专利名称：嗜中性颗粒蛋白ngp的表达和纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程研究领域，具体涉及在宿主细胞中嗜中性颗粒蛋白(neutrophil granule protein)的表达和纯化。
背景技术：
嗜中性颗粒蛋白(NGP)的分子量为19.33kDa，在N端有一个糖基化位点；软件分析发现其氨基末端还有一个22个氨基酸组成的信号肽，提示其可能是一个分泌蛋白。根据报道NGP特异性表达于骨髓源细胞中，在前髓细胞(promyelocytes)中表达量最高；免疫电镜分析，NGP定位于嗜中性颗粒细胞。结构域(Domain)分析发现NGP含有一个塞特亭样结构域(cytatin-likedomain)，隶属于塞特亭(cystatin)家族。
Cystatin是一类广泛分布于生物体内半胱氨酸蛋白酶抑制剂，参与各种生理和病理过程。从目前国内外的研究进展来看，cytatin家族成员在免疫调节中发挥着重要作用1)调节溶酶体内恒定链Ii的降解和MHC-II分子的成熟，从而调节MHC-II限制的抗原递呈；2)调节细胞因子的分泌，抑制T细胞生长分化和巨噬细胞的功能；3)上调干扰素γ(IFN-γ)活化的MPMs一氧化氮的合成量。
目前国内外关于NGP功能的研究很少，根据Science Paper(TheTranscriptional landscape of the Mammalian Genome；2005 Sep2；309(5740)1559-63)中预测其可能具有(i)半胱氨酸蛋白酶抑制剂活性；(ii)杀菌杀虫的抗菌肽活性。但目前国内外还没有相关的实验证实或报道。
由此可见，NGP具有很大的研究价值，在体外大量表达和纯化嗜中性颗粒蛋白NGP以探索其重要的生物学功能将具有重要的理论和现实意义。但是，目前现有技术中还没有一种成功地大量表达和纯化嗜中性颗粒蛋白NGP的方法，从而给NGP功能的进一步研究造成了瓶颈；并且，目前本领域中也没有对NGP的功能作深入的研究和试验来证实其功能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达嗜中性颗粒蛋白NGP的方法。
本发明的目的还在于提供一种表达载体，所述的表达载体可以被转入宿主细胞中，表达嗜中性颗粒蛋白NGP。
在本发明的第一方面，提供一种制备嗜中性颗粒蛋白NGP的方法，包括以下步骤(a)PCR扩增获得嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列；(b)将(a)所述的嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体；(c)使(b)获得的插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞，从而表达出嗜中性颗粒蛋白NGP；(e)分离获得嗜中性颗粒蛋白NGP。
在本发明的另一优选例中，所述的嗜中性颗粒蛋白NGP是嗜中性颗粒蛋白NGP与GST形成的融合蛋白。
在本发明的另一优选例中，在步骤(e)中将所述的表达产物通过破碎细胞，并通过GST亲和层析的方法纯化。
在本发明的另一优选例中，通过PCR扩增嗜中性颗粒蛋白NGP的基因，并且，在PCR扩增时，采用LA-Taq DNA聚合酶作为DNA聚合酶。
在本发明的另一优选例中，在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤对扩增获得的嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列进行测序鉴定。(例如，将带有信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP基因克隆入过渡载体，以含有带有信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP的过渡载体为模板，扩增嗜中性颗粒蛋白NGP基因。)在本发明的另一优选例中，所述的过渡载体选自pEGF-N1载体、或pEGF-C1。
在本发明的另一优选例中，所述的表达载体包括但不限于pGEX-4t-1等系列表达质粒。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌BL21。
在本发明的另一优选例中，所述的方法包括以下步骤(a)用PCR技术从T细胞cDNA文库中获得嗜中性颗粒蛋白NGP/CDS的DNA片段；(b)将NGP/CDS的DNA片段克隆进pEGF-N1载体，构建过渡载体NGP/CDS-pEGF-N1(c)以NGP/CDS-pEGF-N1为模板，PCR拉出去除信号肽后的嗜中性颗粒蛋白NGP；(d)将嗜中性颗粒蛋白NGP克隆进pGEX-4t-1，构建NGP-pGEX-4t-1表达载体；(e)将NGP-pGEX-4t-1载体转化宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
在本发明的第二方面，提供一种NGP-GST融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的融合蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO1所示的基因序列。
在本发明的第四方面，提供一种基因工程表达载体，所述的表达载体含有嗜中性颗粒蛋白的编码序列。
在本发明的第五方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有所述的表达载体。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌BL21。
在本发明的另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌Escherichia coliBL21/pGEX-4t-1-NGP，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M206020。
