专利名称：甲醇酵母生产人激肽释放酶－1的制作方法
技术领域：
本发明是采用基因工程的手段，通过甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统大规模获得一种新型重组蛋白-------甲醇酵母表达的重组人激肽释放酶-1(Recombinant HumanKallikrein-1，r-hK1)，特别对r-hK1分子性质的研究，以及体内、体外活性的测定和试验，表明r-hK1可望成为治疗脑梗塞的药物。
背景技术：
早在1926年，Frey等就从人尿液中获得了一种能引起血压下降的成分，当时称之为血管舒缓素，不过，后来的研究者发现，该蛋白酶类成分也广泛分布于血浆、胰腺、肾脏、唾液腺、肠、胰液之中，尤其胰腺中含量最高。1930年，希腊的Kraut H.等将从胰腺分离提取的这种成分命名为Kallikrein(希腊语Kallikreas是‘胰腺’，故称胰腺中获得的蛋白酶类为Kallikrein)。但是，随着对这一类蛋白酶功能、分布和作用机理等方面的深入研究，在不同时期，研究人员对Kallikrein有着不同的称谓，例如Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin。事实上，在中文译名中，‘激肽释放酶’‘激肽原酶’、和‘激肽酶’等称谓也是混用的。目前，国内对Kallikrein的中文译名的使用也不统一，甚至近年来国内发表的文章中仍对同一种成份使用不同名称，例如‘尿激肽原酶’、‘尿激肽释放酶’、‘胰激肽原酶’、‘胰腺激肽释放酶’、‘组织激肽释放酶’等。
在本专利中Kallikrein一词译为‘激肽释放酶’，Kininogenase、Kallidinogenase和Kininogenin这三个词中包含有激肽原或激肽一词的词根，似乎应称为‘激肽原酶’更妥。虽然‘激肽释放酶’或‘激肽原酶’最早是在胰腺等特定组织器官中发现的，但是，由于其在动物体内分布广、种类多，所以，在本专利的描述中将不再用组织或器官或来源等词语来限定提及的某种激肽释放酶。
早期，研究者将人的激肽释放酶(Human Kallikrein，下文中简称hK)分成血浆型和组织型两大类。血浆型hK主要是在人的肝脏中表达，再分泌进入血液的，它参与血液的凝固、纤维蛋白的水解、血压的调节和炎症反应等生理过程；而组织型hK，是在胰腺、肾脏、唾液腺、乳腺、卵巢、睾丸和前列腺等部位产生，能对一些多肽(如，激肽原、胰岛素原、肾素原等)进行翻译后加工，从中释放出具有生理活性肽类(如，激肽，胰岛素、肾素等)。现在，根据含量的高低以及发现的先后顺序，国际上已经统一将除血浆型hK之外的所有组织型hK进行了命名，依次为hK1、hK2、hK3.......hK15等，目前已经发现并命名的有15种之多(陈渝春国外医学·生理、病理科学与临床分册.2003，23(4)386～88；Yousef GM，ObiezuCV，etal Human tissue kallikreinsfrom gene structure to function and clinical applications.Adv.in Clin.Chem.2005，3911-79.)。追溯早期研究者所描述的组织型hK，也就是来自胰腺、肾、唾液腺和尿液中hK不难发现，它并不包括后来发现并命名的这些种类的组织型hK。实际上，早年文献中所说的组织型激肽释放酶、胰腺激肽释放酶、唾液腺激肽释放酶等按新分类标准，都是同一种成分，应该称之为人激肽释放酶-1(Human Kallikrein 1，简称hK1)，这也是本专利要描述的对象。本专利中将酵母分泌表达的hK1称为重组人激肽释放酶-1(Recombinant Human kallikrein-1，简称r-hK1)。
hK1属于丝氨酸蛋白酶类的肽酶S1家族(或称激肽释放酶亚族)。它能够特异性水解低分子量或高分子量激肽原(Kininogen)蛋白分子中的Met-Lys或Arg-Ser氨基酸残基间的肽键，分别释放出激肽Lys-bradykinin或Kallidin。这些水解释放出来激肽将对机体的血压、电解质平衡、炎症反应和细胞增殖发挥调节作用。特别应该注意的是，hK1能优先切开小分子生色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA)中-Arg-pNA之的间肽键，这也是采用S-2266测定天然的hK1和r-hK1活性的基础。(Gurunathan Laxmikanthan.etal 1.70 A0 X-RayStructure of Human Kallikrein 1Structural Changes Upon Peptide Inhibitor/SubstrateBinding Proteins.Structure，Function，and Bioinformatics 58802-814，2005)。
hK1在人体中的含量最高，其代谢后大部分又以完整的有活性的糖蛋白形式经肾脏排泄。目前，从人尿中分离纯化的hK1已经用于临床实践。例如，广州天普公司2005年4月获得SFDA生产批文的人尿激肽原酶(商品名‘凯力康’，注射用尤瑞克林)就是来自人尿的生物提取品。人的hK1属于热稳定性单链糖蛋白，由于糖基化的程度不同，所以分子量变化范围也比较大(MW27～40kDa)。
