专利名称：实现细胞融合的芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于一种实现细胞融合的芯片。
背景技术：
细胞融合(cellfusion)技术为遗传学、发生生物学、动植物远缘杂交育种、免疫医学以及医药、食品、农业等应用领域中都有广泛的应用价值。现代生物学中一些最具创新性的技术，如在单抗的生产、哺乳动物的克隆(比如著名的克隆羊多莉)以及抗癌疫苗的生产中，细胞融合是其中最为基本的步骤。
尽管细胞融合技术已经取得了长足进展，得到了世人的瞩目，但仍然存在着诸多问题，从而大大制约了细胞融合技术的广泛应用和进一步发展。目前国内许多实验室中一般使用PEG(聚乙二醇)法进行细胞融合，利用PEG法进行细胞融合的成本很低，但该融合技术存在不少无法克服的问题；一是诱导过程可控性差、重复性差、不同类型细胞的特异性融合率不高等缺点；二是诱导剂会对细胞有较大的化学毒害作用。当前国内也有少数实验室在使用电诱导细胞融合的技术，细胞电融合(cell electrofusion)技术为美国科学家Zimmermann所发现，而且他在上个世纪八十和九十年代对细胞电融合技术进行了系统的研究，开创了细胞融合技术的新局面，使细胞融合技术成为了生物工程的基本核心技术。但它也有一些不足，由于电极处于导电溶液中，要在电极间建立起足够的电场强度，就要求输出电压至少为几百伏，甚至数千伏，就要求电源有极高的输出功率。这样就造成了细胞电融合设备高昂的价格，而且存在电气安全的隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种对细胞没有化学毒害作用、适用于低电压的能实现细胞融合的芯片。
为实现以上目的，本发明提供这样一种能够实现细胞融合的芯片。该芯片包括从上到下重叠在一起的电极层和绝缘垫层。其中电极层有单个或多个交叉梳状电极组、与该交叉梳状电极组连接的引出导线以及位于该交叉梳状电极组之间及其四周的流路通道。其中的交叉梳状电极组由两个互不接触的其梳齿间相互交叉插入的梳状电极板构成，均为相互交叉插入的梳齿之间和梳齿尖与梳脊之间是该交叉梳状电极组与所述流路通道相通的工作段通道；在围出工作段通道的梳齿上排列有柱状的阵列电极。
进一步的特征是，方案中的柱型阵列电极均位于梳齿的同一侧。
更进一步的特征是，方案中芯片的电极层之上可以覆盖一层绝缘覆盖层；该绝缘覆盖层可以是透明的。
下面以SMMC-7721细胞和HepG2细胞的定向移动和融合为例，说明本发明的芯片的使用方法。
(1)将SMMC-7721(A配型)和HepG2(B配型)悬浮液注入芯片的电极层内。不施加外加电场，让细胞不规则地排列在芯片电极层的交叉梳状电极组内。细胞悬浮液注入芯片的方式有两种一种利用流路通道将细胞悬浮液引入芯片内；另一种是直接将细胞悬浮液滴定到芯片电极层的交叉梳状电极组上。
(2)在使用引入方式将细胞悬浮液注入芯片的时候，当目标区域中注满了细胞悬浮液，停止注入，并注意要将芯片内的气泡排出。当用后一种方式注入时，在滴定完成后，把透明的绝缘覆盖层(通常为玻璃)盖在电极层表面，并注意在芯片内不要有气泡产生。
(3)在芯片上施加驱动电压(低于100V)，在芯片内形成多个非均匀电场，细胞在非均匀电场中被极化，形成偶极子，细胞向高场强区移动。极化细胞在下相互接近时，由于偶极子相互作用，相互吸引，细胞排列成细胞对。进一步使得细胞成对吸附在阵列电极上。
(4)当细胞在芯片上稳定地排列成细胞对后，在芯片上再施加另一个驱动电压为使细胞膜上产生可逆性小孔，使粘附在一起的细胞对融合成一个细胞。
(5)实现了细胞的定向移动，并形成目标融合细胞。
从技术方案与其使用方法中，本领域的技术人员也可以看出，由于没有PEG之类的化学试剂，故本发明不会对细胞产生化学毒害作用；与现有的细胞电融合技术，需要至少几百伏，甚至数千伏的电压相比，本发明更能适合于在低电压条件下运用。由于其结构不复杂，所以制造成本也较低廉。由于是梳状电极板内、尤其是有阵列电极的作用，极大地提高了对细胞的处理速度。又由于芯片的开放式设计，可以在显微镜下直接观测到对细胞的操作和融合的细微过程。同时，本芯片可以根据需要，将其做出不同的电极间距，以适应不同的细胞。显然，芯片内的交叉梳状电极组数量可以根据要求和/或条件，进行选择。
图1有多个交叉梳状电极组的本发明的平面(示意)2图1中的一个交叉梳状电极组的轴侧(示意)3图2中的(仅绘制出几个梳齿的)局部放大的平面图具体实施方式