在本发明的第六方面，提供嗜中性颗粒蛋白NGP的用途，用于作为鉴定Th2细胞的分子标记；或用于制备调节Th2细胞生长和分化的制剂；或用于筛选调节Th2细胞生长和分化的制剂。
在本发明的第七方面，提供用于制备抑制脾细胞增殖的组合物。
在本发明的另一方面，提供了嗜中性颗粒蛋白NGP或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节脾细胞增殖的药物。
在本发明的另一方面，提供嗜中性颗粒蛋白NGP的用途，所述的嗜中性颗粒蛋白NGP可用于(i)NGP蛋白功能性研究；(ii)制备中和性抗体。
在本发明的另一优选例中，提供了一种筛选调节脾细胞增殖的物质的方法，所述的方法包括(a)在测试组中，向脾细胞与嗜中性颗粒蛋白NGP的混合体系中添加待筛选的候选物，并检测脾细胞的增殖情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、脾细胞与嗜中性颗粒蛋白NGP的混合体系中，检测脾细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中脾细胞的增殖情况与对照组中脾细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中脾细胞的增殖在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制(优选显著抑制)脾细胞的增殖的抑制剂；如果测试组中脾细胞的增殖在统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进(优选显著促进)脾细胞的增殖的促进剂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1显示了NGP-GST融合蛋白表达质粒NGP-pGEX-4t-1构建示意图。
图2显示了用T细胞NGP(CDS)引物进行PCR后，产物DNA电泳分析图谱。
图3显示了NGP(CDS)-pEGF-N1质粒PCR及酶切鉴定图。图中，1、2、3代表不同的克隆。左边为酶切结果，右边为PCR结果。
图4显示了NGP PCR产物DNA电泳分析图谱。图中，1和2为两管PCR结果。
图5显示了NGP-pGEX-4t-1质粒PCR及酶切鉴定图。
图6显示了表达质粒NGP-pGEX-4t-1诱导表达蛋白后聚丙烯酰氨电泳分析图谱。
图7显示了NGP-GST蛋白纯化前后蛋白质聚丙烯酰氨电泳分析图谱。
图8显示了NGP蛋白的功能实验的结果，其中，1表示空白对照的实验结果，2表示加32μg NGP-GST蛋白的实验结果，3表示加入160μg NGP-GST蛋白的实验结果，4表示加入32μg GST蛋白的实验结果。
图9显示了分别用LA-taq和pfu-taq两种DNA聚合酶进行了PCR扩增试验的电泳结果。
图10显示了Th1细胞和Th2细胞表达IL-4(A)和IFN-γ(B)的情况；图中Th1细胞和Th2细胞均为重复刺激所得。
图11显示了NGP在Th1和Th2细胞中的表达情况。其中，A为RT-PCR结果48h即分化后的Th1和Th2细胞再通过OVA+APC进行刺激，48h后收获细胞；B和C为实时定量PCR结果样品和RT-PCR相同。
图12显示了NGP在Th细胞分化过程中的表达情况。图中1、3、5、7为分化过程中的Th2，2、4、6、8为分化过程中的Th1。
图13显示了Westernblot检测NGP抗体及Th细胞中NGP的表达情况。图中A为检测NGP抗体结果1表示转染了pEGFP-N1质粒，2表示转染了NGP(cds)-pEGFP-N1质粒；图中B为内源NGP检测结果3为Th1细胞，4为Th2细胞。
图14显示了NGP在细胞中的定位。其中，A-C对照质粒pEGFP-N1转染的Hela细胞，D-F重组质粒NGP-pEGFP-N1转染的Hela细胞；其中C为A和B重叠图，F为D和E重叠图；绿色为GFP发光情况，蓝色为DAPI染色后发光。
具体实施例方式
本发明人经过长期而广泛的研究以及反复实验，在宿主细胞中成功地表达和纯化了嗜中性颗粒蛋白NGP，从而克服了以往人们无法表达NGP蛋白的技术难点；进一步的研究还发现，NGP在Th2细胞中高表达；并且，本发明人还首次证实了嗜中性颗粒蛋白NGP能够抑制脾细胞的增殖；基于此完成了本发明。
如本发明所用，NGP(CDS)、NGP/CDS可互换使用，都是指携带信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP。
表达嗜中性颗粒蛋白NGP的方法本发明提供了一种表达嗜中性颗粒蛋白NGP的方法，所述方法包括(a)PCR扩增获得嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列；(b)将(a)所述的嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体；(c)使(b)获得的插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞，从而表达出嗜中性颗粒蛋白NGP；(e)分离获得嗜中性颗粒蛋白NGP。
在另一种优选方式中，所述的嗜中性颗粒蛋白NGP是嗜中性颗粒蛋白NGP与GST形成的融合蛋白。
在本发明的优选方式中，通过PCR扩增嗜中性颗粒蛋白NGP的基因，并且，在PCR扩增时，采用LA-Taq DNA聚合酶作为DNA聚合酶。本发明人发现，只有采用LA-Taq DNA聚合酶作为DNA聚合酶，才能扩增出嗜中性颗粒蛋白NGP的基因，而采用其它种类的DNA聚合酶(如pfu-Taq DNA聚合酶等)，都无法获得所述的基因。
在另一优选例中，在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤对扩增获得的嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列进行测序鉴定。