国内外对采用基因工程的方法生产hK1的工作都进行过不少研究。德国的研究者，1989年就进行了在E.coli中表达人唾液腺hK(即hK1)的研究工作(Angermann，A.etal Cloningand expression of human salivary-gland kallikrein in E.coli.Biochem J 1989，262(3)787-793)，但每升发酵液中的表达产量只有200～500μg，而Jing Wang等在美国(Jing Wang，Julie Chao etal Purification and characterization of recombinant tissue kallikrein from E.coliand yeast.Biochem.J.1991，27663-71)用E.coli和啤酒酵母(S.cerevisiae)系统表达大鼠组织型激肽释放酶(类似hK1)，并用DEAE-Sepharose CL-6B结合Aprotinin-亲和介质进行分离纯化，结果发现E.coli表达的N-端多一个蛋氨酸(Met)的大鼠激肽释放酶的活性同天然的并没有差别。但是，利用酵母α-信号肽分泌表达大鼠激肽释放酶时，有一部分表达产物不能顺利切除信号肽，这样活性激肽释放酶产量极低(约0.5～1mg/L发酵上清液)。另外，他们在E.coli表达的也多是包含体，表达产量很低，采用放射免疫分析法进行定量，包含体的产量大约只有30～50mg/L发酵液。1993年，德国的研究者Georg Fertig等(GeorgFertig etal Biotech-nological aspects of the production of human pro-kallikrein using theAcNPV-baculovims-expression system Cytotechnology 1167-75，1993)用昆虫核形多角体病毒(AcNPV)表达系统在昆虫细胞中表达人激肽释放酶原(Human Pro-kallikrein，Pro-hK1)，筛选出的高表达细胞株在连续培养13天后，5L罐发酵所获得的Pro-hK1折算成活性单位总产量也大约有7960U。之后，Lu等(Lu HS，Hsu YR，etal Isolation andcharacterization of human tissue kallikrein produced in E.colibiochemical comparison to theenzymatically inactive prokallikrein and methionyl kallikrein.Protein Expr Purif.1996，8(2)215-26.)在E.coli表达了Pro-hK1和Met-激肽释放酶(Met-hK1)，Pro-hK1大体经过表达、包含体溶解、蛋白折叠复性、嗜热菌蛋白酶酶切激活、层析分离纯化等步骤后，获得了与天然品具有同样的生物学活性hK1。Pro-hK1和Met-hK1的结构虽然与hK1相似，但是都没有生物学活性，这似乎同前面Jing Wang等研究者的结果是相矛盾的。同时，这些研究者(LuHS，etal Purification and characterization of human tissue prokallikrein and kallikrein isoformsexpressed in Chinese hamster ovary cells.Protein Expr.Purif.1996，8(2)227-37.)又在CHO中表达人的基因组全长前激肽释放酶原基因(Preprokallikrein，Prepro-hK1)，重组激肽释放酶原这种无活性的酶原被大量分泌到发酵液中，在纯化过程中，经过嗜热菌蛋白酶酶切激活后，就可以将Pro-hK1和hK1分别纯化出来。所获得的rhK1同天然品比较，其比活性没有明显区别，但是Pro-hK1或hK1的分子本身并不均一，这些蛋白的分子量和电荷有差别。研究者推测是分子的N-糖基化修饰程度以及糖链的唾液酸残基数目不同所致。
有关hK1基因工程生产的突破性工作应该是Hedy Chan等(Hedy Chan，etal Expressionand Characterization of Human Tissue Kallikrein Variants.Protein Expr & Purif.1998，12361-370)将人的三种激肽释放酶原变异体(Pro-hK1)基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中分泌表达，获得了Pro-hK1蛋白，再经过胰蛋白酶切割，就可以获得hK1。研究者从人体不同组织的cDNA文库中，采用PCR法钓出Pro-hK1基因，获得了三种氨基酸残基略有不同的Pro-hK1基因(这中变异是PCR过程中产生的点突变或是组织中实际就有的差异尚未确定)。甲醇酵母表达的产量比以前的研究报道的都要高的多，达到约30mg/L发酵上清液，但是分泌表达出的rhK1在SDS-PAGE电泳时有两条带，产品不均一。
在国内，中科院大连物理化学所的研究者等描述了(Yang Q.etal Purification of humantissue prokallikrein excreted from insect cells by liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal.2005，39848-52.)用三步液相层析法，纯化由昆虫细胞表达的Pro-hK1，得率为57％，产品纯度为95％。但是，这项工作也只能视作Georg Fertig等研究者工作的延伸。不过，到目前为止，将昆虫细胞表达的成分用于治疗性药物的产品尚没有报道，所以这方面的工作目前尚不具备医药用途。
综上可见，国外的这些在E.coli、CHO、昆虫细胞、啤酒酵母或甲醇母中进行的研究，都是Pro-hK1或Prepro-hK1或Met-hK1的表达为主，而进行直接分泌表达hK1蛋白的工作时，发现信号肽序列并不能顺利切除。除了Hedy Chan等获得了产量稍高的工程菌外，其它研究者的工作基本上都属于纯研究性质的，从其产量、制备成本以及活性的等方面来看，也都表明大量制备rhK1极为困难。Hedy Chan等也是先获得Pro-hK1，在酶切处理后获得hK1的，尽管他们发现Pro-hK1在分泌时有一部分会直接以hK1形式分泌，但还有一部分是以Pro-hK1形式分泌入发酵上清中。因此，这种表达方式从产量和纯化过程来看也不具备生产价值。
