靶核酸序列的热依赖性链反应扩增装置的制作方法

专利名称：靶核酸序列的热依赖性链反应扩增装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及遗传学领域。
更具体地说，本发明涉及用于扩增靶核酸序列的装置，涉及用于该装置的反应卡盘，还涉及应用该装置的方法。
本发明的目的是检测和，如果需要的话，实时量化一个或多个样品中的靶核酸序列。
检测靶核酸序列是一项在很多领域中以日益增大的程度应用的技术，而且预计该技术的应用范围将扩大，因为它变得更可靠、更廉价和更迅速。在人类健康领域内，检测某些核酸序列在有些情况下可提供对病毒感染或细菌感染的可靠而迅速的诊断。同样，检测一定的遗传特质能鉴定对某些疾病的易感性，或者提供对遗传病或肿瘤病的早期诊断。靶核酸序列的检测还被用于农业营养(agroalimentary)工业，特别是提供产品跟踪能力，检测遗传修饰的生物的存在和鉴别它们，或者进行食品检验。
基于核酸的检测操作几乎系统地包括靶核酸序列和一条或多条与该靶序列互补的核酸序列之间的分子杂交反应。这样的方法具有一些变体，例如，被技术人员称为“转移技术”的方法(印迹、斑点印迹、DNA印迹、限制酶切片段长度多形性等)，或者例如小型化系统，其上预先固定了靶序列的互补序列(微阵列)。在这类技术的范围内，互补核酸序列通常被称为探针。一个进一步的变体，它自身构成诊断方法的基础或者可能只是上述方法之一中的补充步骤(特别是增大靶序列的浓度，从而提高诊断的灵敏度)，包括扩增靶核酸序列。人们描述了一些可以特异性地扩增核酸序列的技术，最通用的技术是聚合酶链反应(PCR)。在该技术的范围内，靶序列的互补核酸序列(称为引物)被用来扩增那些靶序列。
PCR反应涉及重复的循环(通常20～50次)，而每一次包括三个连续阶段，即变性、引物退火、链伸长。第一阶段相应于将双链核酸转化为单链核酸，第二阶段是靶序列与所述序列的互补引物之间的分子杂交，而第三阶段相应于利用DNA聚合酶使同靶序列杂交的互补引物伸长。那些阶段是在特定的温度下进行的通常，就变性来说是95℃，就伸长来说是72℃，以及就退火来说是30℃和65℃之间，这取决于应用的引物的解链温度(Tm)。还可能在相同温度下(通常60℃)进行退火和伸长。
这样，PCR反应包括一系列重复的热循环，期间对每次循环，一些起模板作用的靶DNA分子数在理论上加倍了。实际上，PCR产率小于100％，所以，n次循环后获得的产品Xn的量是Xn＝Xn-1(1+rn)，其中，Xn-1是先前的循环中获得的产品量，而rn则是循环n中的PCR产率(0＜rn≤1)。
假定产率是恒定的，即，每次循环的产率相同，从初始量X0开始n次循环以后获得的产品Xn的量是Xn＝X0(1+r)n(A)实际上，产率r在PCR反应期间减小了，这是由于下列一些因素的影响，例如，扩增所需反应物中至少一种的有限量，聚合酶在95℃下重复通过而失活，或者它受反应产生的焦磷酸盐的抑制。
由于产率的减小，PCR反应动力学首先表现为指数期(其中，r是常数)，它随后变成平稳期(此时，r减小了)。
在指数期，上述方程(A)适合，还可写成log(Xn)＝log(X0)+nlog(1+r)于是，在PCR的指数期，作为循环次数的函数、显示基于对数标度的产品量的曲线是一条直线，它的斜率(1+r)，在等于起始浓度的对数的值处与纵坐标相交。
实时测定获得的产品的量就可以提供模板的初始浓度，它在大量应用中极为重要，例如，当测定患者的病毒量时，或者测定转录子(transcriptome)的可变性时。