在本发明的优选方式中，包括将带有信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP基因克隆入过渡载体，以含有带有信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP的过渡载体为模板，扩增嗜中性颗粒蛋白NGP基因。
在本发明的最优选的方式中，所述的方法包括以下步骤(a)用PCR技术从T细胞cDNA文库中获得嗜中性颗粒蛋白NGP(CDS)的DNA片段；(b)将NGP(CDS)的DNA片段克隆进pEGF-N1载体，构建过渡载体NGP(CDS)-pEGF-N1；(c)以NGP(CDS)-pEGF-N1为模板，PCR拉出去除信号肽后的嗜中性颗粒蛋白NGP；
(d)将嗜中性颗粒蛋白NGP克隆进pGEX-4t-1，构建NGP-pGEX-4t-1表达载体；(e)将NGP-pGEX-4t-1载体转化宿主细胞中，并在宿主细胞中表达。
将表达载体引入到基因工程化的宿主细胞中，即可表达所述的蛋白。在本发明的优选方式中，采用的宿主细胞为大肠杆菌BL21。
嗜中性颗粒蛋白NGP的纯化可采用许多蛋白纯化技术来纯化上述表达的嗜中性颗粒蛋白NGP。包括(但不限于)亲和层析、分子筛、柱层析、或细胞超声。
在本发明的优选方式中，为了便于蛋白纯化，将所述的嗜中性颗粒蛋白NGP表达于携带GST的表达载体中，通过GST亲和层析的方法来纯化所述的嗜中性颗粒蛋白NGP。在更优选的方式中，将得到的蛋白初提物用分子筛进行进一步的纯化，获得所需的纯化的蛋白。
在本发明的优选方式中，在步骤(e)中将所述的表达产物通过破碎细胞，并通过GST亲和层析的方法纯化。
嗜中性颗粒蛋白NGP的载体本发明中，对于采用的表达载体没有特别的限制，可以采用常规用于克隆入外源基因的载体。所述的载体含有至少一个可插入外源基因的位点，或者含有可插入外源基因的多克隆位点，并且所述载体能够表达本发明的嗜中性颗粒蛋白NGP。在本发明的优选方式中，所述的表达载体为原核表达载体，在更优选的方式中，所述的表达载体包括(但不限于)pGEX-4t-1、pGEX-4t-2。
在本发明的优选方式中，所述的表达载体为携带NGP基因的pGEX-4t-1载体，本发明人将之命名为NGP-pGEX-4t-1，携带该载体的大肠杆菌菌株在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 206020。
并且，所述的载体NGP-pGEX-4t-1具有SEQID NO1所示的多核苷酸序列；以及具有SEQ ID NO2所示的蛋白序列。
本发明中，对于采用的过渡载体没有特别的限制，可以采用常规用于克隆入外源基因的载体。所述的载体含有至少一个可插入外源基因的位点，或者含有可插入外源基因的多克隆位点。在本发明的优选方式中，所述的过渡载体包括(但不限于)pEGF-C1、pEGF-N1载体。
此外，本发明还涉及一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞中含有所述的表达载体。
嗜中性颗粒蛋白NGP的用途本发明人研究中发现，NGP mRNA在Th2中特异性高表达，而在Th1中低表达。这提示NGP在T细胞的生长分化中起着重要作用。另外，由于NGP在氨基末端有一个信号肽，并且还发现NGP蛋白位于细胞质中，这些均提示其是一种分泌蛋白，可能成为一种新的细胞因子。
因此，本发明还提供了嗜中性颗粒蛋白NGP的用途，可用于作为鉴定Th2细胞的分子标记，从未知类型的细胞中鉴定出Th2细胞。或者，其还可用于制备调节Th2细胞生长和分化的制剂，或用于筛选出可通过调节NGP的活性或表达来调节Th2细胞的物质，比如其拮抗剂或激动剂，最终用于制备预防或治疗相关疾病的药物。
此外，本发明还提供了嗜中性颗粒蛋白NGP或其激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调节脾细胞增殖的药物。所述调节脾细胞增殖的药物比如可治疗NGP低表达或缺失引起的疾病。
抑制脾细胞增殖，可降低体液和细胞免疫反应，达到免疫抑制的作用，防止排斥反应的产生。防止，促进脾细胞的增殖，能够上调体内的免疫应答作用，起到促进免疫的作用。
本发明人首次发现嗜中性颗粒蛋白NGP能够抑制脾细胞的增殖，从而可用于制备抑制脾细胞增殖的抑制剂(免疫抑制剂)。
此外，由于本发明人证实了NGP在脾细胞的生长和分化中起着非常重要的作用，因此可依据NGP与脾细胞的相互作用，来筛选通过调节NGP来调节脾细胞增殖的物质，即NGP的拮抗剂和/或促进剂。
只要在了解了本发明的嗜中性颗粒蛋白NGP对于脾细胞的调节作用，本领域技术人员可以通过各种方法来筛选调节脾细胞增殖的物质，所述方法均包含在本发明中。
在本发明的优选方式中，筛选调节脾细胞增殖的物质的方法包括(a)在测试组中，向脾细胞与嗜中性颗粒蛋白NGP的混合体系中添加待筛选的候选物，并检测脾细胞的增殖情况；并且，在对照组中，在不添加所述候选物的、脾细胞与嗜中性颗粒蛋白NGP的混合体系中，检测脾细胞的增殖情况；(b)将步骤(a)测试组中脾细胞的增殖情况与对照组中脾细胞的增殖情况进行比较，如果测试组中脾细胞的增殖在统计学上低于对照组，就表明该候选物是抑制(优选显著抑制)脾细胞的增殖的抑制剂；如果测试组中脾细胞的增殖在统计学上高于对照组，就表明该候选物是促进(优选显著促进)脾细胞的增殖的促进剂。
所述初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节细胞凋亡有用的药物。
嗜中性颗粒蛋白NGP本身或NGP的促进剂或抑制剂，可以施用于个体，调节细胞的凋亡。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、静脉内、或皮下给药。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)嗜中性颗粒蛋白NGP本身或NGP的促进剂或抑制剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。这些组合物可以用于调节脾细胞的增殖。