虽然国内的研究者也进行了E.coli中表达hK1的研究，如广州的李体远等(李体远等人组织激肽释放酶成熟蛋白的纯化及活性分析《中国生物制品学杂志》18(1)33～35，2005)，杜珙，李体远等人胰激肽原酶的表达《中国药学杂志》38(6)465～467，2003)用pMBP载体，在E.coli中，将hK1同麦芽糖结合蛋白(MBP)进行融合分泌表达，在6L罐发酵的条件下，总共只获得了24mg MBP-hK1融合蛋白，经过凝血酶切割，才能获得有活性hK1。这些研究同国外在E.coli中的工作一样，不仅表达产量低，也没有解决纯化问题。袁新清等(袁新清 陈劲春 人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达《北京化工大学学报》31(6)33～35，2004)在甲醇酵母表达表达系统中直接表达hK1，发酵上清中hK1产量约40mg/L，而从研究者提供的信息中也不清楚其表达产量的确定方法，也没有这项研究的后续性工作。综合目前有关hK1的研究，所有r-hK1的制备有面临工程菌株表达产量底，产品不均一，纯化工艺复杂，有效收率很低的缺点。
本专利是根据Genebank中已经公布的人hK1基因序列资料，合成其成熟蛋白基因序列的5`-和3`-引物，从商品化的人肾cDNA中钓取了hK1基因。将该基因插入到Invitrogen公司的pPICZ α A表达载体的限制性内切酶XhoI和NotI位点之间，线性化处理表达载体后，电转化甲醇酵母宿主菌X33，在YPD+Zeocin抗性平板上筛选阳性克隆，并按常规操作筛选获得了高表达的工程菌株。该菌株可以利用载体自身的酵母α-信号肽分泌表达r-hK1蛋白，并且没有发现α-信号肽无法切除的情况发生，表达产量高达1.25～1.35g/L发酵上清液，r-hK1产品虽有糖基化修饰程度的差别，但蛋白的N-、C-端均一，通过纯化过程可以获得糖基化程度一致的r-hK1蛋白。
发明内容
1.hK1基因的获得和pPICZα-hK1表达载体的构建 综合GeneBank中已经获得的人激肽释放酶-1(Homo sapines Kallikrein-1)基因(AY094609、NM-002257、BC005313、X13561、AY890098、AY890097、AY703451)的序列信息，设计扩增hK1基因的5`-和3`-引物，以Panomics公司的人肾cDNA文库为模板，用PCR法获得了人hK1基因。
为将目的基因正确地插入到pPICZ α A载体中，5′-引物带有XhoI位点(CTCGAG)，并在XhoI位点和hK1基因前加入Kex2蛋白酶的识别序列Lys-Arg对应的密码子AAAAGA，3`-引物是在hK1的羧端最后一个氨基酸残基的密码子之后添加终止密码子TAA和限制性内切酶NotI位点(GCGGCCGC)，这样一来，PCR出的hK1基因经过XhoI和NotI双切后就可以插入到pPICZ α A载体的XhoI-NotI位点之间，这样就获得了分泌型表达载体pPICZ α-hK1。
2.工程菌株的筛选 将测序确认为正确的pPICZ α-hK1表达载体用SacI线性化处理，电转线性化后的hK1表达载体至甲醇酵母X33感受态细胞中，铺YPDZ(YPD+1.5％Agar+500μg/ml Zeocin)平板，筛选阳性克隆。用YPD培养液增殖阳性克隆，约6～8小时，当菌体OD500达到2～3时，保存一份菌液为原始种子，并将其余菌液4000rpm离心，上清冻存作对照，而将菌体悬浮后转入诱导培养液BMMY，300rpm振荡培养，每过12小时补无水甲醇至甲醇之终浓度为0.5％，如此维持甲醇诱导状态约48小时。用诱导前上清作对照，电泳检测是否有目的蛋白hK1条带出现。同时，根据hK1活性测定的标准方法(见实施例2)测定活性变化，并根据活性差别，筛选更多数目的阳性克隆，以便获得高表达的r-hK1工程菌株。
3.发酵工艺的确定 甲醇酵母的发酵可分为菌体增殖、限速生长和诱导表达这三个相辅相成的阶段，控制好这三个阶段的关键性参数就能获得目的蛋白的高表达。
菌体增殖阶段整个发酵阶段的温度均为30.0℃。用氨水将初始全盐培养基的pH值调为5.0，起始搅拌转速300rpm，通气量0.5vvm，溶氧DO100％，进行菌体增殖培养。当罐中起始培养基内的甘油耗尽后，DO值会急剧上升(DO Spike)，继续补充碳源(甘油或葡萄糖等)提高菌体密度，此时，即进入发酵的限速生长阶段。
限速生长阶段维持DO≥20％，继续流加甘油，使发酵液中的菌体湿重达到180～200g/L。当菌体湿重达到要求后就用氨水，将发酵的pH值上调为6.0，准备进入诱导表达阶段。
诱导表达阶段暂停碳源补给，饥饿菌体30分钟后，再开始补给甲醇，并缓慢增加甲醇的量，待菌体适应后，维持DO值≥20％的水平基础上以最大速率补加诱导物甲醇，并保持此状态至发酵结束。
4.人激肽释放酶的活性测定方法 4.1.测定的原理 hK1能特异性水解发色底物S-2266(Val-Leu-Arg-pNA，Chromogenix)分子中-Arg-pNA之间的化学键释放出pNA，游离的pNA分子的特征性吸收峰是405nm，单位时间内释放的游离的pNA量(A405值)同酶的活性成正比，所以，根据A405值就可以计算hK1的活性。
4.2.测定所用试剂和溶液 进行该项测定所用的试剂有发色底物S-2266溶液(2mM)，稀释缓冲溶液(20mMTris-Cl，pH8.0)，反应缓冲液(0.2M Tris-Cl，pH8.0)及反应终止液(50％醋酸溶液)。
