专利名称：新型微核糖核酸定量pcr(聚合酶链式反应)检测方法
技术领域：
本发明专利涉及微RNA(microRNAs)和小干扰RNA(siRNAs)的检测和表达定量分析；本发明还涉及其他与人类疾病相关(如癌症)核糖核酸如非编码RNA(non-coding RNA)、mRNA剪接变异体(mRNA splice Variant)的检测和表达定量分析。
背景技术：
本发明运用实时定量PCR(Reai-time PCR)并结合分子信标探针(Molecular Beacon)技术，适用于以多种不同制备方法得到的RNA样本(如总RNA、细胞裂解物等)为模板，对小干扰RNA、生物细胞内微小RNA及其他核糖核酸靶序列的特异性检测和表达定量分析。微RNA(microRNAs)核糖核酸(RNA)很长一段时间内被人们认为只是起到将基因组DNA内储存的遗传信息转录出来并翻译成蛋白质的功能。随着人类基因组计划的开展和深入，人们发现绝大部分的基因组DNA并不编码蛋白质，而是转录出大量的非编码RNA(non-coding RNA)(Wong et al.2001，Genome Research111975-1977)。近来，大量的小的非编码RNA(small non-coding RNA)相继被发现，人们将这种小的非编码RNA统称为微小RNA(microRNAs)。最早发现的微小RNAlin-4和let-7，被认为在线虫不同生长发育阶段都起着重要的调控作用(Lee et al.1993，Cell 75843-854；Reinhart et al.2000，Nature 403901-906)。微小RNA广泛存在于各种不同生物体内，并且表现出多种多样的表达差异，这些都提示着microRNAs可能有非常广泛的生物功能(Ke et al.2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)。近来的研究工作表明，microRNAs可在包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢和细胞分化等多个水平上进行基因表达调控。研究者们相信，microRNAs很可能代表在一个新发现层次上的基因表达调控方式。
MicroRNAs(microRNAs)是生物体内天然产生的一群高度保守的短的单链RNA(约21～25个碱基)。细胞内microRNAs以两种形式即前体和成熟体的形式存在，只有短的成熟体具备生物活。该成熟体由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。(Ambros et al.2003，RNA9277-279)。到目前为止，已经有超过700余种microRNAs相继在人类、线虫、小鼠、植物体中被发现，microRNAs数据库如Sanger Institute也相继建立。根据现有的发现可将microRNAs的特点概括如下(Ke et al.2003，Curr.Opin.Chem.Biol.7516-523)1.microRNAs成熟体是长约21～25个碱基单链RNA；2.microRNAs成熟体由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的microRNAs前体分子经过Dicer酶加工而成。
3.MicroRNAs由特定基因编码，但不翻译成蛋白质；越来越多的证据表明，microRNAs在基因表达调控中起着非常重要的作用。最早被发现的两个microRNAs——lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶mRNA3’非编码区端，以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制，进而抑制蛋白质合成，阻断mRNA的翻译(Lee et al.1993，cell75843-854；Reinhart et al.2000，Nature 403901-906)。MicroRNAs与其靶RNA的互补可以引发靶RNA的降解，尽管许多microRNAs和其潜在的目标靶之间并非完全互补(Hut-vanger and Zamore 2002，Science2972056-2060)。MicroRNAs的重要功能已经使其成为当前基因功能研究领域内的一个新的热点。
微RNA(microRNAs)与人类疾病对人类基因组的研究表明，microRNAs在人类的生长发育和疾病的发生中都起着非常重要的作用，许多疾病已经证实和microRNAs及其作用机制密切相关。例如脊髓性肌萎缩症(SMA)，该病是一类由于脊髓前角细胞变性导致近端肌无力、肌萎缩的常染色体隐性遗传性疾病。SMN基因(survival motor neuron)被认为是SMA的决定性基因。SMN基因复合体中的两个蛋白质Gemin3和Gemin4同样也是miRNP(microRNAs复合体)的组成成分(Paushkin et al.2002，Curr.Opin.Cell Biol.14305-312)。另外的研究发现miR-224与脆性X染色体脑发育迟缓症(FXMR)同样具有密切的关系(Dostie et al.2003，RNA9180-186)。