通常，PCR应用2μl～50μl的反应体积，并且是在管子、微型管、毛细管或本领域称为“微型板”的体系(微型管的组合件)中进行。于是，必须将每批管子或等同的容器依次加热到三个温度(相应于PCR的不同阶段)达预期的循环次数。
利用管子或类似体系迫使操作人员进行很多次操作而预备如待扩增的靶序列那样多的管子和溶液(在本领域中称为“混合PCR”)，即使应用核酸的单一样品时也是这样，不同的是多重扩增方法(它在同一容器内同时扩增很多靶序列)，要么利用可以与很多靶序列杂交的低特异性引物，例如RAPD-随机扩增多态DNA，要么利用更大量的特异性引物，此时，应用的每对引物扩增一条靶序列。多重扩增相应于特殊情况，所以不常用。此外，它们不保证一个扩增反应与另一个不相互作用，而且由于引物之间可能的杂交，可能在每个容器内扩增的靶序列数只是很有限。
那些不同的操作导致一些缺点。
首先，它们是费时的。其次，就从一支管到另一支的或者来自外部环境的可能污染(尘、细菌、气溶胶或者可能含核酸分子或会影响扩增反应效率的分子的其它污染物)而言，它们是有危险的。此外，不保证一支管到另一支的体积和反应物浓度的均一性。最后，需要手工控制体积，而且体积通常大于1μl，它影响进行PCR的费用，因为应用的反应物都是昂贵的。
为了这类操作的至少部分自动化而设计的装置的应用可以克服某些那样的缺点。然而，那些设备较为昂贵，只有在进行很多PCR扩增(例如，基因组测序)时，它们的应用在经济上才合算。
还存在一些可进行动态PCR扩增的设备。如上可见，动态PCR要求实时、特异性量化扩增的靶序列。荧光报道基因在反应混合物中的应用使该混合物中待测的双链DNA总量增大。然而，该方法不能区分靶序列的扩增与背景噪声或可能的非特异性扩增。最近描述了几个特异性地测定一组靶序列的扩增的探针体系。它们基于该序列的互补寡核苷酸，而且连接到成对的荧光基团或荧光团/猝灭剂，于是，探针与它的靶的杂交和依次的扩增循环引起混合物的总荧光(随情况而定)与靶序列的扩增成比例的增大或减小。
值得一提的可被用来进行动态PCR的探针实例有TaqManTM(ABI)、AmpliSensorTM(InGen)和SunriseTM(Oncor，Appligène)体系。
最广泛应用的体系是TaqManTM体系。
在PCR过程中，该方法结合DNA聚合酶的活性与Taq聚合酶的5′→3′核酸酶的活性。原理如下除了两个引物(具有与待扩增的靶的序列互补的序列)之外，还往反应介质中添加一种探针(报道探针)。它具有与扩增的序列主体中的靶杂交的能力，但自身不能被扩增。在探针的3′端添加一个磷酰基可防止它通过Taq聚合酶伸展。将一种荧光素衍生物和一种若丹明衍生物分别结合入所述探针的5′端和3′端。该探针小，所以，与所述荧光素接近的若丹明衍生物吸收从受激发(猝灭)时的荧光素发出的能量。
一旦引物在伸长反应过程中与靶杂交，Taq DNA聚合酶就通过它的5′核酸酶活性攻击探针，释放猝灭剂基团，从而恢复荧光。那么，发出的荧光的强度与形成的PCR产物的量成正比，它提供定量的结果。发出的荧光与靶分子的初始数量成正比。可以在扩增反应期间实时跟踪荧光形成动力学。
该技术具有能容易自动化的优点。由Perkin-Elmer出售了一种能实施该技术的设备，即，ABI Prism 7700TM。该设备结合了热周期计和荧光计。它能通过位于每支管下方并且与一个CCD摄像机连接的光学纤维检测在利用TaqManTM方法进行的量化试验期间产生的荧光的增多，所述摄像机实时检测PCR期间释放的荧光基团发出的信号。通过测定来自扩增产物的信号达到由控制器确定的一定阈值时的周期而推导出定量的数据。几个研究阐明了，周期数与初始物质的量成正比(Gibson，Heid等，1996；Heid，Stevens等，1996；Williams，Giles等，1998)。在人类保健、农业营养领域和质量控制中，这种设备的潜在应用数量是可观的。遗憾的是，目前市售的ABI Prism 7700TM和几种其它的竞争性设备极其昂贵。此外，它们只能由训练有素的操作人员使用。实际上，这样的设备仅仅用于某些高度专业化领域。