4.3.活性测定的过程 根据估计的待测样品浓度，用20mM Tris-Cl，pH8.0缓冲液将待测样品稀释成一系列倍数，如100、200、300等。在洁净的2ml西林瓶中加入400ul 0.2M pH8.0 Tris-Cl缓冲液，再加入20μl稀释后的待测定样品溶液，对照样则加入20μl稀释缓冲溶液，混匀后，37℃水浴保温5分钟使各测定管中溶液温度一致，再分别各加入40μl发色底物S-2266，混匀，精确计时，并于37℃水浴反应15分钟。然后，各反应样品中加入40μl 50％乙酸溶液终止反应，分用对照将分光光度计调零，在405nm波长处测定吸收值A405值，A405值应在0.1～0.2之间，不在此范围时则增加或减少稀释倍数重新进行。
4.4.测定结果的计算 游离型pNA的A405摩尔消光系数为9,600 L mol-1 cm-1，根据bK1活性单位的含义1PNAU是指在37℃，Tris-Cl，pH8.0缓冲体系中，1分钟内能水解底物S-2266释放1μmol游离pNA的酶量为一个hK1活性单位(PNAU)。按照朗伯-比尔(Beer-Lambert)定律，则每毫升待测样品中hK1活性单位可按下述公式计算 PNAU/ml＝0.1736*A405*稀释倍数 用S-2266发色底物测定hK1活性是整个研究工作的基础，采用本方法可以快速、准确地对待测定样本(发酵液、原液、纯化中间样品等)中hK1活性进行准确定量。如果r-hK1的准确比活性为5.2PNAU/mg，那么要采用此法测定时，应该将待测定r-hK1样品的蛋白浓度稀释在3.2～6.5μg/ml(相当于0.017～0.034PNAU/ml)范围内，这样就可以减少稀释样品的工作量，便于快速获得结果。
图1.试管中对24孔板上初筛的6个高抗Zeocin克隆进行诱导表达 泳道0.是诱导表达前的发酵上清；泳道1～6.高抗Zeocin抗性(500μg/ml)的克隆诱导48小时的结果。可见，还原(R)和非还原(NR)的SDS-PAGE时，r-hK1的迁移率有差别，且有两条靠近的带。MLMW Marker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
图2.30L发酵诱导阶段产生r-hK1的SDS-PAGE还原电泳 整个诱导阶段每间隔8小时取样，每个泳道下面的数字表示甲醇诱导的小时数。MLMWMarker Kit(Amersham Pharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
图3.Phenyl-Sepharose FF层析(A)和Superdex75分子筛层析(B)纯化 A用20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0缓冲液平衡Phenyl-Sepharose FF层析介质。1.将200mM PB，pH6.0和3M(NH4)2SO4母液加至hK1发酵液中，使其在发酵液终浓度为20mMPB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，再用0.45μm膜过滤即成上样液；2.流出液；3.20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0时洗脱峰；4.20mM PB，0.35M(NH4)2SO4，pH6.0时洗脱峰，其中分子量偏大的和稍低的hK1各占50％左右；5.20mM PB，pH6.0洗脱峰。
BSuperdex75分子筛层析的平衡和洗脱缓冲液均为20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5，对0.5V柱体积时出现的洗脱峰进行分段收集，共分成①、②、③、④、⑤和⑥六段，其中①段分子量最大，量少，质谱r-hK1-B测定的实际分子量为32871.16Dalton，④段是hK1主峰部分，量最大，质谱r-hK1-A测定其实际分子量是28975.79Dalton。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
图4.凝胶过滤层析纯化出不同糖基化程度r-hK1的质谱 r-hK1-A是电泳分子量偏低的r-hK1，在整个分泌表达的蛋白中比例最高，r-hK1-B是SDS-PAGE电泳时分子量偏高的部分，所占比例较低。MLMW Marker Kit(AmershamPharmacia Biotech)97.0kDa、66.0kDa、45.0kDa、30.0kDa、20.1kDa、14.4kDa。
图5.r-hK1的等电点测定结果 泳道M中A和C～L代表的各个pI标准蛋白分子是A.Amylglucosidase(3.50)；C.Trypsininhibitor(4.55)；D.b-Lactoglobulin a(5.20)；E.Bovine carbonic anhydrase b(5.85)；F.Humancarbonic anhydrase b(6.55)；G.Myoglobin，acidic band(6.85)；H.Myoglobin，basic band(7.35)；I.Lentil lectin，acidic(8.15)；J.Lentil lectin，middle(8.45)；K.Lentil lectin，basic(8.65)；L.Trypsinogen(9.30)。泳道r-hK1-A是糖基化程度低的蛋白分子；泳道r-hK1-B是糖基化程度高的蛋白分子。r-hK1-A和r-hK1-B对应的质谱如图4。
图6.PNGaseF去除r-hK1的N-糖基化修饰后的SDS-PAGE和质谱 Ar-hK1是未进行脱糖处理时，De-r-hK1是PNGaseF处理后的r-hK1。可以看出分子量明显变小了。B将De-r-hK1进行质谱测定，确定其MW为26404.35Dalton，同按r-hK1理论氨基酸序列计算出的MW非常吻合。