在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中研究发现，miR-15a和miR-16-1存在缺失或下调，miR-15a和miR-16-1的表达与CLL中Bc12的表达相反，这两个microRNA在转录后的水平上对Bc1-2起负调节作用。在白血病细胞系中已经观察到，含有9bp Bc1-2互补序列的miR-15a和miR-16-1，通过抑制Bc1-2蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。miR-15a和miR-16-1是Bc1-2天然的反义作用因子，可以用于治疗Bc1-2过表达的肿瘤(Cimmino A，et al.Proc Natl Acad Sci USA.2005Sep 27；102(39)13944-9.)。
microRNA的表达情况与包括I期肿瘤在内的肺腺癌的生存相关。单因素分析表明，hsa-mir-155高表达和hsa-let-7a-2低表达与预后不良有关；多因素分析表明，hsa-mir-155高表达是预后不良的因素(Yanaihara N，et al.Unique microRNA molecular profiles inlung cancer diagnosis and prognosis.Cancer Cell.2006 Mar；9(3)189-98.)。
俄亥俄州立大学的Stefano Volinia等人通过分析来自肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品540份，发现了由过量表达的大部分microRNAs组成的实体癌症miRNA信号，在这些miRNA中包括miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106a和miR-155。而对于编码蛋白的肿瘤抑制子和致癌基因，这些microRNAs差异表达作用的靶目标会大量富集，其中得到证实的是肿瘤抑制子RB1和TGFBR2。这说明microRNAs在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用(Stefano Volinia，George A.Calin，PNAS February14，2006，103(7)2257-2261)。
有理由相信，随着对miRNA介导的基因表达调控作用机制的不断深入理解和发现，将促进新的治疗方法的发展并可能带来临床用药的革命(Nelson et al.2003，TIBS28534-540)。小干扰RNA(siRNAs)和RNA干扰(RNA interference)RNA干扰(RNA interfe ring，RNAi)现象是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程(Fire et al.1998，Nature391806-811)。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterfering RNA，siRNA)(Lipardi et al.2001，Cell107297-307)，随后siRNA作为介导子与RISC蛋白复合物结合并激活该复合物，引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制(Zhang et al.2002，EMBO J.215875-5885；Nyknenet al.2001，Cell107309-321)。
定量PCR(Real-time PCR)技术定量PCR技术是近年来发展起来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的基础上添加了具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在一起，通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，并具有快速、避免交叉污染等特点，在基因检测、基因表达、SNP分析等领域得到广泛的应用。
