专利名称：地衣芽孢杆菌b－05571及其在制备1,3－二羟基丙酮中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)及其在制备1，3-二羟基丙酮中的应用。
背景技术：
二羟基丙酮，又称为1，3-二羟基丙酮(1，3-Dihydroxyacetone)(以下简称DHA)，是最单的酮糖，带有甜味的白色粉末状结晶，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂。这种化学物质的分子量为90.08。
DHA是一种重要的化工原料、医药中间体和食品添加剂，用途广泛(1)DHA分子中含有三个官能团，化学性质活泼，广泛参与诸如聚合、缩合等各种化学反应，是一种重要的化学合成的中间体，也是一个重要的多功能试剂，如能有效地参与从甲醛到羟醛、羟酮的缩合反应。(2)DHA广泛应用于化妆品中，能阻止皮肤的水份的过度蒸发，对皮肤起到保湿和防晒作用，在制革工业中，DHA可作为皮革制品的保护剂。(3)DHA是一种重要的医药中间体和药物，现已应用于低血糖和糖尿病及某些皮肤病的治疗。(4)DHA可作为一种食品添加剂，可应用于食品生产。
由于DHA用途广泛，市场容量大，用生物转化甘油生产二羟基丙酮的研究具有重要的意义。
国外用微生物发酵方法转化甘油为二羟基丙酮己有很多专利和文献报道，所用的用于产生甘油脱氢酶的微生物主要是葡糖杆菌属(Gluconobacter)(US 5770411)和醋杆菌属(Acetobacter)(US 4076589)微生物，尤其是氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)和弱氧化醋杆菌(Acebobacter Suboxydans)的报道居多，此外还研究过芽孢杆菌属(Bacillus)的枯草杆菌(Bacillus subtilis FERM P-10524)(JP 2286089)、单孢丝菌属(Micromonospora)(JP 62210994)，假单孢菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、克霉伯氏菌属(Klebsiella)、欧文艺节目氏菌属(Erwinia)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、根霉属(Rhizopus)(US 4576913)。
微生物转化法生产DHA与化学合成法相比具有许多优点专一性强、反应条件温和、底物利用率高、转化率高、生产工艺简单等优点。从技术的经济性，环境的友好性的角度来看，微生物转化生产DHA更具有经济效益与社会效益。而且生物转化技术已日趋成熟，该技术已广泛应用于各类物质的生产，如抗生素、甾体激素、氨基酸等。
发明内容本发明的目的是为了提供一株从土壤中筛选到将甘油生物转化为二羟基丙酮的新的微生物菌株地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)及其在制备1，3-二羟基丙酮中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。提议的分类命名为地衣芽孢杆菌B-05571(Bacilluslicheniformis B-05571)。
所述地衣芽孢杆菌B-05571菌落形态为菌落呈土黄色，边缘光滑，表面微隆起，微绉折，粘稠；细胞形态为显微镜观察菌体形状呈杆状，有时候成链状，产芽孢；生理生化指标为接触酶阳性，V-P测定阳性，能利用明胶、淀粉，能利用柠檬酸盐、丙酸盐。能利用肌醇，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇等。
根据以上微生物学特征，这新的菌株被鉴定地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。这株微生物不属于上述已公开专利菌种的任何一种，该微生物菌株具有将甘油转化为DHA的能力，可以用于DHA的生产。
所述的地衣芽孢杆菌B-05571可用于制备1，3-二羟基丙酮。所用到的原料是一种广泛应用工业化学品——甘油(丙三醇)，甘油2位羟基(2-OH)经过微生物细胞内甘油脱氢酶催化反应，生成酮基，得到DHA。
应用时，可将菌种接种至含底物甘油的培养基中进行发酵，发酵液经分离纯化获得DHA；也可将菌种接种至含底物甘油的培养基中培养菌体至对数生长期，分离获得菌体，利用菌体生物催化甘油生产DHA，反应液经分离纯化得到DHA；或者将菌种接种至含底物甘油的培养基中进行发酵，在发酵过程中流加灭菌后的甘油水溶液，发酵产物经分离纯化得到DHA。
具体的，所述的应用是将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵培养24～96小时，优选在28℃～35℃、中性pH值下培养48小时左右，发酵液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。该方法中培养基组成中的甘油既是微生物利用的碳源，又是被微生物分解的底物；底物甘油经过微生物的脱氢反应，生成DHA。
或者，将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及、氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵培养菌体至对数生长期，培养液离心分离得到菌体，所得菌体再加入0.5～15％的甘油水溶液中反应1～90小时，反应液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。本发明中所述甘油水溶液的浓度以重量/体积百分比表示，浓度为1％表示每100mL溶液中含有1g甘油。
又或者，所述的应用是将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵，在发酵过程中流加灭菌后的10％～80％的甘油水溶液，发酵24～96小时。反应液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。
所述培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用。所述培养基组成以重量/体积百分比表示，某组分含量为1％表示每100mL培养基中含有1g该物质。
从发酵液中提取目标产物时，可采用常规的发酵产物提取法。如过滤、离心、沉淀、结晶、重结晶、浓缩、干燥、冷冻干燥，吸附、离子交换、层析等等。
本发明中，所述1，3-二羟基丙酮的分离纯化方法如下将发酵液或反应液浓缩，上述浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。BV/h表示每小时流经柱子的洗脱液为柱床体积BV(Bed Volume)的倍数。