具体实施例方式 实施例1 hK1工程菌株的构造 1.hK1基因的获得和表达载体pPICZa-hK1构建 参考GeneBank中公布的有关hK1基因全序列资料，设计并合成(上海生工)能扩增成熟hK1基因的两条引物Kal5(5`-引物，SEQ-3)Kal3(3`-引物，SEQ-4) Kal5(AA07624) 5`-catctc gag aaa aga att gtg gga ggc tgg gag tgt gag-3` Kal3(AA07625) 5`-cat gcg gcc gct tag gag ttc tcc gct atg gtg tcc tc-3` 以Panomics公司的人肾cDNA文库(P/N7202，L/NP0260602)为模板，经过PCR就获得hK1基因。引物Kal5将在hK1基因5`-端添加DNA限制性内切酶XhoI位点(CTCGAG)，和Kex2蛋白酶的识别序列Lys-Arg对应的密码子AAA AGA，这将保证插入的hK1基因分泌表达时能顺利切除α-信号肽，获得具有天然N-端序列的hK1蛋白分子；引物Kal3在3`-端加终止密码子TAA和DNA限制性内切酶NotI位点(GCGGCCGC)。
用DNA聚合酶(Pyrobest)进行PCR扩增，体系如下 Human kidney cDNA------------------1μl Kal5(5`-引物)---------------------2μl Kal3(3`-引物)---------------------2μl dNTP Mix -------------------------1μl 10x Pyrobest Buffer----------------------2μl Pyrobest------------------------------0.25μl ddH2O --------------------------------1175μl总20μl PCR条件94℃变性3分钟，再按94℃、30秒/55℃、30秒/72℃、1分种的方式循环30次。PCR结束后，取2μl扩增产物在1.5％琼脂糖电泳，能获得长度为约为750bp片段就表明PCR成功。
将PCR产物用柱回收试剂盒(Sangon)纯化，用限制性内切酶XhoI和NotI双切经过柱回收的PCR产物，经过胶回收hK1基因。将pPICZ α A载体(Invitrogen)用XhoI和NotI双切，回收载体的大片段作为插入目的基因的载体，将回收的hK1基因片段同与pPICZ α载体建立如下连接反应 pPICZ α载体(XhoI-NotI)-----------------2μl hK1基因(XhoI-NotI)------------------4μl 10×Ligation Buffer------------------------1μl T4 DNA Ligase(连接酶)-------------0.5μl ddH2O---------------------------2.5 总10μl 22℃条件下连接反应进行约1小时，取上述连接产物5μl与CaCl2法制备的TOP10F′感受态100μl小心混匀，4℃，30分钟，42℃，热休克90秒种，冰上放3～5分钟，然后加入500μlLB培养液，于37℃ 200转/分钟培养45分钟，取100μl菌液涂布于含LZ(LB+Zeocin25μg/ml)+1.5％琼脂糖的平板上，37℃过夜培养，将长出转化成功的阳性克隆。从中随机挑取6个单菌落接种于5ml LZ培养液中，37℃摇床培养过夜，用质粒DNA抽提试剂盒(BioAsia公司)抽提质粒，用XhoI和NotI双切筛选，取能酶切出约750bp片段的克隆测序确证序列。测序结果如SEQ-1，其对应的氨基酸序列如SEQ-2。这同GenBank中已经公布的序列没有区别。
2.工程菌株获得 按照Invitrogen公司P.methanolica Expression Kit中方法制备X-33感受态细胞，质粒表达载体用SacI酶切进行线性化，酚-氯仿抽提除去蛋白，乙醇沉淀用去离子水溶解后的线性化载体与X33感受态细胞混匀，电转化，涂布于含Zeocin 500ug/ml的YPD(1％酵母提取物，2％多聚蛋白胨， 2％葡萄糖)平板上，30℃培养2～3天，直到有酵母单菌落生长出现。根据Easyselect Pichia Expression Kit中的描述，首先通过提高Zeocin抗生素的抗性来筛选重组子，挑取100个重组子接种于400μl YPD(含Zeocin 600μg/ml)培养液的24孔板中，30℃摇床培养过夜，将筛出的高抗Zeocin孔留种(6个符合要求的克隆)共筛选出并转接到试管中补加2ml YPD培养液继续增殖，24小时后离心收集菌体，用含甲醇0.5％的BMMY培养基30℃诱导表达，24小时添加甲醇使其在菌液中的终浓度为0.5％，维持这种诱导状态48小时，离心收集菌液上清，经SDS-PAGE电泳检测诱导前后对比，发现诱导后的发酵上清中有30kDa蛋白条带表达出来。由于电泳观察蛋白带型变化很难进行准确判断表达产量，所以同时也采用前面发明内容4.中描述的方法，以诱导前上清作空白对照，用发色底物S-2266来准确测定诱导后发酵上清中r-hK1活性单位产量。最后确定其中一株高表达的hK1工程菌株(图1)作为发酵用，并建立三级种子库。
实施例2 r-hK1工程菌的发酵 1.种子液准备 取工作种子甘油冻存管，融化后取1ml接种至500ml YPD培养基(1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中，在30℃，300rpm的摇床中培养30小时至OD600值在6.0±1.0，镜检正常就得到种子液上罐接种用。配制发酵用基础盐培养基BSM1(K2SO4 60.7克，MgSO424.2克，CaSO4·2H2O 3.9克，H3PO4 89毫升，KOH 13.8克，PTM1 14毫升，甘油400克，泡敌2毫升，以10L为例，以配制1升的微量元素培养基PTM1为例，其中各组份的含量是CuSO4·5H2O 6.0克，NaI 0.008克，MnSO4 3.0克，NaMoO4 0.2克，H3BO3 0.02克，ZnSO4 20.0克，CoCl2 0.5克，FeSO4·7H2O 65.0克，生物素0.2克，H2SO4 5毫升，加水定容为1升)后进行实罐灭菌。灭菌条件为121℃，20分钟，消后冷至30℃。按1∶15(V/V，种子液基础罐基培养液BSM1)比例接种。