microRNAs和siRNAs的检测只有21～25个碱基左右大小并且又时常处于低水平表达状态的microRNAs需要一种灵敏的检测定量分析方法。但由于缺乏其他有效的检测方法，现在多数的研究者不得不采用传统的Northern blot或核酸酶保护实验的方法来检测分析样本中的microRNAs(Reinhart et al.2000，Nature403901-906；Lagos-Quintana et al.2001，Science294853-858；Lee and Ambros 2001.Science 294862-864)。也有报道用引物步移(Primer extension)的方法来检测miRNAs(Zengand Cullen 2003，RNA9112-123)。以上方法具有一个共同特点就是都需要进行凝胶电泳及繁琐冗长的实验操作步骤，这就导致了很低的检测灵敏度和精确度，同时还要大量消耗RNA样本，对于某些宝贵的组织样本而言，用上述方法尤其是Northern blot或核酸酶保护实验来研究microRNAs几乎是不可行的。
与Northern blot的方法相比，利用基因芯片来检测microRNAs在高通量方面有了长足的进步。然而，基于固相或液相杂交的基因芯片检测技术同样要求高浓度的RNA样本来保证足够高的杂交效率和检测信号，因此对于那些稀少的表达量很低的microRNAs，基因芯片往往很难检测。此外，在应用基因芯片进行杂交之前，需要预先将microRNAs从RNA样本中分离纯化出来，以避免microRNAs前体分子的干扰及其造成的背景信号(Krichevsky et al.2003，RNA 91274-1281)。基因芯片技术适合于从众多microRNAs分子中初筛感兴趣的目标分子，然后再用更为灵敏的检测方法如定量PCR来进行验证。
2003年Grad等人报道了应用PCR技术来检测microRNAs，由于该方法需要预先从凝胶中回收microRNAs，因此只适合于miRNA的克隆，而很难成为实验室常规的检测方法(Grad et al.2003，Mol.Cell 111253-1263)。2004年Schmittgen等人报道了一种应用定量PCR分析microRNAs前体分子的方法，但这种方法仍未能解决对microRNAs成熟体进行检测的难题(Schmittgen et al.2004，Nucleic Acids Res.32e43)。2005年Caifu Chen等人报道了应用TaqMan-MGB探针对microRNAs分子进行定量PCR检测的方法，该方法与其他方法相比具有检测灵敏度高、样本消耗量少的特点，但是TaqMan-MGB荧光探针合成价格昂贵又使其的应用受到限制(Caifu Chen et al.2005，NucleicAcids Res.33e179)。
本发明应用灵敏的定量PCR技术对样本中的microRNAs及siRNAs进行检测，只需1～10ngRNA样本即可进行检测，解决了传统Northern blot、基因芯片技术样本消耗量大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点；新型分子信标探针的采用，解决了TaqMan-MGB探针合成价格昂贵的缺陷，是一种方便、快捷、经济的检测方法。
发明内容
随着基因组功能、表达调控研究的不断深入及对miRNAs的不断发现，研究者们愈来愈需要一种便捷、灵敏、经济并且能够从复杂的RNA样本中特异性地检出miRNAs和siRNAs的检测方法。本发明解决了前面所述的传统检测方法在特异性、灵敏度、检测成本等方面的不足，可从极少量的RNA样本(低至1ng总RNA)中特异性地检出miRNAs；避免了miRNAs前体分子的干扰，即使相差一个碱基的高度同源miRNAs也可被精确区分；在2个小时内得到检测结果，大大缩短了实验操作时间并降低了实验成本。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是1.应用茎环状的逆转录引物(Reverse Transcript primer)将RNA样本中的miRNAs分子逆转录成cDNA。设计的RT引物5’端和3’端临近碱基序列互补，形成茎环状结构；3’端最后5～7个碱基与靶miRNA分子的3’端互补，以实现对靶miRNA分子的结合并完成逆转录反应。在整个逆转录反应过程中，RT引物都不会改变其茎环状的结构。这种茎环状的结构较之常规的线性RT引物具有更高的特异性和逆转录效率。茎环状结构所造成的空间位阻效应可以避免miRNAs前体分子的非特异性结合，同时也可以排除双链的基因组DNA对逆转录反应造成的干扰。这种RT引物的采用，大大降低了对RNA模板的要求，即使简单地将细胞裂解不做进一步处理，也可作为逆转录反应的底物。同时，应用该RT引物可在同一反应体系内进行多个逆转录反应，从而实现对多种不同miRNA分子的同时检测。
2.应用逆转录引物中的部分序列作为PCR的引物。为保证PCR(聚合酶链式反应)的高效进行并保证一定的序列特异性，一般PCR引物的长度都在20个碱基左右，一对PCR引物碱基序列在40个碱基左右。因此对于只有21～25个碱基的微小RNA而言，应用PCR技术对其进行扩增和检测是一个巨大的挑战。为解决这个问题，本发明采用逆转录引物中的部分序列作为PCR的引物之一，然后根据靶miRNA设计PCR的另一个引物，从而实现对靶miRNAs的扩增。