一种实现细胞融合的芯片(参考图1、2、3)。该芯片包括从上到下重叠在一起的电极层5和绝缘垫层4。其中，电极层5有单个或多个交叉梳状电极组1、与交叉梳状电极组1连接的引出导线2以及位于交叉梳状电极组1之间及其四周的流路通道3。其中的交叉梳状电极组1由两个互不接触的其梳齿61间相互交叉插入的梳状电极板6构成，均为相互交叉插入的梳齿61之间和梳齿61尖与梳脊之间是该交叉梳状电极组1与所述流路通道3相通的工作段通道10。在围出工作段通道10的梳齿61上排列有柱状的阵列电极8。本具体实施方式
中的这些结构均由精微加工技术或微机电(Micro Electro Mechanical System)加工技术加工而成(显然，交叉梳状电极组1的梳齿间距、柱状的阵列电极8与梳脊之间的间距、工作段通道10的深度及宽度等应根据实验要求和/或其他条件确定)。
显然，其中的绝缘垫层4起绝缘作用，用以保证电极层5中相应电极之间可以形成电场。绝缘垫层4可由聚合物、非金属、金属氧化物、非金属氧化物等具有绝缘特性的材料构成。电极层5可由金属、半导体、导电塑料等可以导电的材料构成。在绝缘垫层4下可以再加一层基片层以加固绝缘垫层4的强度、而作为芯片的基底。该基片层可以为硅、聚合物、非金属、金属氧化物、非金属氧化物、金属、半导体、导电塑料、玻璃等可对绝缘垫层起到辅助作用的材料构成，而且该基片层的材料将影响到绝缘垫层的制造工艺、材料等因素。同样显然的是，成对的两个梳状电极板6之间在电气条件上要保持彼此的阻断状态，所述的“交叉梳状电极组1连接的引出导线2”是分别与不同的梳状电极板6连接的。引出导线2的作用是将电信号引入交叉梳状电极组1、并可将交叉梳状电极组1所产生的信号导出到外部电路。在对交叉梳状电极组1施加电压的情形下，两个梳状电极板6间互不接触的空间区域内将形成电场，这部分区域为反应区——即工作段通道10。故，每一交叉梳状电极组1才是本芯片的实验工作区域。
进一步讲，为达到更好的实验效果和便于加工，方案中的柱型阵列电极8均布置在梳齿61的同一侧(参考图3)。
更进一步讲，为适应不同实验要求和/或其他条件的变化要求。方案中芯片的电极层5之上可以覆盖一层绝缘覆盖层；而且，该绝缘覆盖层还可以是透明的——也就是在有绝缘覆盖层的情况下，仍可以在显微镜下直接观测到对细胞的操作和融合的细微过程。
显然，工作段通道10的最窄处——即柱状阵列电极8中每一个电极的顶端到其所对梳齿61的距离，应当根据细胞的大小和实验的具体要求进行设计制造，一般在900微米和1微米之间，较好的是100微米和10微米之间。
权利要求
1.一种实现细胞融合的芯片，其特征在于该芯片包括从上到下重叠在一起的电极层(5)和绝缘垫层(4)；所述电极层(5)有单个或多个交叉梳状电极组(1)、与交叉梳状电极组(1)连接的引出导线(2)以及位于交叉梳状电极组(1)之间及其四周的流路通道(3)；所述交叉梳状电极组(1)由两个互不接触的其梳齿(61)间相互交叉插入的梳状电极板(6)构成，均为相互交叉插入的梳齿(61)之间和梳齿(61)尖与梳脊之间是该交叉梳状电极组(1)与所述流路通道(3)相通的工作段通道(10)；在围出工作段通道(10)的梳齿(61)上排列有柱型的阵列电极(8)。
2.按照权利要求1所述的实现细胞融合的芯片，其特征在于，所述柱型的阵列电极(8)均位于梳齿(61)的同一侧。
3.按照权利要求1或2所述的实现细胞融合的芯片，其特征在于，所述电极层(5)之上覆盖有一层绝缘覆盖层。
4.按照权利要求3所述的实现细胞融合的芯片，其特征在于，所述绝缘覆盖层是透明的。
全文摘要
一种能够实现细胞融合的芯片。该芯片包括从上到下重叠在一起的电极层和绝缘垫层。其中电极层有单个或多个交叉梳状电极组、与该交叉梳状电极组连接的引出导线以及位于该交叉梳状电极组之间及其四周的流路通道。其中的交叉梳状电极组由两个互不接触的其梳齿间相互交叉插入的梳状电极板构成，均为相互交叉插入的梳齿之间和梳齿尖与梳脊之间是该交叉梳状电极组与所述流路通道相通的工作段通道；在围出工作段通道的梳齿上排列有柱状的阵列电极。本发明不会对细胞产生化学毒害作用；能在低电压条件下运用；能适应不同的细胞；能极大地提高和控制对细胞的处理速度。
文档编号C12M1/42GK1858202SQ20061005412
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月9日 优先权日2006年3月9日
发明者赵志强, 郑小林, 皮喜田, 熊建功 申请人:重庆大学