2.发酵过程 初期菌体增殖阶段的发酵温度为30.0±0.5℃，pH5.00±0.05，起始转速300rpm培养，通气量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1。此阶段大约20小时左右，维持DO值不低于30％，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升，菌体湿重达到约100g/L，此时进入限速生长阶段，此阶段的开始2小时期间，以240ml/小时的速率补加浓度为50％的甘油溶液。补料2小时后，补料速率上调为360ml/小时。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(＜0.8bar)使DO值维持在不低于20％的水平。补加约4小时，菌体湿重约160～180g/L时，停止补料，DO值上升。DO值上升表明培养基中碳源耗尽，应该可以碳源兼诱导物甲醇进行补料，这就进入发酵的关键性阶段诱导表达阶段用氨水将pH值控制在6.20±0.05，开始补加甲醇。甲醇的起始加入量控制在30ml/小时，缓慢增加甲醇的加入量，约2小时后将补料速度设定为60ml/小时。诱导4小时后将甲醇补料速度设定为120ml/小时，此时甲醇诱导成功，菌体可以正常高速度利用甲醇作为碳源。维持DO值不低于20％，温度30℃，pH值为6.20±0.05，进行发酵表达，在整个发酵期间，每8小时取一次样，测定活性(表1)并SDS-PAGE电泳(图2)。诱导60小时时结束发酵过程，离心收集上清，SDS-PAGE电泳和S-2266发色底物法检测表达产量。
整个发酵诱导阶段中，以1毫升发酵液为测定标准，测定进入甲醇诱导阶段时，发酵液中菌体湿重增加、发酵上清减少，表达产物r-hK1蛋白的显著增加情况。可见，并不是诱导时间越长越好，因为发酵过程中取样会减少发酵液总体积，菌体大量增加会使上清大大减少以及诱导时间长久会使杂蛋白大幅度增加，r-hK1降解增加，权衡这些因素后将发酵的诱导时间定为50～60小时。
表1.发酵诱导阶段菌体湿重、上清体积和表达产量比较 实施例3 r-hK1蛋白的纯化 纯化过程由疏水、阴离子交换和凝胶过滤层析三步组成，其中疏水层析选择Phenyl-Sepharose FF，阴离子交换介质是Q-Sepharose FF，凝胶过滤层析采用Superdex75。
具体过程如下 1.发酵液的预处理 向发酵上清液中加入0.2M PB，pH6.0和3.0M(NH4)2SO4溶液至其在发酵液中的终浓度分别为20mM和1.0M，调节pH值至6.0，静置1小时后0.45微米滤膜过滤即成含有20mMPB，1.0M(H4)2SO4，pH6.0的处理后发酵液(上样液)，就可以进行层析过程。
2.Phenyl-Sepharose FF疏水层析 将上述处理后的发酵液上Phenyl Sepharose FF层析柱，柱型为Index70/500，柱床体积为500ml，平衡缓冲液为20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，洗脱缓冲液为20mM PB，0.7M(NH4)2SO4，pH6.0、20mM PB，0.4M(NH4)2SO4，pH6.0和20mM PB，pH6.0，收集各个洗脱峰。其中目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，pH6.0洗脱峰中(图3A)。
3.Q-Sepharose FF阴离子交换层析 将疏水层析洗脱主峰收集液用1.0M NaOH向上调节pH至7.5，稀释电导≤8.0mS/cm，上Q-Sepharose FF阴离子交换层析柱，柱规格为5×10cm，柱床体积为200ml，平衡缓冲液20mM PB，pH7.5，洗脱缓冲液为20mM PB，0.2M NaCl，pH7.5和20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5，收集各个洗脱峰。目的蛋白r-hK1主要在20mM PB，0.5M NaCl，pH7.5的洗脱峰中。
4.Superdex 75凝胶过滤层析 平衡及洗脱采用的是20mM PB，0.15M NaCl，pH7.5缓冲液，将阴离子交换层析洗脱液分批上Superdex 75，柱规格为6.0×60cm预装柱，柱床体积为1700ml，每次上样量为不超过柱床体积的5％(约85ml)，分段收集主峰，SDS-PAGE电泳确定纯度后合并符合要求的部分，过滤除菌，即为r-hK1原液(图3B)。
实施例4 r-hK1性质确证 1.r-hK1比活性测定 对纯化出的r-hK1进行蛋白纯度(SDS-PAGE电泳、RP-HPLC)测定，将纯度不低于98％的r-hK1用Lorry法准确测定浓度，按照发明内容4.中hK1的活性测定方法中描述，用S-2266发色底物测定活性单位(PNAU)数。用活性单位(PNAU)/蛋白浓度(mg)，就可以得出r-hK1的比活性，实际结果约为5.2PNAU/mg。
2.r-hK1蛋白的质谱和N-端和C-端序列测定 将凝胶过滤层析分段收集纯化出的r-hK1蛋白取分子量偏低的和分子量偏高作为两组，委托中国科学院上海生命科学研究院生化与细胞研究所蛋白质组学研究中心按照标准方法进行蛋白N-端序列分析，结果表明两者虽然在分子量上有差别，但是用S-2266发色底物法测定其体外活性时并没有发现明显差别，它们多肽链的N-端序列完全一致，N-端前15个氨基酸残基均为I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-。利用羧肽酶水解法测定这两组r-hK1的羧端三个氨基酸残基是-E-N-S。这表明我们利用甲醇酵母系统分泌表达r-hK1时并没有以前的研究者所描述的N-端不均一现象，电泳显示的分子不均一是糖基化修饰程度不同所致，但是通过纯化可以分开糖基化程度不同的r-hK1蛋白分子。
