专利名称：一种刺激隐核虫的标准化传代增殖方法及其专用收集器的制作方法
技术领域：
本发明涉及水生动物领域，具体涉及一种刺激隐核虫的标准化传代增殖方法及其专用收集器。
背景技术：
刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans Brown 1951)是一种寄生在热带、亚热带海水鱼类体上的纤毛虫，引起海水鱼类的“白点病”。近年来，刺激隐核虫病在世界各地频繁爆发，危害日益严重，但是到目前为止，还没有找到有效的方法来彻底防治该寄生虫病。在刺激隐核虫的研究中要随时获得足够的材料是很困难的，因为自然条件下刺激隐核虫病的爆发是受季节严格限制，疾病爆发的不确定性导致材料的获得没有保障；并且该虫属于鱼类专性寄生虫，生活史必需要宿主鱼的参与，不能进行体外培养，因此很多研究者曾试图在实验室内建立一套该寄生虫的传代体系。Colorni 1985年首次在实验室内以金鲷(Sparus aurata)为宿主进行了该虫的传播，但感染没有定量，产率也不清楚；Burgess等1994年用灰鲻(Chelon labrosus)作为宿主，在实验室内成功地建立起了该虫7个株系的传代体系，但是每个虫株的传播都没能超过24轮循环，寄生虫产率也很低，最大只有11.7倍，幼虫的低水平感染率是造成低生产率的主要原因；Yoshinaga等1994年用黑鳉(Poecilia latipinna)作为宿主成功地进行了该虫的传播，但寄生虫繁殖力弱，每条鱼只能收到50～100滋养体。同时，这些作者没有对虫体的收集、感染、繁殖进行标准化。这些缺陷都限制了寄生虫的最终产量，使获得的寄生虫数量太少，对研究工作造成了很大制约。
发明内容
本发明的目的在于克服现有刺激隐核虫研究中存在材料不足的问题，提供一种刺激隐核虫传代增殖的标准化方法，以便随时获得足够的刺激隐核虫材料进行研究。
本发明的另一个目的是提供用于上述刺激隐核虫传代增殖方法的专用收集器。
为了实现上述目的，本发明的刺激隐核虫的标准化传代增殖方法所用的宿主鱼采用卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)。在水温27±0.5℃、盐度29～32‰条件下，在晚上22:00～24:00之间，用脱包2小时内的幼虫按每条鱼8000～15000幼虫的剂量在黑暗中感染鱼体3小时，60小时后鱼皮肤和鳃上出现明显可见的滋养体，在接下来的24小时内几乎所有的滋养体都从鱼体上脱落形成包囊前体，用专用收集器收集脱落的包囊前体，培养60小时后，包囊开始释放出幼虫，幼虫孵化在24小时后达到高峰，此时收集幼虫。完成一轮上述循环刚好1周，一轮循环可以收到约1000万个幼虫(每一轮循环所感染的宿主鱼为10尾)，产率最高达到122倍。
可以将上述收集到的幼虫进行下一轮循环，每一组鱼可以连续感染4次，第1次感染剂量为8000幼虫.鱼-1，第2次感染剂量为10000幼虫.鱼-1，第3次感染剂量为12,000幼虫.鱼-1，第4次感染剂量为15000幼虫.鱼-1。由于第4次感染后的寄生虫产率显著下降，因此下一次感染换一组新鲜的鱼。
上述专用收集器，包括桶、漏斗、烧杯，漏斗置于桶内部，漏斗底部固定烧杯。桶内还设有进水管、出水管和产气装置。进水管和出水管可保持有微流水，产气装置可保持充气，有利于鱼的生存。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果首先，由于选用了卵形鲳鲹作为刺激隐核虫的优秀宿主，寄生虫的产率最高可达122倍，最低也能达到60.7倍，因此寄生虫的总产量很高，每个循环都能从10尾宿主鱼体上收到约1,000万个幼虫。其次，该系统循环周期短，在27±0.5℃下，每轮循环刚好花一周时间。再次，材料收集方法简单，死幼虫可以用福尔马林杀死后通过离心收集，活幼虫可以用滤膜过滤收集，特别是大量包囊前体，可以用专用收集器很方便地收集到。
图1卵形鲳鲹被刺激隐核虫的幼虫感染60小时后，体表出现了明显的白色滋养体(照片)；图2卵形鲳鲹被刺激隐核虫的幼虫感染60小时后，鱼鳃上出现了明显的白色滋养体(照片)；图3包囊前体的专用收集器示意图；图4使用专用收集器收集到的大量包囊，紧紧贴在烧杯底部(照片)。
其中，图3中，1桶，2漏斗，3烧杯，4进水管，5出水管，6产气装置。
具体实施例方式