通常，这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。
此外，本发明还提供嗜中性颗粒蛋白NGP的其它用途，所述的嗜中性颗粒蛋白NGP可用于(i)NGP蛋白功能性研究；
(ii)制备中和性抗体；(iii)制备治疗NGP低表达或缺失引起疾病的药物。
本发明的主要优点在于(1)本发明人通过反复试验，找到以往人们无法PCR扩增出NGP基因的原因，即采用LA-Taq DNA聚合酶作为PCR反应中的DNA聚合酶，通过将获得的基因克隆入表达载体首次实现了NGP的表达，从而克服了以往本领域人员难以表达NGP蛋白的技术难点。并且，本发明还具有操作简单、获得的蛋白纯度高等特点。
(2)首次证实了NGP在Th2细胞中高表达，从而为调节T细胞的生长和分化提供了途径。
(3)首次证实了NGP的功能，其能够抑制脾细胞的增殖，从而为研究和筛选调节脾细胞增殖的药物提供了新的途径。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1含全长嗜中性颗粒蛋白NGP(CDS)的质粒NGP(CDS)-pEGF-N1的构建利用PCR技术从T细胞cDNA(转基因小鼠DO11.10脾细胞抽提的RNA经常规方法逆转录所得)中获得嗜中性颗粒蛋白NGP(CDS)的DNA片段。按图1所示，构建含全长嗜中性颗粒蛋白NGP(CDS)的质粒NGP(CDS)-pEGF-N1。
(1)设计引物，扩增NGP序列正向引物(sense primer)5’GGAAGATCTATGGCAGGGCTGTGGAAG 3’(SEQ ID NO3)反向引物(anti-sense primer)5’ACGCGTCGACGAGATGGGTAGTGGAGGTA 3’(SEQ ID NO4)PCR扩增反应(50μl)材料如表1表1
PCR反应条件为94℃3分钟；(94℃45秒；63℃45秒；72℃45秒)34循环；72℃7分钟。
图2所示为NGP PCR产物DNA电泳分析图谱，图中可见获得了正确的NGP扩增产物。
(2)将NGP(CDS)克隆到pEGF-N1载体上PCR产物的NGP(CDS)和pEGF-N1(Clontech公司)质粒分别用BglII和SalI酶切；用胶回收试剂盒(申能博采公司)回收酶切产物；用T4连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH-5α；经下述PCR鉴定和酶切鉴定挑选出阳性克隆。
PCR鉴定利用NGP(CDS)的特异性引物筛选正确的克隆；即所挑克隆经摇菌后，以菌液为模板经PCR，采用的PCR条件如前面所述。
酶切鉴定结果见图3，所挑3个克隆都是阳性结果，选取2号(2#)菌液送去测序。DNA测序结果如下(SEQID NO7)ATGGCAGGGC TGTGGAAGAC CTTTGTATTG GTGGTGGCCT TGGCTGTGGT CTCCTGTGAG 60GCCCTTCGAC AACTAAGATA TGAGGAGATT GTTGATAGAG CCATAGAGGC ATACAACCAA120GGGCGGCAAG GAAGACCCCT CTTCCGCCTG CTAAGTGCCA CTCCGCCTTC TAGTCAGAAC180CCTGCTACCA ATATCCCACT CCAGTTCAGG ATTAAAGAGA CAGAGTGTAC TTCCACCCAG240GAGAGACAGC CTAAAGACTG CGACTTCCTG GAGAATGGGG AGGAGAGAAA TTGCACAGGG300AAATTCTTCA GAAGGCGGCA GTCAACCTCC CTGACCTTGA CCTGCGACAG GGATTGCAGT360CGAGAGGATA CCCAAGAAAC CAGTTTTAAT GATAAGCAAG ACGTCTCCGA AAAGGAAAAG420
TTCGAAGATG TGCCCCCTCA CATCAGGAAC ATTTATGAAG ATGCCAAGTA TGATATCATC 480GGCAACATCC TGAAAAATTT CTAGGGCTGG A 511NGP(CDS)-pEGF-N1测序结果和NCBI上公布的NGP蛋白质的DNA序列(GenBank登录号NM_008694)比较，结果如预期一样，NGP(CDS)成功克隆入pEGF-N1质粒中。
实施例2去除信号肽的嗜中性颗粒蛋白NGP表达质粒NGP-pGEX-4t-1的构建(1)设计引物，扩增NGP序列正向引物(sense primer)5’CGGAATTCCTTCGACAACTAAGATATGAGG 3’(SEQ ID NO5)反向引物(anti-sense primer)5’GGCGAGCTCGAGATGGGTAGTGGAGG 3’(SEQ ID NO6)PCR扩增反应(50μl)材料如表2表2
PCR反应条件为94℃3分钟；(94℃45秒；58℃45秒；72℃45秒)32循环；72℃7分钟。
结果获得了正确的去除了信号肽的NGP扩增产物，如图4所示。
(2)将NGP的PCR产物克隆到pGEX-4t-1载体上NGP的PCR产物和pGEX-4t-1表达质粒分别用EcoRI和XhoI酶切；用胶回收试剂盒(申能博采公司)回收酶切产物；用T4连接酶连接；连接产物转化入感受态细胞DH-5α；经PCR筛选和酶切鉴定挑选出阳性克隆。
PCR鉴定利用NGP的特异性引物筛选正确的克隆；即所挑克隆经摇菌后，以菌液为模板经PCR，PCR条件和前面所述一致。电泳后出现一条520bp左右的条带，如图5所示。
酶切鉴定阳性克隆菌小抽质粒经EcoRI和XhoI酶切后应该可以多出一条520bp左右的条带。结果见图5。