所以，需要一种核酸扩增系统，如果需要的话实时检测，它没有上述现有技术的缺点。
本发明旨在提供这种系统，它能大为减少对很多靶序列实施扩增方法所需的操作次数，结果减少了该操作所需的时间。
本发明还提供了这种系统，它将容器之间污染的危险性减到最小。
本发明进一步提供了这种系统，它减小了应用的反应物的体积，于是减小了涉及的费用。
本发明更进一步提供了这种系统，它优化容器内均匀的体积分布和PCR所需的反应物浓度。
本发明还进一步为所有潜在用户(特别是为医院、药物分析实验室、农业营养实业家和健康控制实验室)提供了一种装置，该装置容易使用和维护，用于日常进行实时量化核酸扩增。
本申请中应用的一些术语具有下列含义●“核酸扩增反应”表示本领域已知的用于扩增核酸的任意方法。值得一提的非限制性实例有PCR(聚合酶链反应)、TMA(转录介导的扩增)、NASBA(基于核酸序列的扩增)、3SR(自动维持序列复制)、SDA(链置换扩增)和LCR(连接酶链反应)。
初始扩增模板可以是任意类别的核酸、DNA或RNA、基因组的、质粒、重组体、cDNA、mRNA、核糖体RNA、病毒DNA等。当初始模板是RNA时，通常进行初始逆转录步骤而产生DNA模板。在文中一般将不提及该步骤，因为技术人员会确切地知道何时和如何进行它。显然，本发明的装置可用于扩增和可能特异性地量化RNA序列和DNA序列。在本文其它部分，术语“PCR”就将是用于既表示PCR本身又表示RT-PCR(逆转录-聚合酶链反应)的通用术语。
●上文引述的一些扩增反应是等温的。其它反应，特别是PCR和LCR，需要在不同时间以循环方式将反应混合物加热到不同温度。这样的反应被称为“热依赖性核酸扩增反应”。在本文其它部分，将主要参照它对PCR的应用描述本发明的装置。但是，显然该装置不限于这种技术，它还可用于任何核酸扩增反应或者甚至用于其它酶促反应和/或分子生物反应。该装置特别适合要求小体积的反应，其中，在多个温度下循环反应混合物，从下文的描述将会明白。
●本发明的目的之一是提供一种新装置以进行定量扩增反应，即，能测定反应混合物中初始存在的靶序列浓度的反应。已经描述了几类定量扩增反应。可区分基于外标的应用的定量扩增、利用内标的竞争性扩增和动态扩增，上文已描述了它们的原理，它包括实时测定靶序列量的增大。这类扩增将被称为“(核酸的)动态扩增”、“动态PCR”、“(核酸的)实时定量扩增”或“实时PCR”。有时省去括号中的术语。
●在本申请中，术语“反应物”在其广义上应认为表示用于扩增反应本身的或用于它的检测所需的任何成分。按该定义，盐、dNTPs、引物和聚合酶都是PCR所需的反应物。同样，荧光报道基因或探针在这里也可认为是参与扩增产物的检测的反应物，尽管它们在字面意义上不起作用。
在下文对本发明的详细描述中将描述表示本发明的装置某些元件的其它术语。
附图中示出了本发明装置的某些元件，附图阐释了本发明的几个非限制性实施方案和变体，其中●

图1示出了本发明装置的一个简化实施方案的侧视图；●图2示出了加热板的顶视图，当块体(21～23)是圆盘的扇区时(图2A)和当它们由环的扇区构成时(图2B)；●图3示出了备有反应室和位移装置的一部分的卡盘(1)的第一个