3.应用分子信标(Molecular Beacon)探针监测miRNAs的扩增并对模板中miRNAs进行定量分析。分子信标探针是一种发夹状的寡核苷酸探针，由5～7个GC配对的茎区和序列特异性的loop环区构成。荧光基团和荧光淬灭基团通常标记在探针的5’端和3’端。当探针的茎区处于关闭状态时，拉近了荧光基团和淬灭基团的物理距离，使得荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收。在PCR的退火阶段，当miRNAs或扩增子模板存在时，探针序列特异性的loop环区与模板结合，可使探针打开发夹状的二级结构，从而产生荧光信号。分子信标探针的特点在于具有很强的序列特异性，当序列特异性的环区与模板之间存在不匹配碱基时，探针将仍然保持发夹状结构而不与模板结合。
4.另外一个影响分子信标探针与模板结合的因素是定量PCR的退火温度。本发明利用RT引物3’端的临近碱基作为探针5’端茎区和loop环区的构成部分，在探针的3’端设计5’端互补序列以形成发夹结构。这种设计达到的效果是避免了探针与引物之间二聚体的形成同时又保证探针了具有足够高的Tm值，使其在定量PCR的退火阶段能与模板发生特异性的结合。
本发明采用灵敏的定量PCR技术，可在2个小时内从低至1ng的总RNA中特异性的检出靶miRNA，解决了传统Northern blot及基因芯片技术样本消耗量巨大，实验操作繁琐，检测灵敏度低等缺点；采用茎环状结构的逆转录引物，提高了逆转录反应的特异性和效率，降低了对样本RNA的要求，即使简单地将细胞裂解而不作进一步处理，也可作为RT及PCR反应的底物；应用改进的分子信标探针，提高了定量PCR反应的特异性，避免了microRNA前体分子和基因组DNA污染对定量PCR反应的影响。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是本发明对miRNAs进行定量RT-PCR检测的技术线路图。
图2是本发明采用的逆转录引物图例。
图3是分子信标探针图例。
图4是分子信标探针的熔解杂交曲线。
图5是以合成的Let-7a和Let-7b microRNAs为模板进行Real-time RT-PCR。
图6是Let-7a定量PCR标准曲线。
图7是以抽提的总RNA为模板对Let-7a进行定量PCR检测。
图中1.逆转录引物通过5’端和3’端临近碱基形成茎环状结构，2.逆转录引物的microRNA序列特异性区域，3.茎环状分子信标探针的5’端和逆转录引物的3’端具有相同序列，4.Let-7a分子信标探针随温度的不断降低而关闭茎环结构，5.Let-7a分子信标探针与Let-7a模板的杂交曲线，6.Let-7a分子信标探针与Let-7b模板的杂交曲线，7.Let-7a分子信标探针与Let-7a模板的扩增曲线，8.Let-7b分子信标探针与Let-7b模板的扩增曲线，9.Let-7a分子信标探针与Let-7b模板未出现扩增，10.Let-7b分子信标探针与Let-7a模板未出现扩增。
具体实施例方式
1.Let-7a和Let-7b引物和探针的设计设计Let-7a RT引物为“5’-CCTGCGGCAAGTCTACGAACATATAGCATTCACCCGCAGGAACTAT-3’”，如图2；其中5’端碱基序列“5’-CCTGCGG”和3’端“CACCCGCAGGAACTAT-3’”中的“CCGCAGG”互补，使RT引物形成茎环状结构，3’端“AACTAT-3”与Let-7a的3’端互补。以RT引物中的部分序列“GGCAAGTCTACGAACAT”为PCR引物之一，根据Let-7a序列设计PCR的另一个引物为“GCTTGAGGTAGTAGGTTG”。以RT引物3’端“CCGCA”序列为Let-7a分子信标探针的5’端茎部，设计探针序列为“FAM-5’-CCGCAGGAACTATACATGCGG-3’-DABCYL”，如图3，其中FAM为荧光报告基团，DABCYL为荧光淬灭基团。
按照同样的原则设计Let-7b的RT引物“5’-CCTGCGGCAAGTCTACGAACATATAGCATTCACCCGCAGGAACCAC-3’”及PCR引物“GGATTGAGGTAGTAGGTTGT”和“GGCAAGTCTACGAACAT”，Let-7b分子信标探针序列为“FAM-5’-CCGCAGGAACCACACTGCGG-3’DABCYL”。