DNA测序结果NGP-pGEX-4t-1测序结果和NGP蛋白质DNA序列比较，结果如预期一样，NGP成功克隆入pGEX-4t-1表达质粒中。获得的NGP-pGEX-4t-1中NGP-GST段的序列如下(SEQ ID NO1)ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 60TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660CTGGTTCCGC GTGGATCCCC GGAATTCCTT CGACAACTAA GATATGAGGA GATTGTTGAT 720AGAGCCATAG AGGCATACAA CCAAGGGCGG CAAGGAAGAC CCCTCTTCCG CCTGCTAAGT 780GCCACTCCGC CTTCTAGTCA GAATCCTGCT ACCAATATCC CACTCCAGTT CAGGATTAAA 840GAGACAGAGT GTACTTCCAC CCAGGAGAGA CAGCCTAAAG ACTGCGACTT CCTGGAGGAT 900GGGGAGGAGA GAAATTGCAC AGGGAAATTC TTCAGAAGGC GGCAGTCAAC CTCCCTGACC 960TTGACCTGCG ACAGGGATTG CAGTCGAGAG GATACCCAAG AAACCAGTTT TAATGATAAG1020CAAGACGTCT CTGAAAAGGA AAAGTTCGAA GATGTGCCCC CTCACATCAG GAACATTTAT1080GAAGATGCCA AGTATGATAT CATCGGCAAC ATCCTGAAAA ATTTCTAG 1128并且，其相应的氨基酸序列如下(SEQ ID NO2)MSPILGYWKI KGLVQPTRLL LEYLEEKYEE HLYERDEGDK WRNKKFELGL EFPNLPYYID 60GDVKLTQSMA IIRYIADKHN MLGGCPKERA EISMLEGAVL DIRYGVSRIA YSKDFETLKV120DFLSKLPEML KMFEDRLCHK TYLNGDHVTH PDFMLYDALD VVLYMDPMCL DAFPKLVCFK180KRIEAIPQID KYLKSSKYIA WPLQGWQATF GGGDHPPKSD LVPRGSPEFL RQLRYEEIVD240RAIEAYNQGR QGRPLFRLLS ATPPSSQNPA TNIPLQFRIK ETECTSTQER QPKDCDFLED300GEERNCTGKF FRRRQSTSLT LTCDRDCSRE DTQETSFNDK QDVSEKEKFE DVPPHIRNIY360EDAKYDIIGN ILKNF 375实施例3嗜中性颗粒蛋白NGP的表达采用常规的方法，将NGP-pGEX-4t-1质粒转化于大肠杆菌BL21中，IPTG(浓度0.5mM)诱导，加入氨苄抗生素(100μg/ml)，温度20℃，表达时间16小时，在上述条件下2升LB培养基经4℃、7000rpm离心18分钟后，将沉淀放于-70℃保存。
NGP蛋白采用SDS-PAGE检测表达情况，结果见图6，可见本发明人成功表达了融合蛋白NGP-GST。
实施例4表达产物的纯化本实施例将NGP蛋白的表达产物进行纯化，具体步骤如下(1)离心沉淀置于冰上，每100ml菌液的沉淀加入4ml预冷的1×PBS重悬，与此同时需加入PMSF至终浓度为1mM，以抑制裂解物(lysate)中的蛋白酶。
(2)将重悬的沉淀置于冰上超声破碎。200W，10秒超声，15秒间隔，30次，循环三次，每次循环间隔2～3分钟，该过程中避免泡沫产生。
(3)加入20％的Triton X-100(或TWEEN-20)至终浓度为1～3％，4℃或室温混合30～60分钟以提高表达的融合蛋白的可溶性。
(4)4℃，12000rpm离心30分钟后，取上清(1mM PMSF)再12000rpm离心15分钟。
(5)取上清过柱纯化，得到的蛋白初提物进一步用分子筛纯化，得到的蛋白采用SDS-PAGE检测表达情况，结果如图7所示。
实施例5 NGP在Th2细胞中高表达通过以下方法获得Th1和Th2细胞1.小鼠脾细胞的分离1)准备好RDF培液(含10％血清或不含血清的各20ml)，吸管，六孔板等2)脱颈椎处死小鼠，取脾脏；3)用扁平镊子破碎脾脏；4)将破碎后的脾脏细胞转移到15ml离心管中，放置于冰上，让组织沉淀5)将上清单细胞悬液转移至新的15ml离心管中；6)1200rpm离心6min后，弃上清；
7)弹松细胞，加入3ml红细胞裂解液裂解细胞3-4min；8)加入RDF培液稀释，1200rpm离心6min后，弃上清；9)弹松细胞，加入2ml含10％血清的RDF培液，混匀；10)细胞计数；11)取适量细胞供后继实验使用。
2.辅助性T细胞Th1和Th2的诱导分化1)取一定量的DO11.10小鼠脾脏细胞；2)Th1细胞的诱导分别加入OVA 2ug/ml，IL-2 50U/ml，IL-12 10ng/ml，anti-IL-4 10ug/ml，24孔板培养细胞密度为6×106个/ml；3)Th2细胞的诱导分别加入OVA 2ug/ml，IL-2 50U/ml，IL-4 1000U/ml，anti-IL-12 10ug/ml，anti-IFN-γ10ug/ml，24孔板培养细胞密度为6×106个/ml；4)培养4天后，细胞传代培养，24孔板一孔传3孔，加入除OVA以外的其他相应细胞因子和抗体。
3.Th1和Th2细胞分化成熟后的重复刺激1)取一定量Balb/c小鼠脾细胞以2000rads，5×106cell/ml进行辐射2)以1∶5的比例混合分化后的Th细胞与经过放射处理的脾细胞；3)加入OVA(2ug/ml)或conA(2.5ug/ml)或PMA&Inomycin或anti-CD3(2.6mg/ml)和anti-CD28(1mg/ml)(提前包被好)，刺激48h，24孔板培养细胞密度为6×106个/ml。
为了进一步确认所得到的细胞是Th1和Th2细胞，用ELISA方法测定所得细胞分泌IL-4和IFN-γ的情况。如图10A和图10B所示，Th1细胞高表达IFN-γ，而Th2细胞高表达IL-4，与已有报道关于Th1和Th2的描述相吻合，这就证实本发明人所诱导分化的细胞的确是Th1细胞和Th2细胞。
