专利名称：一种快速扩增双链rna靶序列的方法
技术领域：
本发明涉及双链RNA靶序列扩增，特别是以dsRNA为模板直接扩增。
背景技术：
病毒是一种由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生的最小的病原微生物。根据其核酸种类，可分为DNA病毒和RNA病毒。RNA病毒又分为双链RNA(dsRNA)病毒和单链RNA(ssRNA)病毒。单链RNA病毒在核酸复制过程中，要以其互补链为模板，在RNA聚合酶(RNA-dependent RNAPolymerase，RDRP)的作用下进行核酸的复制。因此，在RNA病毒的感染过程中，绝大多数都会存在双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的复制中间体，或者是遗传物质的一种存在方式。dsRNA的分析法已广泛应用于RNA病毒的研究中。应用这一方法有助于快速检测已知RNA病毒的感染情况。由于dsRNA包含了RNA病毒的全部遗传信息，并且dsRNA具有较其他核酸形式(如单链RNA)更好的理化稳定性，便于提取和贮存，是获得RNA病毒基因组信息的较好的材料。
聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或者DNA序列的方法。在传统PCR基础之上发展起来的RT-PCR则是首先以单链RNA为模板反转录生成cDNA，再在DNA聚合酶作用下通过PCR扩增得到所需的特异性片段。
RNA病毒基因组的特异性靶序列的扩增常用的方法主要有1)提取病毒粒子，再从病毒粒子中释放病毒核酸后，以此为模板进行RT-PCR扩增。2)从感病的组织中提取总RNA后，再进行RT-PCR扩增。3)提取与病毒感染相对应的dsRNA，以此为模板，再进行RT-PCR反应。这几种方法中都涉及反转录过程，试剂较贵，操作时需要特别小心，防止RNA的降解，从而给扩增带来不利影响。加之方法1还涉及病毒粒子的提取，设备要求高，操作繁琐。
DNA聚合酶(DNA polymerase)是一类以DNA或RNA为模板催化合成互补新链的酶。尽管大多数聚合酶优先作用于DNA模板，但也可作用于双链RNA模板。耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)是聚合酶中重要的一种，最初是从一种极度嗜热的栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化出来的，它是一种依赖于DNA模板的DNA聚合酶。根据国外的报道，这种DNA聚合酶同时也具有反转录酶活性，在国内也有研究报道以单链RNA(mRNA)为模板利用Taq DNA聚合酶进行反转录生成cDNA第一链的例子。但没有以双链RNA为模板利用Taq酶直接进行PCR扩增特定目标序列的报道。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明以dsRNA为模板，建立一种简单、快速扩增基因组靶序列的方法。
本发明的一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，它的步骤为(1)dsRNA的制备从组织中提取dsRNA；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物；PCR的条件反应体系1.5-2.5U的Taq酶，25-100ng/μL的dsRNA模板0.5μL，5-15μM的上游引物0.5-1.5μL，5-15μM的下游引物0.5-1.5μL，10倍Buffer2-5μL，2.5μM的dNTP 1.6-3.2μL，用ddH2O补足20-50μL；反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索；预变性5分钟以后，选择以下几个反应条件中的一个条件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、52.6℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、54.9℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；或94℃1min、56.7℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min。
所述的扩增结果用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
所述步骤(4)之后将PCR产物进行胶回收，可获得未知dsRNA序列。
本发明的优点(1)以dsRNA作为模板，充分利用了dsRNA的稳定性；(2)利用TaqDNA聚合酶既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性的特点，省去了反转录过程；(3)实验所需试剂少，操作简单，所用时间短，达到了省时、省钱、省力的效果。
图1为本发明实施例中黄瓜花叶病毒CMV RNA3的277bp特异性靶序列的扩增结果；图中1-DNA Mix Ladder Marker；2～7-退火温度设定依次为47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃。
图2为本发明实施例中黄瓜花叶病毒CMV RNA3的980bp特异性靶序列的扩增结果；图中1～6-退火温度设定依次为47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃；7-DNA Mix Ladder Marker。
图3为本发明实施例中黄瓜花叶病毒CMV的卫星RNA的全序列扩增结果；图中1～6-退火温度依次为47.0℃，47.9℃，50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃；7-DNA Mix ladder Marker。