1、传代用鱼传代中使用的宿主鱼为卵形鲳鲹(Trachinotusovaua)，均重167.8±15.1g。
2、海水的处理海水采用天然海水，盐度29～32‰，溶氧＝5.0mg/L，pH7.9～8.3，亚硝酸盐＜0.1mg N/L。培育寄生虫的海水先过滤，再于120℃中灭菌30min，为防止细菌感染，使用前加入100IU.ml-1的青霉素和100μl.ml-1的链霉素。
3、传代温度和盐度的标准化传代水温27±0.5℃，海水盐度29～32‰。
4、感染时间和感染剂量的标准化用脱包2小时内的刺激隐核虫幼虫感染卵形鲳鲹，感染在晚上22:00～4:00期间进行，感染时水量控制在5L.鱼-1，鱼在黑暗中感染3小时后放回大水体养殖。如图1、2所示，被刺激隐核虫幼虫感染的卵形鲳鲹体表和鱼鳃在感染60小时后出现了明显的白色滋养体。
5、专用收集器的制作和包囊前体的收集方法幼虫感染鱼60小时后发育为成熟的滋养体，然后脱离鱼体成为包囊前体，我们用专用收集器来收集脱落的包囊前体。如图3所示，在160L的塑料桶1里放置一个由光滑的塑料片作成的合适的漏斗2，漏斗2底部固定一个2L的烧杯3，桶1中设有进水管3、出水管4和能产生气体的气石5。待鱼鳃和体表上出现明显的白色滋养体后(见图1、2)，往160L的塑料桶1和漏斗2里加满海水，再把鱼放入漏斗中，保持充气和微流水。为防止寄生虫逃逸，水面要低于漏斗2的上缘，脱落的包囊前体沉落到烧杯3底部，粘附在烧杯3底部形成包囊，清洗掉杂质后就可以在烧杯3里孵化了。因为寄生虫多，所以孵化时要充气，并且每天8:00换一次灭菌海水。
6、幼虫的收集方法将专用收集器收到的包囊前体经过2天的培育后开始孵化出幼虫，1天后幼虫的脱包达到高峰，此时收集虫液，混匀后吸取5份(每份50μl)，加10μl福尔马林杀死幼虫，在显微镜下计数，记算出幼虫的浓度。这些幼虫可以用来进行下一轮传代，多余的幼虫可以收集起来用于其它实验，如果要收集死幼虫，则用100μ1.L-1的福尔马林把幼虫杀死，用离心机(KUBOTA 5100)3500rpm离心10min，收集在1.5ml离心管里，-80℃保存。如果要收集活幼虫，则直接用孔径为0.45μl的滤膜过滤虫液，幼虫浓度可达200,000幼虫.ml-1。
权利要求
1.一种刺激隐核虫的传代增殖方法，包括将刺激隐核虫幼虫感染宿主鱼，收集包囊前体，孵化幼虫，其特征在于所用宿主鱼为卵形鲳鲹。
2.如权利要求1所述的刺激隐核虫的传代增殖方法，其特征在于所述刺激隐核虫幼虫感染宿主鱼的水温是26.5～27.5℃。
3.如权利要求2所述的刺激隐核虫的传代增殖方法，其特征在于所述刺激隐核虫幼虫感染宿主鱼的海水盐度为29～32‰。
4.如权利要求3所述的刺激隐核虫的传代增殖方法，其特征在于在水温26.5～27.5℃、海水盐度29～32‰条件下，在晚上22∶00～24∶00之间，用脱包2小时内的幼虫按每条鱼8000～15000个幼虫的剂量在黑暗中感染鱼体，待鱼鳃和体表上出现明显可见的滋养体时，用专用收集器收集从鱼体上脱落形成的包囊前体，孵化包囊前体，收集包囊前体释放出的幼虫。
5.如权利要求4所述的刺激隐核虫的传代增殖方法，其特征在于可将收集到的幼虫重新感染卵形鲳鲹，进行下一次传代增殖。
6.权利要求4所述的专用收集器，其特征在于包括桶(1)、漏斗(2)、烧杯(3)，漏斗(2)置于桶(1)内部，漏斗(2)底部固定烧杯(3)。
7.如权利要求6所述的专用收集器，其特征在于桶(1)内还设有进水管(4)、出水管(5)和产气装置(6)。
全文摘要
本发明涉及水生动物领域，具体涉及一种刺激隐核虫的标准化传代增殖方法及其专用收集器。本发明的标准化传代增殖方法采用卵形鲳鲹作为宿主鱼，在水温27±0.5℃、盐度29～32‰条件下，在晚上22:00～24:00之间，用脱包2小时内的幼虫按每条鱼8000～15000幼虫的剂量在黑暗中感染鱼3小时，60小时后鱼皮肤和鳃上出现明显可见的滋养体，在接下米的24小时内几乎所有的滋养体都从鱼体上脱落形成包囊前体，用专用收集器收集脱落的包囊前体，培养60小时后，包囊开始释放出幼虫，幼虫孵化在24小时后达到高峰，此时收集幼虫。采用该传代增殖方法得到的寄生虫总产量高，所用时间少，收集方法简单。
文档编号C12M1/26GK1912099SQ20061003557
公开日2007年2月14日 申请日期2006年5月23日 优先权日2006年5月23日
发明者李安兴, 但学明 申请人:中山大学