3.r-hK1蛋白的等电点测定 采用等电聚焦法测定r-hK1蛋白的等电点，所用pI标准蛋白是GE Healthcare LifeScience公司的Broad pI Kit pH3～10，高糖基化和低糖基化修饰的r-hK1蛋白的pI也没有明显区别，都在pI标准蛋白的3.5～4.5位置中间区域对应处(图5)，这表明甲醇酵母表达的r-hK1的pI约为4.0。
4.r-hK1蛋白的去糖基化试验 按理论推测，hK1蛋白的氨基酸序列中有三个可能的N-型糖基化修饰位点，是否这些位点在酵母分泌表达r-hK1蛋白时都发生了糖基化修饰了呢？根据hK1蛋白的氨基酸序列计算不发生修饰的hK1多肽链的分子量应该是26405.74Dalton，而实际纯化出的r-hK1蛋白的分子量并不均一，从SDS-PAGE电泳可以看出(图1、图2、图3)，但是更准确的是用质谱测定纯化的r-hK1蛋白的分子量，根据图4从28975.79Dalton到31871.16Dalton，那么甲醇酵母分泌表达的r-hK1蛋白在分子量上净增加的2570.05～5465.42Dalton就应该是甲醇酵母分泌表达时对蛋白进行翻译后修饰时添加上去修饰成分的分子量，也就是说修饰增加的N-糖链部分占蛋白分子的8.86～17.15％。
用PNGase F蛋白酶(New England BioLabs)按使用手册中的标准操作处理r-hK1，SDS-PAGE电泳可以看出除去N-糖链后r-hK1分子变小了(图6A)，将除去N-型糖链的r-hK1(De-r-hK1)进行质谱测定(图6B)，此时的分子量为26404.35Dalton，同理论计算出的26405.74Dalton非常接近，这表明甲醇酵母表达出的r-hK1蛋白中并无其他的修饰方式，只有酵母的N-型糖基化修饰。
实施例5 r-hK1对大鼠局灶性脑缺血的影响 本试验委托中国人民解放军第二军医大学药理学教研究室进行，初步结果如下 1.实验材料 1.1药品 受试药批号为20060218的r-hK1原液，纯度之98％，蛋白浓度4.8mg/ml、活性浓度25PNAU/ml。临用前用生理盐水稀释至所需浓度。阳性对照药尼莫地平注射液(山东新华制药股份有限公司，产品批号0411022)，每50ml注射液中含尼莫地平10mg。溶剂对照0.9％氯化钠注射液(上海百特医疗用品有限公司，产品批号A6B11307)。
1.2试剂 红四氮唑(TTC)(上海生工生物工程有限公司，批号2803B19)，临用前用PBS缓冲液配成浓度为2％，避光备用。
1.3实验动物 雄性SD大鼠，体重从280克至350克，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.4仪器 图像分析系统(Germany，Leica Microsystems，Type DM LB2)。
2.实验方法 2.1局部脑缺血模型制备 取雄性大鼠，腹腔注射15％水合氯醛(300mg/kg)麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，小心分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)和枕动脉，在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在20mm时，紧紧系牢CCA远心端的细线，逐层缝合切口。
2.2颈静脉插管给药 分离颈外静脉，穿线两道备用。远心端结扎，近心端动脉夹夹闭。斜行剪一切口，将充满药液或生理盐水的静脉管45度角插入。近心端结扎导管，除去动脉夹。稍稍回抽检查是否成功，于脑梗模型造成后30min按0.1ml/100g体重给药。另穿一线于导管下方，将导管末端静脉结扎，拔出导管，逐层缝合。回笼饲养。室温严格控制在24～25℃。24h后断头去脑，测定梗死区面积及梗死区重量。
2.3实验分组及给药剂量 实验分三组(模型组，阳性对照组，受试药组)，每组约15只雄性SD大鼠。模型组造模并给予等体积的生理盐水0.1ml/100g。阳性药对照组给予尼莫地平注射液0.5mg/kg。受试药组给予r-hK1 30×10-3 PNAU/kg，0.1ml/100g。
2.4观察指标 术后24h，先观察并记录动物的死亡情况，然后将动物断头取脑，把剥离完整的大脑放入-20℃冰 表2.24小时内各组动物死亡计数 表3.尼莫地产组脑梗死百分比 n。
表2.24小时内各组动物死亡计数 表3.尼莫地平组脑梗死百分比 如表2所示，尼莫地平组和r-hK1组24小时内大鼠死亡率显著低于模型组，提示r-hK1和尼莫地平均可降低急性脑梗动物的死亡。
表4.模型组脑梗死百分比 表5.r-hK1组脑梗死百分比 与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
如表6总结所示，与模型组比较，阳性对照药尼莫地平能显著地缩小脑梗死区面积和脑梗死区重量(P＜0.05)。受试药r-hK1与模型组比较，能非常显著地缩小脑梗死区面积和脑梗死区重量(P＜0.01)。实验结果提示与尼莫地平类似，r-hK1对急性缺血性脑梗死具有治疗作用。
DNA和蛋白质的序列描述
SEQ-1序列的资料
(1).序列特征
a.长度714bp
b.类型核苷酸
c.拓扑学线性
(2).分子类型人胎肾cDNA
(3).序列描述SEQ-1
1 ATTGTGGGAG GCTGGGAGTG TGAGCAGCAT TCCCAGCCCT GGCAGGCGGC