图4为本发明实施例中传染性法氏囊病毒IBDV的vp2基因序列扩增结果；图中1-DNA Mix ladder Marker；2～7-退火温度依次为50.2℃，52.6℃，54.9℃，56.7℃，58.2℃，60.9℃。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明实施例1黄瓜花叶病毒(CMV)及其卫星RNA序列1、dsRNA的制备(1)称取5g去脉的黄瓜鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入10ml 2倍STE(乙二胺四乙酸、三-羟-甲基-氨基甲烷与氯花钠的混合物，pH8.0)，300μlβ-巯基乙醇，6ml饱和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml10％SDS(十二烷基磺酸钠)，充分匀浆20min；(3)4℃下15 000g离心15min，收集上清；(4)上清液用无水乙醇调至含乙醇17％的RNA混合液，室温下混匀；(5)称取3g纤维素(CF-11，Sigma公司产品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡后装柱，以50ml一次性塑料注射器或相当材料作为层析柱；(6)RNA混合液上样后，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脱，弃去最初的5ml液，收集随后的10～15ml，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置5min；(8)4℃下15 000g离心15min，弃上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉淀，真空干燥3min；(10)沉淀及时溶解于60μl TE(乙二胺四乙酸与三-羟-甲基-氨基甲烷的混合物)中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较dsRNA的相对大小，回收所需要的条带。
(12)将回收的dsRNA浓度调整为50ng/μl。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.PCR的条件(1)反应体系双链RNA在Taq酶作用下直接进行扩增，其反应体系为1.5U的Taq酶，25ng/μL的双链RNA模板0.5μL，5μM的上游引物0.5μL，5μM的下游引物0.5μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 1.6μL，用ddH2O补足20μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件
94℃1min、50.2℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
4.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得385bp和980bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知双链RNA序列。
实施例2黄瓜花叶病毒卫星RNA序列1.dsRNA的制备(1)称取5g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入10ml 2倍STE，300μl β-巯基乙醇，6ml饱和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml 10％ SDS，充分匀浆20min；(3)4℃下15 000g离心15min，收集上清；(4)上清液用无水乙醇调至含乙醇17％的RNA混合液，室温下混匀；(5)称取3g纤维素(CF-11，Sigma公司产品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡后装柱，以50ml一次性塑料注射器或相当材料作为层析柱；(6)RNA混合液上样后，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脱，弃去最初的5ml液，收集随后的10～15ml，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置5min；(8)4℃下15 000g离心15min，弃上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉淀，真空干燥3min；(10)沉淀及时溶解于60μl TE中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较dsRNA的相对大小，回收所需要的条带。
(12)将回收的dsRNA浓度调整为50ng/μl。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.PCR的条件(1)反应体系双链RNA在Taq酶作用下直接进行扩增，其反应体系为2.5U的Taq酶，100ng/μL的双链RNA模板2μL，15μM的上游引物1.5μL，15μM的下游引物1.5μL，10倍缓冲液5μL，5μM的dNTP3.2μL，用ddH2O补足50μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件94℃1min、52.6℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
4.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得385bp和980bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知双链RNA序列。
实施例3黄瓜花叶病毒及其卫星RNA序列。
1.dsRNA的制备(1)称取5g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入10ml 2倍STE，300μl β-巯基乙醇，6ml饱和酚，4ml三氯甲烷，1.4ml 10％SDS，充分匀浆20min；(3)4℃下15 000g离心15min，收集上清；(4)上清液用无水乙醇调至含乙醇17％的RNA混合液，室温下混匀；(5)称取3g纤维素(CF-11，Sigma公司产品)，用含17％乙醇的1倍STE平衡后装柱，以50ml一次性塑料注射器或相当材料作为层析柱；(6)RNA混合液上样后，用90ml含17％乙醇的1倍STE洗柱；(7)用不含乙醇的1倍STE洗脱，弃去最初的5ml液，收集随后的10～15ml，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置5min；(8)4℃下15 000g离心15min，弃上清；(9)用200μl 70％乙醇洗沉淀，真空干燥3min；(10)沉淀及时溶解于60μl TE中，-20℃保存；(11)取5μl溶液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，比较dsRNA的相对大小，回收所需要的条带。
