;(11)75%的乙醇洗涤两次；(12)风干后 ddH20 重悬。2、试剂盒法纯化DNA :按照胶回收试剂盒说明书进行。3、宏基因组电泳检测用I %琼脂糖凝胶电泳检测总DNA的纯度和质量4、酶切基因组总DNA :用限制性内切酶BamHI部分酶切总DNA，回收3-lOkb的酶切片段，方法同试剂盒法纯化DNA。5、酶切片段的电泳检测方法同宏基因组电泳检测。6、克隆载体的构建及转化将回收得到的酶切片段和pUC118/BamHI (BAP)载体连接过夜，连接产物用PCR产物纯化试剂盒进行纯化后与电转化感受态细胞混合，冰上放置5min，转移DNA/细胞混合物至预冷的2_电穿孔容器(无泡)中，对电穿孔容器进行脉冲(2，500V)(检查时间常数，应该在4以上)，立即添加900 ii L的LB至电穿孔容器中，37°C，200r/min,震荡培养45min，转化产物涂布到含有100 U g/mL氨苄青霉素(Amp)，0. 5mM异丙基-P -D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和100 UM 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷(X-Gal)的平板上，平板倒置放入37°C培养箱中，培养16-20h。由此构建了一个库容量达96000个转化子、多样性好的宏基因组文库。7、文库筛选和阳性克隆子的鉴定(I)单宁酶基因的初步筛选将文库中的所有白色转化子转移到含有底物(X-caprylate)筛选培养基上；37°C培养48h后，挑取在筛选培养基上产生蓝色水解圈的克隆子。(2)单宁酶基因的复筛挑取在筛选培养基上产生蓝色水解圈的克隆子，接种到IOml含有100 U g/mLAmp、·
0.5mM IPTG的LB培养基中，37°C，220r/min过夜培养，12000Xg，离心Imin收集菌体，磷酸盐缓冲液(lOOmM，pH 6.8)洗涤菌体一次，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重新悬浮菌体，超声波破碎菌体，离心收集上清(粗酶液)用作单宁酶活性的检测。取200 ii L粗酶液，加入200 u L 15mM的没食子酸丙酯，37°C，水浴5min，接着加入200iiL甲醇绕单宁(0.667%)，37°C放置5min后加入200 u L KOH(0. 5M)，37°C放置5min，能够使没食子酸丙酯溶液由橘黄色变为紫红色的为阳性克隆。通过筛选得到一个阳性克隆子(PUC118-13B)。将阳性克隆子的质粒送去测序公司进行测序，测序结果显示，单宁酶基因的核苷酸序列由1476个碱基组成，其核酸序列如SEQ ID NO. I所示，该DNA编码的多肽，含491个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，将其命名为Tan410。其中SEQ ID NO. 2为SEQID NO. I 和 SEQ ID NO. 3 的对照图。8、基因片段的克隆根据测序结果设计引物F1和F2，引物两端引入能插入pET-28a(+)载体的HindIII和BamHI酶切位点，引物序列如下Pl :5 ' -CGCGGATCCATGCTGCCCGCCTTCTGCCGC-3 '，下划线为 BamHI 酶切位点序列；P2 :5 ' -CCCAAGCTTATAAGTCTTGGGTTCGTAGG-3 '，下划线为 HindIII 酶切位点序列。利用两条引物，以质粒pUC118-13B为模板进行PCR扩增反应，PCR体系如下
权利要求
1.一种新型单宁酶，其特征在于，所述单宁酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
2.如权利要求I所述的新型单宁酶的cDNA，其特征在于，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. I 所示。
3.如权利要求I所述新型单宁酶的宏基因组学克隆方法，其特征在于，包含以下步骤提取海洋淤泥总DNA并纯化，将纯化后的总DNA经BamHI酶切处理后，连接到pUC118载体上，电击转化导入大肠杆菌DH5 a中建立宏基因组文库，通过高通量筛选得到阳性克隆子，经测序和BLAST比较并设计引物，从而克隆到目的片段。
4.一种包含如权利要求2所述的新型单宁酶的cDNA的表达载体。
5.一种重组单宁酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤用权利要求4所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组单宁酶。
6.如权利要求5所述的重组单宁酶的制备方法，其特征在于，所述寄主细胞是大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的重组单宁酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤用权利要求4所述的目的片段经BamHI和HindIII双酶切，与pET_28a(+)载体连接，转化至大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，得到高效可溶性表达。
8.如权利要求7所述的重组单宁酶的制备方法，其特征在于，所述的IPTG终浓度为0. 4mM，诱导温度为25°C。
9.一种采用如权利要求5所述方法制备得到的重组单宁酶。
10.如权利要求9所述的重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、单宁酸、素儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。
全文摘要
本发明公开一种新型单宁酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明还公开了所述新型单宁酶的cDNA，所述cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了含有上述新型单宁酶cDNA的表达载体、重组单宁酶及其制备方法，以及所述重组单宁酶在降解没食子酸丙酯、单宁酸、素儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯中的应用。所述新型单宁酶及重组单宁酶在大肠杆菌表达体系中具有高效的可溶性表达，且该重组单宁酶对单宁酸、表儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、绿原酸、迷迭香酸和阿魏酸乙酯等具有高效降解作用。
文档编号C12N9/18GK102719413SQ20121013227
公开日2012年10月10日 申请日期2012年4月28日 优先权日2012年4月28日
发明者刘玉焕, 姚健, 范新炯 申请人:中山大学