2.用合成的Let-7a探针互补链“GGTTGTATAGTTCCTGCGGGTGAA”及Let-7b探针互补链“GGTTGTGTGGTTCCTGCGGGTGAA”分别与Le t-7a分子信标探针进行熔解曲线和杂交实验。熔解曲线反应体系为40ul，0.2uM探针，5×qPCR Buffer 0.8ul；杂交实验反应体系为40ul，0.2uM探针，0.5uM Let-7a探针互补链或0.5uM Let-7b探针互补链，5×qPCR Buffer0.8ul。温度变化为从90℃每个循环降低0.5℃并持续25秒，依次降至40℃并采集荧光信号。Let-7a探针的熔解曲线实验反映当温度逐渐降低时，探针的茎环结构也逐渐关闭，导致反应管内荧光信号的降低，如图4中曲线4所示。Let-7a探针与Let-7a探针互补链的杂交实验表明当反应体系内存在探针的互补模板时，探针可与之结合并打开茎环状结构，导致反应管内荧光信号增强，如图4中曲线5所示。Let-7a探针与Let-7b探针互补链的杂交实验表明，当模板与探针存在不匹配碱基时，探针将仍保持关闭状态而不与之结合，如图4曲线6所示。3.在25ul RT反应体系(5×RT reaction buffer 5ul，100U MMLV)中加入0.01nM的合成Let-7a和Let-7b RNA各1ul，逆转录反应(16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟)后取4ul逆转录产物加入40ul定量PCR反应体系(5×qPCR buffer 8ul，0.2uM primer sets，0.2uMLet-7a probe，3mM Mg2+，2U Taq酶)，进行定量PCR反应(94℃3分钟，94℃15秒，55℃25秒，72℃25秒，40个循环)后分别得到Let-7a和Let-7b的扩增曲线，其Ct值分别为13.44和12.56，如图5所示。
4.在含有Let-7a、Let-7b探针的定量PCR反应体系中分别加入Let-7b、Let-7a逆转录产物4ul进行定量PCR反应(94℃3分钟，94℃15秒，55℃25秒，72℃25秒，40个循环)。Let-7a和Let-7b只存在两个碱基的差异，同源性高达90％；应用本方法对其分子信标探针的特异性进行检测，实验结果为Let-7a、Let-7b两分子信标探针均未出现非特异性检出。说明本方法可显著区分高度同源的microRNAs分子。结果如图5所示。
5.Let-7a的定量PCR扩增标准曲线。在25ul RT反应体系(5×RT reaction buffer 5ul，100U MMLV)中加入从5×10-3fM至5×104fM的合成的Let-7a RNA，进行逆转录反应(16℃30分钟，42℃30分钟，85℃5分钟)；取4ul逆转录产物加入40ul定量PCR反应体系(5×qPCR buffer 8ul，0.2uM primer sets，0.2uM Let-7a probe，3mM Mg2+，2U Taq酶)，进行定量PCR反应后得到Let-7a的标准曲线，如图6所示。标准曲线的Y轴截距44.4，斜率-4.07，相关系数1.0，均方差0.09。
6.将从组织细胞中抽提得到的总RNA按250ng、50ng 5倍梯度稀释至0.016ng分别作为逆转录反应模板进行RT反应后，取4ul RT产物进行定量PCR反应，得到的Ct值分别为14.71，17.60，20.04，23.01，25.84，28.82，32.02，如图7所示。说明本方法与起始模板加入量具有很好的相关性，并且可从极低量的总RNA中检出目标microRNA分子。
权利要求
1.一种对非编码RNA如微小RNA、小干扰RNA的扩增、检测、鉴别、定量分析的方法，其特征是应用荧光标记的分子信标探针对靶核酸进行定量PCR检测和分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征是设计逆转录引物的5’端和3’端临近碱基互补，以形成茎环状结构；利用茎环状逆转录引物的3’端碱基与靶核酸分子配对结合；应用逆转录酶进行逆转录反应，合成靶核酸分子的互补DNA链；应用茎环状逆转录引物中的部分序列作为定量PCR的引物之一；应用荧光标记的分子信标探针对逆转录得到的cDNA进行定量PCR检测分析。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征分子信标探针的5’端与逆转录引物的3’端临近碱基具有相同序列；探针具有和靶核酸相同或互补的序列；探针的5’端和3’端序列互补以形成茎环状结构；探针标记有荧光基团。
4.一个对非编码RNA如微小RNA、小干扰RNA的扩增、检测、鉴别、定量分析的试剂盒，该试剂盒具备逆转录反应、PCR反应组分和荧光标记的分子信标探针。
全文摘要
一种新的微小RNA(microRNAs)和小干扰RNA(siRNAs)定量PCR检测方法。它应用逆转录引物的5′端和3′端临近碱基互补形成茎环状结构，利用逆转录引物3′端与靶核酸互补结合，应用逆转录酶进行逆转录反应；以逆转录引物中的部分序列作为PCR引物之一，对逆转录反应得到的cDNA进行扩增；应用荧光标记的分子信标探针对定量PCR进行实时监测。
文档编号C12Q1/68GK101082060SQ20061002721
公开日2007年12月5日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者谭玉龙, 张中华, 段春晓, 张佩琢 申请人:上海吉玛制药技术有限公司