接着，本发明人通过cDNA array实验技术研究了重新刺激后的Th1和Th2细胞的基因表达谱，发现NGP在Th2细胞中高表达。利用RT-PCR和实时定量PCR对这一结果进行了进一步的验证，实验方法如下1.引物的设计与合成以编码NGP的cDNA序列为模板，通过Primer Premier引物设计软件，设计合成所需引物，引物由上海申能博采公司合成，具体合成的引物如表3表3
2.RT-PCR1)反转录体系(40ul)
a.将Oligo(dT)与RNA、H2O混匀后，70℃水浴5min，使RNA的二级结构打开；
b.从水浴中取出后，迅速冰浴2-3min，然后按上表所写加入其余溶剂；c.混合液37℃水浴2h；d.2h后，放入94℃水浴5min，以使eDNA-RNA杂交分子变性；e.冰浴5min后，立即使用或-20℃保藏备用；f.PCR(聚合酶链式反应)。
2)反应体系(50ul)
按照上述体系进行PCR，先将模板94℃变性2min，再按以下参数反应30个循环94℃，变性45s；68℃，退火45s；72℃，延伸1min。30个循环后，72℃延伸7min。PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
3.实时定量PCR(SYBR GREEN I染料法)1)标准配方
2)步骤首先PCR确定引物可以拉出目标条带；标准品模板为含扩增片断的质粒，作标准曲线需将质粒进行梯度稀释；接着进行引物稀释(预实验时，需摸索引物使用的最佳浓度)；然后按上述配方加入各组分；接着在Real-time PCR仪上进行反应；最后进行数据分析。
结果表明，NGP mRNA的确在Th2细胞中高表达，如图11A(RT-PCR方法)和图11B、图11C(实时定量PCR方法)所示。
实施例6 NGP在Th细胞分化过程中的表达情况在证实NGP在极化后的Th2中高表达后，本发明人进一步用RT-PCR研究了T细胞从 T细胞分化为Th1细胞和Th2细胞的过程中NGP的表达情况。
结果如图12所示，NGP在 T细胞是高表达的，接到分化刺激信号后，NGP表达消失。在刺激后的第五天NGP在Th2中的表达量又得到提高。
实施例7蛋白水平上Th2中高表达NGP的确认将表达的蛋白免疫兔子后，取血清得到抗NGP的多克隆抗体。为了确认这个多克隆抗体是否能够识别NGP，本发明人铺了2板293T细胞(购自ATCC)，分别转染pEGFP-N1质粒和NGP(cds)-pEGFP-N1质粒，24h后收获细胞。细胞经过超声、煮沸等处理后进行Western Blot。
如图13A所示，表明所制备的抗体可以识别外源转入的NGP。应用这个抗体进一步检测了NGP在Th1细胞和Th2细胞中的表达情况。如图13B所示，在蛋白水平上也表明NGP是在Th2中高表达。
实施例8 NGP定位于细胞质中经检测，NGP在N末端带有一个信号肽，这表明它可能是一个分泌蛋白。在前述实施例中，已经构建了NGP(CDS)-pEGF-N1。本发明人将这个质粒转染Hela细胞系，从而观测NGP在细胞内的定位情况。
结果如图14所示，NGP定位于细胞之中。细胞核用DAPI进行染色。
实施例9 NGP蛋白的功能实验本实施例中，对NGP蛋白的功能进行测试。将NGP-GST融合蛋白加入脾细胞，测试其抑制脾细胞增殖的情况。
采用的方法如下(1)分离DO11.10小鼠脾脏细胞；
(2)计数后，按每孔5×105个脾细胞加到96孔板中；(3)分四组，每组3个孔，每孔加入OVA至4μg/ml，IL-2至50U/ml。另外第二组需另外加入32μg NGP-GST蛋白，第三组加入160μg NGP-GST蛋白，第四组加入32μg GST蛋白。
(4)32小时后加入氢三(3H)，过16小时测CPM。
结果如图8所示，可见第二组和第三组能够显著抑制T细胞的增殖，并且第三组的抑制效果高于第二组。
由结果可知，NGP能够抑制脾细胞的增殖，其在脾细胞的生长和分化中起着非常重要的作用。
实施例10NGP基因扩增的特异性在用PCR方法从T细胞cDNA中扩增出NGP基因时，本发明人尝试了很多的方法，最终终于找到了适合其扩增的条件。本发明人发现，在底物、引物及PCR条件一致的前提下，采用LA DNA聚合酶(LA-taq)能够扩增出NGP基因，而采用其它的DNA聚合酶难以扩增出NGP基因。
本发明人采用如实施例1所述的扩增条件，分别用LA-taq(购自TaKaRa公司)和pfu-taq(购自TaKaRa公司)两种DNA聚合酶进行PCR扩增试验，结果见图9。可见，NGP基因及其表达不同于其它种类的基因，在对其进行扩增和表达时，具有特殊性，并非采用常规方法所能获得。
菌种保藏本发明的含表达载体NGP-pGEX-4t-1的大肠杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 206020，保藏日为2006年2月28日。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>嗜中性颗粒蛋白NGP的表达和纯化<130>061573<160>25<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1128<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>表达载体<400>1atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt60ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660ctggttccgc gtggatcccc ggaattcctt cgacaactaa gatatgagga gattgttgat 720agagccatag aggcatacaa ccaagggcgg caaggaagac ccctcttccg cctgctaagt 780gccactccgc cttctagtca gaatcctgct accaatatcc cactccagtt caggattaaa 840gagacagagt gtacttccac ccaggagaga cagcctaaag actgcgactt cctggaggat 900ggggaggaga gaaattgcac agggaaattc ttcagaaggc ggcagtcaac ctccctgacc 960ttgacctgcg acagggattg cagtcgagag gatacccaag aaaccagttt taatgataag 1020caagacgtct ctgaaaagga aaagttcgaa gatgtgcccc ctcacatcag gaacatttat 1080gaagatgcca agtatgatat catcggcaac atcctgaaaa atttctag 1128<210>2<211>375<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>表达载体<400>2