优选的，所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养24小时获得种子液；(2)取上述培养基，灭菌，以体积比1.5％接种量接入种子液，摇床转速150r/min，28℃下培养72小时，收集发酵液，10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(3)步骤(2)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
或者，所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养菌体至对数生长期；培养液离心分离得到菌体，加入5％的甘油水溶液中，摇床转速100r/min，28℃下反应24小时；(2)步骤(1)所得反应液10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(3)步骤(2)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集合1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
又或者，所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养24小时获得种子液；(2)取上述培养基放入发酵罐，灭菌，以体积比1.5％的接种量接入种子液，通气量0.8vvm，28℃下发酵培养菌体至对数生长期，再流加甘油，每7L培养基流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min，28℃下培养80小时；(3)收集发酵液，10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(4)步骤(3)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
本发明中，DHA的分析方法可采用气相色谱与薄层层析方进行DHA薄层层析方法实验采用G型硅胶板(20mm×10mm)，展开剂氯仿-甲醇-蒸馏水混合溶剂(体积比为80∶19∶1)，显色剂组成为磷钼酸3g，甲醇45ml，蒸馏水45ml和浓硫酸10ml。具体操作步骤将点样后的硅胶薄板以基准线向下放置在装有展开剂的层析缸中展开10～15min，直至展开剂扩散至距离薄板顶端1～2cm处。取出薄板，吹干，碘缸中熏蒸2～5min，显色，放入烘箱中，在110℃下烘烤10min左右，即可呈现DHA斑点，通过和不同浓度梯度标准品显示的斑点大小相比较，判断样品中DHA含量。
DHA气相色谱分析方法所用的仪器瓦里安varian cp-3800气相色谱仪，带氢火焰离子化检测器；PY-2020iD型裂解器(Frontier LaboratoriesLtd.Japan)。所用试剂TMAH(25％水溶液)，二羟基丙酮(色谱纯)，甘油、无水甲醇(分析纯)，蒸馏水。色谱条件Ultra ALLOY-5不锈钢毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；汽化温度400℃；检测器温度280℃；柱温50℃开始以1℃/min升至60℃，再以10℃/min升至280℃；分流比30∶1；载气，氮气；柱流量1ml/min。加样0.2μL发酵上清夜和0.4μL TMAH(25％水溶液)。
本发明的微生物菌株地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)，不仅能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，而且对甘油进行脱氢反应的能力较强；利用地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformisB-05571)生产二羟基丙酮，甘油的转化率达到50％～90％，(即1摩尔的甘油能转化为0.50～0.99摩尔的二羟基丙酮)，适用于二羟基丙酮的工业化生产。
(四)
地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1培养基配方(重量/体积百分比，以下同)甘油0.5％，酵母粉0.1％，蛋白胨0.1％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，用自来水配制，用HCl溶液将pH调到4.0，再加入CaCO30.2％，灭菌备用。
取100mL上述培养基，平均分装在2个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液。
取2L上述培养基，平均分装入40个500mL摇瓶中，灭菌。接入种子液，以体积比1.5％的接种量接入种子液，进行培养，培养温度为20℃，摇床转速150r/min，培养时间为72h，甘油转化成DHA的转化率为88％。
收集上述发酵液1.5L，经过离心(10000×g，10min)之后，上清液浓缩至500mL，在55℃下活性炭脱色30min，然后真空浓缩至浆状，加入与浆状物同体积的无水乙醇混匀，真空浓缩去乙醇，反复加入乙醇三次，浓缩至无乙醇为止，浓缩物备用。
上述浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离浓缩物中的二羟基丙酮和甘油，柱高径比35∶1，使用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积5％时，采用95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.2BV/h，收集含二羟基丙酮段样品，进行真空浓缩，在95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中获得白色二羟基丙酮结晶，冷冻干燥后得到2.86克DHA。
实施例2培养基配方甘油8.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.5％，CaCO30.4％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
取500mL培养基，平均分装在10个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，进行培养，培养温度为28℃，培养时间为50h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。甘油转化成DHA的转化率为65％。
收集上述发酵液400mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到7.42克DHA。
