专利名称：一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD和包括该基因簇的嗜热链球菌。
背景技术：
嗜热链球菌是发酵乳生产中必不可少的乳酸菌菌株，其常常与保加利亚乳杆菌配比使用，某些嗜热链球菌在发酵乳制品生产中不仅起到前期的产酸作用，而且还有发挥一个非常重要的生物功能，就是产生胞外多糖，嗜热链球菌产生的胞外多糖具有增加黏度、改善发酵乳质构、流变特性及口感等作用，近年人们通过大量动物实验证明嗜热链球菌产生的胞外多糖除了上述作用外还拥有一定的益生功能，如降胆固醇、增强粘膜吸附、增加机体免疫力和抗肿瘤等作用。嗜热链球菌产生的胞外多糖均为杂多糖，是由不同的单糖组合而成的，组成杂多糖的单糖包括葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、果糖等。杂多糖是通过聚合在细胞质中形成的前体物质即重复单元的聚合反应而形成的，其生物合成和分泌过程需要一系列的酶和蛋白质，该过程可以分为四个反应阶段糖转运进入细胞质，合成糖-1-磷酸，糖的激活和耦合及多糖转运出细胞质。决定嗜热链球菌产胞外多糖的基因簇均存在于菌株的染色体上，相关研究表明嗜热链球菌有一个复杂的基因组织负责EPS的生物合成和分泌。例如，通过 Tn916诱变和对比染色的平板分析方法鉴定出S. thermophilus Sf i6位于染色体上的印s 基因簇，是一段长14. 52kb的DNA，编码Eps A到EpsM十三个基因。EpsE, EpsF, EpsG和 EpsI基因在大肠杆菌中表达和体外用薄层色谱分析mC标记核苷酸的糖基转移酶反应，鉴定出EpsE、EpsG和EpsI分别是β -半乳糖酶、α -1，3_Ν_乙酸半乳糖胺和β _1，3-葡萄糖转移酶。通过排除，α-1，6-半乳糖转移酶应该是EpsF，它是糖基转移酶基因留下的没有功能的片段。Eps K基因与多糖输出有关，EpsI基因与聚合作用有关，EpsA、EpsB基因与决定链长有关。总之不同菌株的EPS基因簇的基因组的构成、转录的方向和功能表现出高度的保守性。根据同源性调查这类基因簇由四个功能区域组成，一个中心区域带有表现糖基转移酶同源性，这些酶是EPS重复单元生物合成的专一酶，两个在中心区域侧翼的区域，表现参与聚合作用和运输的酶的同源性(链长的控制、转运、聚合)和一个位于基因簇开始端的调节区域。了解和阐明EPS基因簇的功能有助于我们掌握嗜热链球菌生产胞外多糖的基因调控机制，弄清EPS基因簇与嗜热链球菌生产胞外多糖的关系，可为产粘乳酸菌筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造提供基础性的研究材料。
发明内容
本发明人针对上述问题，以传统发酵乳制品中乳酸菌为目标菌群，采用特定的筛选方法，从甘肃省甘南县采集的传统发酵乳制品中筛选出产粘菌株，得到一种产胞外多糖嗜热链球菌(streptococcus thermophilus ,MN-ZLff-002)及其筛选方法，并进一步研究了该产粘菌株中EPS基因簇以及其与胞外多糖产生之间的关系。本发明的目的之一是对产胞外多糖嗜热链球菌CJir^iococc^s thermophilus ) MN-ZLW-002中相关EPS基因进行克隆和测序。本发明的目的之二是通过PCR确定EPS基因簇与胞外多糖产生之间的关系。本发明的目的之三是提供胞外多糖(EPQ基因簇或EPS基因在筛选和改造乳酸菌中的应用。本发明的嗜热链球菌CJire^iococ^As thermophilus) MN-ZLW-OO2 已于 2OlO 年 5 月7日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所)，保藏号=CGMCC No. 3817。本发明提供了从所述嗜热链球菌、Streptococcus thermophilus) MN-ZLff-002 中分离的EPS基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD,并且对该基因进行了克隆和测序。本发明还提供了一种产胞外多糖嗜热链球菌的筛选方法。包括 a.以传统发酵乳制品为样品，从中分离鉴定得到30株乳酸球菌；
b.经进一步理化鉴定确定嗜热链球菌菌株，并制得嗜热链球菌菌悬液；
c.吸取所述嗜热链球菌菌悬液，以洲接菌量接种于200mL1 脱脂乳中。置于43°C 条件下进行18小时过夜培养，在4°C条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测；
d.用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法测定各样品的胞外多糖产量；
本发明还提供了相关EPS基因的克隆方法，包括
a.查询GeneBank，找到己公布的相关序列进行EPS基因的引物设计；
b.对上述新鲜嗜热链球菌进行PCR扩增，从而得到目的片段；