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220Gly Ser Pro Glu Phe Leu Arg Gln Leu Arg Tyr Glu Glu Ile Val Asp225 230 235 240Arg Ala Ile Glu Ala Tyr Asn Gln Gly Arg Gln Gly Arg Pro Leu Phe245 250 255Arg Leu Leu Ser Ala Thr Pro Pro Ser Ser Gln Asn Pro Ala Thr Asn260 265 270Ile Pro Leu Gln Phe Arg Ile Lys Glu Thr Glu Cys Thr Ser Thr Gln275 280 285Glu Arg Gln Pro Lys Asp Cys Asp Phe Leu Glu Asp Gly Glu Glu Arg290 295 300Asn Cys Thr Gly Lys Phe Phe Arg Arg Arg Gln Ser Thr Ser Leu Thr305 310 315 320Leu Thr Cys Asp Arg Asp Cys Ser Arg Glu Asp Thr Gln Glu Thr Ser325 330 335Phe Asn Asp Lys Gln Asp Val Ser Glu Lys Glu Lys Phe Glu Asp Val340 345 350Pro Pro His Ile Arg Asn Ile Tyr Glu Asp Ala Lys Tyr Asp Ile Ile355 360 365Gly Asn Ile Leu Lys Asn Phe370 375<210>3
<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3ggaagatcta tggcagggct gtggaag 27<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4acgcgtcgac gagatgggta gtggaggta 29<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5cggaattcct tcgacaacta agatatgagg30<210>6<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ggcgagctcg agatgggtag tggagg26<210>7<211>511<212>DNA<213>人工序列<400>7atggcagggc tgtggaagac ctttgtattg gtggtggcct tggctgtggt ctcctgtgag 60gcccttcgac aactaagata tgaggagatt gttgatagag ccatagaggc atacaaccaa120
gggcggcaag gaagacccct cttccgcctg ctaagtgcca ctccgccttc tagtcagaac180cctgctacca atatcccact ccagttcagg attaaagaga cagagtgtac ttccacccag240gagagacagc ctaaagactg cgacttcctg gagaatgggg aggagagaaa ttgcacaggg300aaattcttca gaaggcggca gtcaacctcc ctgaccttga cctgcgacag ggattgcagt360cgagaggata cccaagaaac cagttttaat gataagcaag acgtctccga aaaggaaaag420ttcgaagatg tgccccctca catcaggaac atttatgaag atgccaagta tgatatcatc480ggcaacatcc tgaaaaattt ctagggctgg a 511<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8ctttgtattg gtggtggc18<210>9<211>19<212>DNA<2t3>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>9ggtttcttgg gtatcctct 19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>10gattgttgat agagccatag a21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>11