●图5示出了本发明的卡盘第二个具体实施方案的下部(基板)顶视图，仅仅以说明的方式给出尺寸而绝不是限制性的；●图6示出了沿图5中的线AA的卡盘下部剖面图；●图7示出了图5和6中示出的卡盘的上部(盖)的顶视图；●图8示出了该卡盘上部沿图7中的线BB的剖视图；●图9示出了一个完整的卡盘，它由图5和6中所示的基板(实线)与图7和8中所示的盖(虚线)构成；●图10示出了图9的卡盘的三个实施方案，它们的上方是荧光激发/测量装置(5)；●图11示出了长方形卡盘和适用该卡盘的两个样式。图11A示出了一种卡盘(1)，它包括8个小储器(111～118)和40个反应室。只示出了与小储器111连接的五条通道，以及相应的反应室(13)。图11B示出了本发明的一个机器，它包括一个长方形卡盘(1)和一块由三个平行的单元(21～23)构成的加热板(2)。在图11C中，单元(22)相对于其它单元偏移了；那么，卡盘就必须沿长方形路径运动而进行PCR循环；●图12示出了具有一个压力降装置的通道(12)的示意图。
在第一方面，本发明涉及一种用来进行需要至少两个不同保温温度的酶促反应和/或分子生物反应的装置，其特征在于，它包括●至少一块板或卡盘(1)，它具有很多反应室(13)和一个储器(11)，所述反应室通过通道(12)与储器连接；●至少一块加热板(2)，它具有至少两个可被加热到至少两个不同温度的不同的区；●用于所述卡盘和所述板之间相对位移的装置(3)，能使反应室的温度循环变化。
所述板的每个区内的温度可能是均一的，或者如果必要的话，温度可能沿梯度变化。
几类分子生物反应要求反应混合物在不同时间经历不同的温度。下列情况就这样，例如，当酶在应用后必须灭活时(例如，限制性核酸酶)，或者为了测试复合体的稳定性。在后一种情况下，可将一种复合体(例如，抗原/抗体复合体，或是受体/配体复合体)置于装置的一个反应室内，在所述复合体中，将一种成分与荧光团偶联，而另一种成分与荧光猝灭剂偶联。然后，给所述板拟定次序而以递增的次序(如果必要的话，呈梯度形式)产生几个温度。然后通过下述方法测试复合体的稳定性，即，将卡盘移动到所述板上，以致反应室的温度逐渐升高，再利用面向反应室的荧光激发/测量装置观测荧光的增强。荧光的增强等于复合体的离解。
本发明的装置特别适合反应室的温度需要循环变化的反应，某些核酸扩增反应的情况就是这样，例如，聚合酶链反应(PCR)的情况或连接酶链反应(LCR)的情况。
具体地说，本发明涉及一种用于靶核酸序列的热依赖性链反应扩增的装置，其特征在于，它包括●至少一个卡盘(1)，它具有很多反应室(13)和一个储器(11)，利用通道(12)将所述反应室与储器连接；●至少一块加热板(2)，它具有至少两个可被加热到至少两个不同温度的不同的区，所述温度相应于所述靶核酸的扩增循环；●用于所述卡盘和所述板之间相对位移的装置(3)，能使反应室的温度循环变化。
本发明的这种系统没有现有技术系统那样复杂，因为链反应扩增循环所需的温度是由不同的恒温区而不是由温度改变的板块提供的。
重要的是要注意，热依赖性链扩增反应要求样品经历至少两个温度。例如，每个PCR循环需要一个在约95℃的阶段而使靶DNA变性，然后在55℃和65℃之间的阶段(取决于探针的Tm)而产生杂交/连接。至于PCR，每个循环通常包括三个阶段，即，在约95℃的变性，它的温度取决于引物Tm的退火，以及通常在72℃进行的伸长。然而，PCR可呈简化的循环进行，其中，退火和伸长是在相同温度下进行的，这样，每个循环只需两个不同温度。
可以想象上述装置的不同变体。在本发明一个优选的变体中，所述系统包括如下特征●将对于待扩增的靶序列有特异性的引物预先分配在反应室(13)中；●储器(11)旨在容纳由待分析的核酸样品和聚合酶链扩增反应所需的除引物以外的反应物构成的流体；●加热板(2)具有可被加热到三个不同温度的三个不同的区，这三个温度相应于聚合酶链反应扩增循环的三个阶段。