(12)将回收的dsRNA浓度调整为50ng/μl。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.PCR的条件(1)反应体系双链RNA在Taq酶作用下直接进行扩增，其反应体系为2.0U的Taq酶，50ng/μL的双链RNA模板0.5μL，5μM的上游引物1.0μL，5μM的下游引物1.0μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP2.0μL，用ddH2O补足20μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件94℃1min、56.7℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
4.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得385bp和980bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知双链RNA序列实施例4传染性法氏囊病毒(IBDV)的dsRNA为例dsRNA的制备1.感病组织或细胞总RNA的提取(1)称取0.1g感病组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入1ml Trizol充分匀浆2min；(3)4℃下12 000g离心10min，收集上清，去除不溶物；(4)将匀浆上清于室温下放置5min；
(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，轻微振荡15秒后，于室温放置2-3min；(6)4℃下12 000g离心15min，收集上清；(7)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃下12 000g离心10min，弃上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉淀，7500g离心5min，空气干燥5min；(9)沉淀及时溶解于50μl DEPC-H2O(焦碳酸二乙酯-水)中，-20℃保存；(10)取5μl总RNA溶液在1％琼脂糖凝胶上进行甲醛变性电泳分析，检测总RNA的完整性。比较dsRNA的相对大小，回收所需要的条带，并将回收的dsRNA将浓度调整为50ng/μl。
2.引物设计根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用PrimerPrimier5.0软件设计相应引物。设计的VP2基因的上游引物为SEQ ID NO7，下游引物为SEQ ID NO8，预计靶序列长度为1338bp。
3.PCR的条件(1)反应体系双链RNA在Taq酶作用下直接进行扩增，其反应体系为2.0U的Taq酶，50ng/μL的双链RNA模板1μL，10μM的上游引物1μL，10μM的下游引物1μL，10倍缓冲液3μL，3μM的dNTP 2μL，用ddH2O补足30μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，在以下反应条件下，均可得到较好的扩增结果94℃1min、54.9℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
4.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得1338bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知双链RNA序列，按常规方法克隆测序。
对照例1黄瓜花叶病毒及其卫星RNA序列。
1.植物总RNA的提取
(1)称取0.1g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入1ml Trizol充分匀浆2min；(3)4℃下12 000g离心10min，收集上清，去除不溶物；(4)将匀浆上清于室温下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol(含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等的混合物)，轻微振荡15sec后，于室温放置2-3min；(6)4℃下12 000g离心15min，收集上清；(7)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃下12 000g离心10min，弃上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉淀，7500g离心5min，空气干燥5min；(9)沉淀及时溶解于50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl总RNA溶液在1％琼脂糖凝胶上进行甲醛变性电泳分析，检测总RNA的完整性。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.反转录(即cDNA的合成)反转录体系为2μg的总RNA 4μL，5μM的下游引物0.5μL，2.5μM dNTP0.5μL，DEPC-H2O 1μL，将上述溶液混匀，于65℃保温10min，冰浴5min，然后加入反转录缓冲液2μL、1.25U的RNA酶抑制剂0.25μL、1.25U的反转录酶0.25μL，将溶液混匀后置于42℃保温60min，即可得到cDNA。
4.PCR的条件(1)反应体系cDNA在Taq酶作用下进行扩增，其反应体系为1.5U的Taq酶，cDNA模板3μL，5μM的上游引物0.5μL，5μM的下游引物0.5μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 1.6μL，用ddH2O补足20μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