实施例3发酵培养基配方甘油14％，酵母粉2.5％，蛋白胨2.5％，牛肉膏2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
种子培养基配方甘油1.0％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.2％，用自来水配制，用NaOH溶液将pH调到7.0，灭菌备用。
取100mL种子培养基，平均分装在2个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，培养菌体，摇床转速200r/min，在30℃摇床培养24h作为种子液，备用。
取4L发酵培养基，平均分装在80个500mL三角瓶中，灭菌。接入种子液，以体积比2.0％的接种量接入种子液，进行培养，培养温度为30℃，培养时间为72h，反应在搅拌、通风、振荡条件下进行，摇床转速200r/min。甘油转化成DHA的转化率为50％。
收集上述发酵液3.5L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到116.1克DHA。
实施例4培养基配方甘油1.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，CaCO30.2％，用自来水配制，pH 7.0，灭菌备用。
取200mL上述培养基，平均分装在4个250mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基6.0L，灭菌，接入种子液100mL，28℃下进行发酵培养。
在接种后，随即开始流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.4mL/min；培养温度30℃，培养时间为72h左右，通气量5L/min，搅拌速度300r/min。甘油转化成DHA的转化率为70％。
收集上述发酵液6L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到216.3克DHA。
实施例5培养基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，用自采水配制，pH6.5，再加入CaCO30.2％，灭菌备用。
取200mL上述培养基，平均分装在4个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养72h作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基7L，灭菌，接入种子液100mL，28℃下进行发酵培养。
在菌体生长到对数期时(发酵20h后)进行流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min；培养温度28℃，继续培养80h左右，通气量5L/min，搅拌速度300r/min。甘油转化成DHA的转化率为68％。
收集上述发酵液7L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到235.7克DHA。
实施例6培养基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，用自来水配制，用HCl调节pH为6.0，再加入CaCO30.1％，灭菌备用。
取1000mL培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，28℃下发酵培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将这些菌体加入到300mL0.5％的甘油水溶液中，利用菌体对甘油进行脱氢反应；反应条件温度28℃，初始pH为6.5，反应时间为24h左右，摇床转速100r/min。甘油转化成DHA的转化率为99％。
收集上述反应液250mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到0.7克DHA。
实施例7培养基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.0，灭菌备用。
取1000mL培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，28℃下发酵培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将这些菌体加入到300mL14％的甘油水溶液中，利用菌体生物催化甘油生产二羟基丙酮；反应条件温度32℃，初始pH为5.0，反应时间为48h左右，摇床转速100r/min。甘油转化成DHA的转化率为60％。
收集上述反应液250mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到13.1克DHA。
实施例8培养基配方甘油2.0％，酵母粉0.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏0.1％，NaH2PO4·2H2O0.1％，CaCO30.1％，用自来水配制，用NaOH溶液调节pH为7.0，灭菌备用。
取1000mL培养基，平均分装在20个500mL三角瓶中，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，28℃下发酵培养菌体到对数生长期，然后进行离心分离，得到菌体，将这些菌体加入到300mL 1.0％的甘油水溶液中，利用菌体生物催化甘油生产二羟基丙酮，在反应开始时流加50％甘油60mL，流加速度为0.1mL/min；反应条件温度32℃，初始pH为5.0，反应时间为48h左右，摇床转速100r/min。甘油转化成DHA的转化率为70％。
收集上述反应液250mL，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到9.8克DHA。
实施例9培养基配方甘油2.0％，酵母粉2.5％，蛋白胨1.0％，牛肉膏1.0％，NaH2PO4·2H2O0.5％，用自来水配制，pH6.5，再加入CaCO30.2％，灭菌备用。
取200mL上述培养基，平均分装在4个500mL三角瓶中，灭菌。接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，培养菌体，摇床转速150r/min，在28℃摇床培养24h作为种子液，备用。
在10L发酵罐中加入上述培养基7L，灭菌，接入种子液150mL，通风量5L/min，转速200rpm，培养24小时为种子液，备用。