在一个优选的变体中，可能从储器将包含待分析的核酸样品和PCR所需反应物的流体分配在很多含有待扩增的靶核酸序列的特异性引物的反应室内，从而利用包括所述反应室的卡盘和所述加热板之间的相对运动通过连续地使反应室中的内含物依次经历不同温度(即，变性、退火和伸长所需的那些温度)很多次而引起扩增过程，所述加热板具有可被加热到不同温度的两个或三个不同区。
如果必要的话，反应室(13)可含有实时PCR反应所需的除上述引物以外的反应物。在本发明装置的一个优选实施方案中，反应室除了含有引物以外，还含有一种或多种对于待扩增的序列有特异性的探针。探针在反应室中的分布还可以是这样的，即，一些反应室含有对于待扩增的序列有特异性的探针，而其它反应室则含有对比探针，它们事前不识别待扩增的序列。这些探针可被标记，而且如果很多探针存在于同一个反应室内(例如，一种对于待扩增的序列有特异性的探针和一种对比探针)，将优选用不同的荧光团标记这些探针。
在本装置又一个变体中，最初将补充反应物(例如，dNTPs或盐)沉积在反应室内。这些反应物后来将不存在于或以更低的量存在于储器(11)内沉积的流体中。在一个极端的情况下，将PCR反应所需的全部反应物(模板除外)沉积在反应室(13)内，那么，储器(11)中沉积的流体就仅仅包含待扩增的DNA(或RNA)样品。
上述变体都假定很多反应平行进行，同一个样品上具有不同的引物和/或探针。然后，它涉及按几条准则表征唯一的样品(或者如果储器被分成几个小储器，就有几个样品)。反之，一些用途需要按一条准则或较少的几条准则表征许多样品。例如，在研究中，当需要对噬菌体或细菌的文库筛选给定基因的存在时，情况就是这样。在该情况下，需要从给定的引物对开始对大量样品进行PCR。本发明的装置还适合这类操作。为此，将样品沉积在反应室(13)内。可将引物与PCR所需的其它反应物一起导入储器(11)内沉积的流体中。显然，这种结构不排除这一事实，即，除待分析的样品以外的某些反应物可预先沉积在反应室(13)内。
不论所述装置的选定变体如何，也不论反应室(13)内沉积的反应物如何，都可以简单地通过沉积一种液体、接着干燥而有利地沉积它们。流体从储器(11)到达就能溶解这些反应物。作为将要渗入每个反应室(13)的流体体积的函数计算每种沉积反应物的量，于是，溶解这些反应物产生每个室的最终所需浓度。如上所述的卡盘也构成本发明的一个组成部分，其中，至少一部分反应室(13)含有通过先沉积一种液体接着干燥而装载在其中的反应物，于是，这些反应物被反应室内到来的流体溶解。
上述装置具有同时灌注全部反应室的优点，它缩短了制备时间并减小了从一个室到另一个室的污染危害。这种装置还具有能小型化这一优点，而且意味着可利用比现有技术常规量更少量的反应物。
最后，还可注意到，由于建议特殊的加热板，本发明可加速PCR循环，因为不是像现有技术中那样通过改变加热板或气氛的温度来进行不同的阶段(变性、退火、伸长)，卡盘和板之间的相对运动能使每个反应室的内含物迅速而依序地经历这些阶段的三个不同温度。低反应体积的应用，以及卡盘(1)薄底板的应用，还可限制反应室内的热惯性，从而促使反应迅速进行。
本发明还涉及用于实时测定的靶核酸序列的热依赖性扩增的装置，其特征在于，它包括与上述任一装置中那样相同的元件，还包括光学荧光激发/测量装置(5)，该激发/测量装置被放置以便激发和测量每次循环时反应室的内含物的荧光。
