专利名称：一种玉米秸秆水解液生产燃料酒精的发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及玉米秸秆水解发酵生产燃料酒精的发酵工艺。它利用不同的工程菌在发酵的不同阶段加入起到先糖化后发酵的结果，使得水解液中的木质素、木糖、纤维素、葡萄糖等的水解率和同化率增加，对酒精转化率增加，缩短发酵时间，同时降低发酵成本。
背景技术：
目前世界面临石油危机和环境危机，目前各国正在大力寻找可替代的能源。许多国家把眼光投向取之不尽的纤维素质原料。玉米秸秆是我国资源丰富的纤维素质材料，也是农作物废弃物，大量被农民焚烧于田间，价格低廉。玉米秸秆含50％的纤维素，30％的半纤维素和20％的木质素，经过水解可释放大量葡萄糖和木糖等。但是目前还没有发现能同时代谢木糖和葡萄糖的酿酒酵母，结果，利用玉米秸秆的发酵因为非纤维素和木质素的废弃以及酶制剂的成本问题而让位于玉米发酵酒精技术，例如在美国。
但是，利用玉米秸秆发酵酒精技术毕竟是发展的方向，它不与人争粮食，不与粮食争地，产量巨大，分布广泛。现行我国纤维素酒精发酵技术只能利用葡萄糖，只应用了传统育种方法，使用的是非工程菌，具有总的糖酸转化率低，时间长，酒精水平低等缺陷。在这种情况下，再优化发酵工艺也难以进一步提高酒精的发酵能力，这些往往必须通过现代遗传和代谢工程技术才能解决。
在利用基因工程菌株生产时，酿酒酵母的缺点是不能利用木糖等5碳糖，利用代谢途径改造后往往只有半数不道的木糖会转变为酒精，其余变成甘油和木糖醇。利用大肠杆菌工程菌时则会生产许多乙酸，而且它不耐高浓度酒精。
本发明就是通过使用借助现代基因工程技术开发的能够代谢木糖的酿酒酵母，和能够分泌高温纤维素酶的酿酒酵母，从而大大改变了现行发酵工艺。
本发明根据上述原理而实施，旨在提高玉米秸秆水解液的酒精发酵产量和降低成本。
发明内容1.种子的培养将携带编码酒精还原酶基因的大肠杆菌工程菌从低温冻存管中取出在32-37℃富含氨基酸的丰富培养液中培养(例如LB)到OD600nm值1.0以上，全部接入下一个培养液或培养基中(接种比10％)，32-37℃培养至OD600nm值1.0以上，可以作为上罐种子，如果上罐种子体积不足，可以参照上述方法继续扩大培养。
2.同法，培养携带纤维素酶基因的大肠杆菌工程菌种子液。
3.玉米秸秆水解液的制作将玉米秸秆洗净切碎或细粉然后进行酸法水解或者碱法水解等，水解时间10-540min，酸碱中和到pH6.5-7.5，加入氮源、无机盐以及必要的维生素等，在发酵罐内灭菌，116-121℃，15-30min。降温到31-37℃等待接种。
4.接种将上述种子液1和2接入发酵罐内，接种比1-10％，发酵罐溶液占用管内空间在30-75％，接种温度31-37℃，搅拌初始速度30-500rpm，以氨水或者NaOH等碱性溶液调节初始pH为6.5-7.5。
5.实施例1分批流加发酵 接种后，维持溶氧高于15％发酵8-26h，流加碱性溶液维持pH恒定在7.0左右，在发酵的第一次溶氧非振荡性上升时加入诱导剂诱导工程菌分泌纤维素酶和木质素酶降解剩余的多糖，通过流加秸秆浓水解液(总糖浓度高于200g/L)维持溶氧水平不低于5％，到酒精浓度4.5-5.9％时酒精浓度1-3小时内不变化则放罐，发酵结束。
6.实施例2分批流加发酵 接种后，维持高溶氧(＞15％)发酵，通过流加碱性溶液(例如氨水或氢氧化钠溶液等)和秸秆浓水解液(总糖浓度高于200g/L)维持pH恒定在7.0左右的某一个值，高于此值流加水解液，低于此值，加碱。在发酵的第5～18小时加入诱导剂。酒精浓度1-3小时内不变化则放罐，发酵结束。
7.实施例3分批流加发酵 接种后，维持高溶氧(＞15％)发酵，测定发酵液中的葡萄糖和木糖浓度控制发酵进程，当但糖浓度持续下降时，加入诱导剂开始诱导纤维素酶和木质素酶的产生，诱导3-8h后升温到52℃糖化1-5h，降温到31-37℃补加1-10％的上述菌种继续发酵，并流加秸秆浓水解液(总糖浓度高于200g/L)维持葡萄糖浓度和木糖浓度均高于5g/L。当1-3小时内单糖浓度不再下降，酒精浓度不再上升时则放罐，发酵结束。
结果，经过本发明实施例，玉米秸秆的酒精发酵能力在30h内可达5.0％以上，总糖酸转化率在80％以上，基本做到4吨秸秆制造一吨酒精。
权利要求
1在利用秸秆水解液制成的发酵液中加入产纤维素酶的酿酒酵母工程菌发酵生产燃料酒精。
2在利用秸秆水解液制成的发酵液中加入能够代谢木糖的酿酒酵母工程菌发酵生产燃料酒精。
3本发明利用酿酒酵母直接分泌产生纤维素酶和木糖酶，从而可以通过秸秆水解液的流加来控制发酵进程。
4本法适用于来源于利用各种技术合成的各种DNA序列编码的纤维素酶、木质素酶、木糖还原酶、木糖氧化酶和木酮糖激酶的基因。
全文摘要
本发明涉及利用能够同化木糖和纤维素的酿酒酵母工程菌来发酵玉米秸秆水解液生产酒精。本发明可以利用溶氧值和pH值来控制流加工艺，本发酵也可以利用在不同时刻接入不同的酿酒酵母工程菌以及决定是否升温糖化来发酵生产酒精。本发明能提高玉米秸秆水解液发酵生产酒精的生长密度和发酵水平，简化控制操作，降低发酵成本。
文档编号C12P7/10GK101033475SQ200610016640
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者李校堃, 袁辉, 王艳萍, 孟娟 申请人:吉林农业大学