c.对目的片段进行琼脂糖凝胶回收以及基因克隆，并将克隆片段送往基因公司进行测序。本发明的嗜热链球菌{streptococcusthermophilus，MN-ZLff-002)具有较好产粘性能，对其EPS基因簇进行克隆研究后表明EPS基因簇与嗜热链球菌生产胞外多糖具有一定的关系，可用于产粘乳酸菌筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造。
附图 1 为本发明的嗜热链球菌{streptococcus thermophilus，MN-ZLff-002)的全基因组图。
具体实施例方式下列实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 嗜热链球菌 CJire^iococ^As thermophilus )MN-ZLW_002 的分离和鉴
定
1、菌株的筛选经无菌离心管采集回来的甘肃省甘南县传统发酵乳制品，及时移入超净工作台，以无菌枪头吸取25mL，溶解于225mL的生理盐水中，振荡均勻，得到KT1的菌悬液。用移液枪吸取ImL此菌悬液注入9mL的生理盐水管中，得到稀释度为10_2，的菌悬液，厌氧条件下逐级稀释，直到10_6。每个稀释度分别取lmL，接种到M17琼脂培养基中，37°C恒温厌氧培养。培养48h 后取出观察。待菌落形成后，用接种环或接种针挑取菌落，接种于M17液体中，置于37°C条件下，培养Mh-48h。待菌株生长良好后，再次划线接种于M17琼脂培养基中，置于37°C条件下，培养Mh-48h，仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征。将革兰氏阳性链球菌暂定为嗜热链球菌进一步纯化培养，并采用冷藏、_85°C冻结保存或
低温真空冷冻保存。将从传统发酵乳制品中分离的链球菌菌株，经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定，并将鉴定后的菌株分别制成供试菌液。吸取菌悬液，以1接菌量接种于200mL 12%脱脂乳中。置于43°C条件下进行18 小时过夜培养，在4°C条件下打冷5-8小时，打冷后对各样品进行检测。用流变仪测定各样品的流变特性以及黏度大小；利用苯酚硫酸法测定各样品的胞
外多糖产量。嗜热链球菌的鉴定分离纯化的嗜热链球菌、Str印tococcus thermophilus) MN-ZLW-002经生理生化学特性分析和16SrDNA序列分析的方法鉴定，其微生物学特性及 16SrDNA如表1及表2所示。表 1 Str印tococcus thermophilus，MN-ZLW-002 的生物学特性
权利要求
1.一种胞外多糖(EPS)基因簇 EpsA、EpsB、EpsC、EpsD， 其特征在于所述基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.—种如SEQ ID NO: 1所示核苷酸编码的多肽，其序列如SEQ ID N0:2所示。
3 EpsA基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.EpsB基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。
5.EpsC基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
6.EpsD基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
7.权利要求1的胞外多糖(EPS)基因簇、权利要求3的EpsA基因、权利要求4的EpsB 基因、权利要求5的EpsC基因或权利要求6的EpsD基因在筛选和改造乳酸菌中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种嗜热链球菌及其包含的胞外多糖(EPS)基因簇EpsA、EpsB、EpsC、EpsD。所述菌株是从甘肃省甘南县采集的传统发酵乳制品中分离得到的产EPS的嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)MN-ZLW-002，保藏号为CGMCCNo.3817。所述基因簇是从该嗜热链球菌中分离得到的，其分别由EpsA、EpsB、EpsC和EpsD基因组成；并且对上述基因进行了克隆和测序。本发明的EPS基因簇可用于乳酸菌产粘菌株的筛选、益生菌株(拥有EPS相关益生功能)筛选以及用于菌株的基因改造。
文档编号C12N1/20GK102559705SQ20111026161
公开日2012年7月11日 申请日期2011年9月6日 优先权日2010年10月28日
发明者周琦, 孙国庆, 康小红, 张兰威, 生庆海, 龄南 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司