5.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得385bp和980bp产物；(2)PCR产物进行胶回收，获得未知RNA病毒序列。
与实施例1比较，一次实验成本增加1/4，时间延长90分钟。
对照例2黄瓜花叶病毒卫星RNA序列1.植物总RNA的提取(1)称取0.1g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入1ml Trizol充分匀浆2min；(3)4℃下12 000g离心10min，收集上清，去除不溶物；(4)将匀浆上清于室温下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，轻微振荡15sec后，于室温放置2-3min；(6)4℃下12 000g离心15min，收集上清；(7)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃下12 000g离心10min，弃上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉淀，7500g离心5min，空气干燥5min；(9)沉淀及时溶解于50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl总RNA溶液在1％琼脂糖凝胶上进行甲醛变性电泳分析，检测总RNA的完整性。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.反转录(即cDNA的合成)反转录体系为2μg的总RNA 4μL，5μM的下游引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，将上述溶液混匀，于65℃保温10min，冰浴5min，然后加入反转录缓冲液2μL、1.25U的RNA酶抑制剂0.25μL、1.25U的反转录酶0.25μL，将溶液混匀后置于42℃保温60min，即可得到cDNA。
4.PCR的条件(1)反应体系cDNA在Taq酶作用下进行扩增，其反应体系为2.5U的Taq酶，cDNA模板3μL，15μM的上游引物1.5μL，15μM的下游引物1.5μL，10倍Buffer 5μL，2.5μM的dNTP 3.2μL，用ddH2O补足50μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件94℃1min、52.6℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
5.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得385bp和980bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知RNA病毒序列。
与实施例2比较，一次实验成本增加1/4，时间延长80分钟。
对照例3黄瓜花叶病毒及其卫星RNA序列。
1.植物总RNA的提取(1)称取0.1g去脉的鲜叶组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入1ml Trizol充分匀浆2min；(3)4℃下12 000g离心10min，收集上清，去除不溶物；(4)将匀浆上清于室温下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，轻微振荡15sec后，于室温放置2-3min；(6)4℃下12 000g离心15min，收集上清；
(7)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃下12 000g离心10min，弃上清；(8)用800μl 70％乙醇洗沉淀，7 500g离心5min，空气干燥5min；(9)沉淀及时溶解于50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl总RNA溶液在1％琼脂糖凝胶上进行甲醛变性电泳分析，检测总RNA的完整性。
2.引物设计根据GenBank中的CMV病毒及其卫星RNA的基因组序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计相应引物。靶序列长度在100bp-1000bp均可进行直接扩增。上游引物SEQ ID NO1，下游引物SEQ ID NO2。预计产物长度为385bp。运用同样方法设计CMV RNA3的两对引物。一对是短片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO3，下游引物SEQ ID NO4。预计产物长度为277bp。另一对是长片段靶序列引物，上游引物SEQ ID NO5，下游引物SEQ ID NO6。预计产物长度为980bp。
3.反转录(即cDNA的合成)反转录体系为2μg的总RNA 4μL，5μM的下游引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，将上述溶液混匀，于65℃保温10min，冰浴5min，然后加入反转录缓冲液2μL、1.25U的RNA酶抑制剂0.25μL、1.25U的反转录酶0.25μL，将溶液混匀后置于42℃保温60min，即可得到cDNA。
4.PCR的条件(1)反应体系cDNA在Taq酶作用下进行扩增，其反应体系为2.0U的Taq酶，cDNA模板3μL，10μM的上游引物1.0μL，10μM下游引物1.0μL，10倍Buffer 2μL，2.5μM的dNTP 2.0μL，用ddH2O补足20μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，选择反应条件94℃1min、56.7℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
5.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得385bp和980bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知RNA病毒序列。
与实施例3比较，一次实验成本增加1/4，时间延长95分钟。