51 TCTGTACCAT TTCAGCACTT TCCAGTGTGG GGGCATCCTG GTGCACCGCC
101 AGTGGGTGCT CACAGCTGCT CATTGCATCA GCGACAATTA CCAGCTCTGG
151 CTGGGTCGCC ACAACTTGTT TGACGACGAA AACACAGCCC AGTTTGTTCA
201 TGTCAGTGAG AGCTTCCCAC ACCCTGGCTT CAACATGAGC CTCCTGGAGA
251 ACCACACCCG CCAAGCAGAC GAGGACTACA GCCACGACCT CATGCTGCTC
301 CGCCTGACAG AGCCTGCTGA TACCATCACA GACGCTGTGA AGGTCGTGGA
351 GTTGCCCACC CAGGAACCCG AAGTGGGGAG CACCTGTTTG GCTTCCGGCT
401 GGGGCAGCAT CGAACCAGAG AATTTCTCAT TTCCAGATGA TCTCCAGTGT
451 GTGGACCTCA AAATCCTGCC TAATGATGAG TGCAAAAAAG CCCACGTCCA
501 GAAGGTGACA GACTTCATGC TGTGTGTCGG ACACCTGGAA GGTGGCAAAG
551 ACACCTGTGT GGGTGATTCA GGGGGCCCGC TGATGTGTGA TGGTGTGCTC
601 CAAGGTGTCA CATCATGGGG CTACGTCCCT TGTGGCACCC CCAATAAGCC
651 TTCTGTCGCC GTCAGAGTGC TGTCTTATGT GAAGTGGATC GAGGACACCA
701 TAGCGGAGAA CTCC
SEQ-2序列的资料
(1).序列特征
a.长度238氨基酸
b.类型氨基酸
c.拓扑学未知
(2).分子类型蛋白质
(3).序列描述SEQ-2
1 IVGGWECEQH SQPWQAALYH FSTFQCGGIL VHRQWVLTAA HCISDNYQLW
51 LGRHNLFDDE NTAQFVHVSE SFPHPGFNMS LLENHTRQAD EDYSHDLMLL
101 RLTEPADTIT DAVKVVELPT QEPEVGSTCL ASGWGSIEPE NFSFPDDLQC
151 VDLKILPNDE CKKAHVQKVT DFMLCVGHLE GGKDTCVGDS GGPLMCDGVL
201 QGVTSWGYVP CGTPNKPSVA VRVLSYVKWI EDTIAENS
SEQ-3序列的资料
(1).序列特征
a.长度39nt
b.类型核苷酸
c.拓扑学线性
(2).分子类型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-3
1 CATCTCGAGA AAAGAATTGT GGGAGGCTGG GAGTGTGAG 39
SEQ-4序列的资料
(1).序列特征
a.长度38nt
b.类型核苷酸
c.拓扑学线性
(2).分子类型人工合成序列
(3).序列描述SEQ-4
1 CATGCGGCCG CTTAGGAGTT CTCCGCTATG GTGTCCTC38
权利要求
1.一种由甲醇酵母(Pichiapastoris)系统高效分泌表达，并经过发酵、纯化过程制备且含有糖基化修饰的重组人激肽释放酶-1(r-hK1)。
2.根据权利要求1中的高效分泌表达，是指上罐发酵时所获得的发酵上清中r-hK1的蛋白产量可达到1.2g/L。
3.根据权利要求1所制备的r-hK1的分子量范围是28～32kDa，整个分子是一条含有238氨基酸残基的多肽链，其N-端前15个氨基酸残基为I-V-G-G-W-E-C-E-Q-H-S-Q-P-W-Q-，C-末端3个氨基酸残基为-E-N-S，分子内全部为甲醇酵母的N-型糖链修饰，其中糖类占整个糖蛋白的8.86～17.16％，蛋白的等电点(pI)约为4.0。r-hK1的基因及氨基酸序列分别为SEQ-1和SEQ-2。
4.根据权利要求1中所制备的r-hK1，采用S-2266发色底物法确定的比活性为5.2 PNAU/mg。
5.根据权利要求1中所指的发酵是采用全盐培养基，甲醇诱导表达r-hK1时的pH6.2，温度为30℃，诱导时间50小时。
6.根据权利要求1中所指的纯化是由疏水层析(Phenyl-SepharoseFF)捕获、阴离子交换层析(Q-SepharoseFF)除去杂蛋白并浓缩目的蛋白r-hK1，以及凝胶过滤层析(Superdex-75)分段收集获得高纯度r-hK1这三步层析纯化过程组成。其中Phenyl-Sepharose FF疏水层析的最适上样条件是20mM PB，1.0M(NH4)2SO4，pH6.0，最适洗脱条件是20mM PB，pH6.0，Q-Sepharose FF阴离子交换层析的上样电导率不高于8.0mS/cm。
7.根据权利要求1中所制备的r-hK1可以显著降低大鼠脑梗塞动物模型的死亡率。
全文摘要
本发明是采用基因工程的方法，在甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统中生产重组人激肽释放酶－1(Recombinant Human Kallikrein－1，r－hK1)，对r－hK1的发酵和层析纯化过程，特别是对其分子量、等电点、糖含量以及糖修饰类型等有关分子结构特征进行了描述。通过对r－hK1体外、体内活性的测定和试验，表明r－hK1可望成为治疗和预防脑梗塞的药物。
文档编号C12N9/00GK101092598SQ20061002775
公开日2007年12月26日 申请日期2006年6月19日 优先权日2006年6月19日
发明者黄秀东, 陈佩新, 王俊, 陈耀国, 袁靖宇, 王书生, 潘学工, 曹之舫 申请人:上海万兴生物制药有限公司