在500L发酵罐中加入上述培养基350L，灭菌，接入种子液5.5L，通风量200L/min，转速300rpm，在菌体生长到对数期时(发酵20h后)进行流加50％的甘油水溶液50L，流加速度20mL/min；培养温度28℃，培养时间为70h左右。甘油转化成DHA的转化率为85％。
收集上述发酵液10L，进行分离、纯化，步骤同实施例1，得到241.3克DHA。
权利要求
1.地衣芽孢杆菌B-05571(Bacillus licheniformis B-05571)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M 206082。
2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌B-05571，其特征在于所述地衣芽孢杆菌B-05571菌落形态为菌落呈土黄色，边缘光滑，表面微隆起，微绉折，粘稠；细胞形态为显微镜观察菌体形状呈杆状，有时候成链状，产芽孢；生理生化指标为接触酶阳性，V-P测定阳性，能利用明胶、淀粉，能利用柠檬酸盐、丙酸盐，能利用肌醇，半乳糖，阿拉伯糖，木糖，甘露醇。
3.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌B-05571在制备1，3-二羟基丙酮中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用是将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵培养24～96小时，发酵液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用是将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵培养菌体至对数生长期，培养液离心分离得到菌体，所得菌体再加入0.5～15％的甘油水溶液中反应1～90小时，反应液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用是将所述地衣芽孢杆菌B-05571在含有底物甘油、以及氮源、无机盐的培养基中，初始pH为4.0～7.0，在20～40℃下发酵培养，发酵过程中流加10％～80％的甘油水溶液，总发酵时间24～96小时，反应液经分离纯化得到所述的1，3-二羟基丙酮。
7.如权利要求4～6之一所述的应用，其特征在于所述培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用。
8.如权利要求4～6之一所述的应用，其特征在于所述1，3-二羟基丙酮的分离纯化方法如下将发酵液或反应液浓缩，浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
9.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养24小时获得种子液；(2)取上述培养基，灭菌，以体积比1.5％的接种量接入种子液，摇床转速150r/min，28℃下培养72小时，收集发酵液，10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(3)步骤(2)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
10.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养菌体至对数生长期；培养液离心分离得到菌体，加入5％的甘油水溶液中，摇床转速100r/min，28℃下反应24小时；(2)步骤(1)所得反应液10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(3)步骤(2)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h，收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
11.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述1，3-二羟基丙酮制备方法如下培养基组成如下甘油0.5～14％，酵母粉0.1％～2.5％，蛋白胨0.1％～2.5％，牛肉膏0.1％～2.5％，NaH2PO4·2H2O0.1％～0.5％，CaCO30.1％～0.4％，余量为水，pH值4.0～7.0，灭菌备用；(1)取上述培养基，灭菌，接入斜面菌种地衣芽孢杆菌B-05571，摇床转速150r/min，28℃下培养24小时获得种子液；(2)取上述培养基放入发酵罐，灭菌，以体积比1.5％的接种量接入种子液，通气量0.8vvm，28℃下发酵培养菌体至对数生长期，再流加甘油，每7L培养基流加50％的甘油水溶液1.5L，流加速度0.5mL/min，28℃下培养80小时；(3)收集发酵液，10000g离心10分钟，浓缩至浓缩液为原液体积的1/3，55℃下活性炭脱色30min，真空浓缩至浆状，加入无水乙醇混匀，真空浓缩除去乙醇，反复加入乙醇浓缩至无乙醇，得浓缩物；(4)步骤(3)所得浓缩物通过装有100～200目硅胶的吸附层析柱分离提取其中的二羟基丙酮，柱高径比10～40∶1，采用石油醚湿法装柱，加样量为柱床体积3％～10％，以体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇混合溶剂为流动相洗脱，洗脱流速0.05BV/h～0.5BV/h、收集含1，3-二羟基丙酮洗脱液，真空浓缩，在体积比95∶5的乙酸乙酯-乙醇溶液中结晶，得到所述1，3-二羟基丙酮的晶体。
全文摘要
本发明提供了一株从土壤中筛选到将甘油生物转化为二羟基丙酮的新的微生物菌株地衣芽孢杆菌B－05571(Bacillus licheniformisB－05571)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No.M 206082，保藏日期2006年8月29日。提议的分类命名为地衣芽孢杆菌B－05571(Bacillus licheniformin B－05571)。本发明的微生物菌株地衣芽孢杆菌B－05571(Bacillus licheniformis B－05571)，不仅能在以甘油为唯一碳源的培养基上生长，而且对甘油进行脱氢反应的能力较强；利用地衣芽孢杆菌B－05571(Bacillus licheniformis B－05571)生产二羟基丙酮，在较佳工艺条件下，甘油的转化率达到50％～90％，(即1摩尔的甘油能转化为0.50～0.90摩尔的二羟基丙酮)，适用于二羟基丙酮的工业化生产。
文档编号C12P7/24GK101037659SQ200610053548
公开日2007年9月19日 申请日期2006年9月22日 优先权日2006年9月22日
发明者郑裕国, 胡忠策, 柳志强, 沈寅初 申请人:浙江工业大学