对照例4传染性法氏囊病毒(IBDV)的dsRNA为例1.感病组织或细胞总RNA的提取(1)称取0.1g感病组织，在液氮中充分研磨至粉末状；(2)加入1ml Trizol充分匀浆2min；(3)4℃下12 000g离心10min，收集上清，去除不溶物；(4)将匀浆上清于室温下放置5min；(5)加入0.2ml氯仿/1ml Trizol，轻微振荡15sec后，于室温放置2-3min；(6)4℃下12 000g离心15min，收集上清；(7)加入0.5ml异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃下12 000g离心10min，弃上清(8)用800μl 70％乙醇洗沉淀，7 500g离心5min，空气干燥5min；(9)沉淀及时溶解于50μl DEPC-H2O中，-20℃保存；(10)取5μl总RNA溶液在1％琼脂糖凝胶上进行甲醛变性电泳分析，检测总RNA的完整性。
2.引物设计根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用PrimerPrimier5.0软件设计相应引物。设计的VP2基因的上游引物为SEQ ID NO7，下游引物为SEQ ID NO8，预计靶序列长度为1338bp。
3.反转录(即cDNA的合成)反转录体系为2μ的g总RNA 4μL，5μM的下游引物0.5μL，2.5μMdNTP 0.5μL，DEPC-H2O 1μL，将上述溶液混匀，于65℃保温10min，冰浴5min，然后加入反转录缓冲液2μL、1.25U的RNA酶抑制剂0.25μL、1.25U的反转录酶0.25μL，将溶液混匀后置于42℃保温60min，即可得到cDNA。
4.PCR的条件(1)反应体系cDNA在Taq酶作用下进行扩增，其反应体系为2.0U的Taq酶，cDNA模板3μL，10μM的上游引物1.0μL，10μM的下游引物1.0μL，10倍Buffer 3μL，2.5μM的dNTP 2.0μL，用ddH2O补足30μL。
(2)反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索。预变性5分钟以后，在以下反应条件下，均可得到较好的扩增结果94℃1min、54.9℃30s、72℃1min，35个循环，最后一个循环72℃延伸10min。
5.扩增结果检测(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果获得1338bp产物。
(2)PCR产物进行胶回收，获得未知双链RNA序列，按常规方法克隆测序。
与实施例4比较，一次实验成本增加1/4，时间延长85分钟。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表SEQ ID NO129 cctctagagg cctgttttgt ttgttggagSEQ ID NO227 ttgagctccc gggtcctgta gaggaatSEQ ID NO321 tgtgggtgac agtccgtaaa gSEQ ID NO420 agatgtggga atgcgttggtSEQ ID NO517 gcgatgcgtg ttgagaaSEQ ID NO621 tttagccgta agctggatgg aSEQ ID NO730 atcggtaccc agattgttcc gttcatacogSEQ ID NO829 ggcgaattcc cggattatgt ctttgaagc
权利要求
1.一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，其特征在于它的步骤为(1)dsRNA的制备从组织中提取dsRNA；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物；PCR的条件反应体系1.5-2.5U的Taq酶，25-100ng/μL的dsRNA模板0.5μL，5-15μM的上游引物0.5-1.5μL，5-15μM的下游引物0.5-1.5μL，10倍Buffer 2-5μL，2.5μM的dNTP 1.6-3.2μL，用ddH2O补足20-50μL；反应条件采用温度梯度PCR仪，对靶序列扩增时的退火温度条件进行摸索；预变性5分钟以后，选择以下几个反应条件中的一个条件94℃1min、50.2℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、52.6℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；94℃1min、54.9℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min；或94℃1min、56.7℃30s、72℃1min、35个循环、72℃延伸10min。
2.根据权利要求1所述的一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，其特征在于扩增结果用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
3.根据权利要求1所述的一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，其特征在于步骤(4)之后将PCR产物进行胶回收，可获得未知dsRNA序列。
全文摘要
本发明公开了一种快速扩增双链RNA靶序列的方法，步骤包括(1)dsRNA的制备；(2)通过琼脂糖电泳进行割胶回收、分离纯化dsRNA；(3)根据GenBank中的病毒基因组相应序列及其一二级结构特点，运用Primer Primier5.0软件设计设计获得双链RNA的相应引物；(4)以回收后的dsRNA为模板，添加双链RNA的相应引物，在Taq酶作用下直接进行PCR扩增，获得目的产物。本发明以dsRNA作为模板，充分利用了dsRNA的稳定性；利用TaqDNA聚合酶既有反转录酶活性又有DNA聚合酶活性的特点，省去了反转录过程；实验所需试剂少，操作简单，所用时间短，达到了省时、省钱、省力的效果。
文档编号C12Q1/68GK1940083SQ200610053618
公开日2007年4月4日 申请日期2006年9月27日 优先权日2006年9月27日
发明者陈集双, 唐香山, 竺锡武, 陈绍宁, 刘伟侠, 廖乾生, 冯俊丽 申请人:浙江理工大学