cctgaactgg agtgggata 19<210>12<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>12ggaagatcta tggcagggct gtggaag 27<210>13<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>13acgcgtcgac gagatgggta gtggaggta 29<210>14<211>46<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>14agagccatag aggcatacag gaagatctat ggcagggctg tggaag 46<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>15cctgaactgg agtgggata19<210>16<211>54<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>16ggaagatcta tggcagggct gtggaaggga agatctatgg cagggctgtg gaag 54<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>17acgcgtcgac cggaaatttt tcaggatg28<210>18<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>18cgcggatccc cttcgacaac taagatatgg gaagatctat ggcagggctg tggaag 56<210>19<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>19ccggaattcg agatgggtag tggaggta 28<210>20<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>20cggaattcct tcgacaacta agatatgagg 30
<210>21<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>21ggcgagctcg agatgggtag tggagg26<210>22<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>22ggaagatcta tggcagggct gtggaag 27<210>23<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>23acgcgtcgac gactatttat cgtcatcgtc tttgtagtcg aaatttttca ggatg55<210>24<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>24ggaagatcta tgccttcgac aactaagata tgagg 35<210>25<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>25acgcgtcgac cggaaatttt tcaggatg 28
权利要求
1.一种制备嗜中性颗粒蛋白NGP的方法，包括以下步骤(a)PCR扩增获得嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列；(b)将(a)所述的嗜中性颗粒蛋白NGP的编码序列插入表达载体的多克隆位点中，获得插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体；(c)使(b)获得的插入了嗜中性颗粒蛋白NGP编码序列的表达载体转入宿主细胞，获得转化的宿主细胞；(d)培养转化的宿主细胞，从而表达出嗜中性颗粒蛋白NGP；(e)分离获得嗜中性颗粒蛋白NGP。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过PCR扩增嗜中性颗粒蛋白NGP的基因，并且，在PCR扩增时，采用LA-Taq DNA聚合酶作为DNA聚合酶。
3.一种NGP-GST融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有SEQID NO2所示的氨基酸序列。
4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求3所述的融合蛋白。
5.一种基因工程表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有嗜中性颗粒蛋白的编码序列，或含有权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5所述的表达载体。
7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌Escherichia coli BL21/pGEX-4t-1-NGP，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 206020。
8.嗜中性颗粒蛋白NGP的用途，其特征在于，用于作为鉴定Th2细胞的分子标记；或用于制备调节Th2细胞生长和分化的制剂；或用于筛选调节Th2细胞生长和分化的制剂。
9.嗜中性颗粒蛋白NGP的用途，其特征在于，用于制备抑制脾细胞增殖的组合物。
全文摘要
本发明提供了一种制备嗜中性颗粒蛋白NGP的方法，本发明还公开了用于制备所述嗜中性颗粒蛋白NGP的基因工程表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞。本发明人经过长期研究，首次实现了NGP的表达，从而克服了以往本领域人员难以表达NGP蛋白的技术难点。并且，本发明人首次证实了NGP在Th2细胞中高表达，从而为研究和筛选调节脾细胞增殖的药物提供了新的途径。
文档编号C12N15/65GK101092616SQ200610027829
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月20日 优先权日2006年6月20日
发明者孙兵, 谢德鄂, 刘智多, 李振虎, 钟超 申请人:中国科学院上海生命科学研究院