上述装置的一个特别原始的元件是被称为板或反应卡盘(1)的元件。该元件可被再循环，或者优选是一次性使用的，这样就构成本发明的又一方面。本发明还提供了一种反应卡盘，它包括很多反应室(13)和至少一个储器(11)，并且具有下列特征●通过一条通道(12)将每个反应室与所述储器连接，所述通道具有包含于直径小于3mm的环中的横截面；●所述储器的容量小于10ml；●反应室和通道相对于储器的布置使流体从储器均匀地分配入反应室。
优选选定所述通道的直径以便足够小而不让所述储器中存在的流体在重力作用下分配到反应室，并且防止不可重复的灌注反应室。该直径优选约0.2mm或更小。关于该直径，应注意，通道的横截面优选呈环形，不过它也可能呈任何其它形状，特别是多边形，而通道的“直径”将表示最大横截面尺寸。
旨在容纳核酸样品和PCR所需反应物的储器可采用各种容量，例如，在约0.1ml～约1ml范围内。
所述卡盘优选包括约20～约500个反应室，更优选60～100个反应室。
这些反应室的体积取决于实施方案。有利的是，这些反应室的体积在约0.2μl～50μl范围内，优选在1μl～10μl范围内。
在本发明的卡盘中，通道(12)和储器(11)之间的连接优选在储器的周边产生，而所述储器的基体倾斜和/或凸出，以便保证含于储器内的流体分配到通道的入口。
应注意，本发明的卡盘可具有多种形状。然而，在本发明一个优选的变体中，这种卡盘呈环形，于是，所述储器就大致位于卡盘的中央，反应室分布于储器周围的环，而连接储器与反应室的通道基本呈辐射状。这样的结构可最恰当地从中央储器灌注反应室。
在具有一个环形卡盘的具体实施方案中，储器(11)的基体呈圆锥形。
再次优选的是，将所述反应室装备在所述卡盘的相对周边。可能优化可被安装在卡盘内并从中央储器灌注的反应室的数量。
在本发明一个变体中，这种卡盘包括与反应室同样多的通道。然而，在某些实施方案中，通道的截面可为一个以上反应室所共有。
本发明的一个优点在于，本装置可容易小型化。所以，有利的是，当卡盘具有旋转体的几何结构时，它的直径优选在约1～10cm范围内。
备选地，本发明的卡盘可具有平移几何结构，其中，储器(11)位于所述卡盘的一侧，反应室(13)排列在该卡盘的另一侧，而连接储器与所述室的通道(12)大致彼此平行。那么，这种卡盘的总体形状基本上是长方形，不考虑旨在连接卡盘和能引起它移动的装置的某些凸出部分和/或凹陷部分。这种卡盘的一个实例如图11A中所示。在这种卡盘的情况下，储器(11)的底部优选是倾斜的平面，它导引反应流体流向通道(12)的入口。
在上述本发明的卡盘的一个变体中，不论它们的几何形状如何，储器(11)被分成2～20个、优选2～8个小储器，以便在同一个卡盘上同时分析几个样品。在该情况下，由通道(12)将每个反应室(13)只与这些小储器中的一个连接。该变体的一个实例如图11A中所示。该图中示出的卡盘包括八个编号为111至118的小储器，小储器的每一个都由五条通道(12)连接到五个反应室(13)。在该图中，只示出了连接到小储器111的通道。重要的是要注意，在本文中，术语“储器(11)”既表示整体储器(11)又表示小储器。
反应室的深度(与通道相比)还可随本发明实施方案的不同而变化。在一个优选的变体中，这些室的深度在约0.5mm～1.5mm范围内。
还应注意，卡盘的厚度取决于几个因素，特别是取决于它的构成材料。实际上，该卡盘优选由塑料构成，该塑料优选是聚碳酸酯，它具有适合本发明的物理性质、光学性质和热性能。本发明的卡盘厚度优选在0.5～5mm范围内。
为了便利反应室内含物和所述板之间的热交换，它的“底板”优选尽可能薄。它的厚度取决于用来生产卡盘的材料。优选的是，它在0.05～0.5mm范围内，例如，约0.25mm。
本发明的卡盘的反应室优选由透明的上壁(17)封闭，例如透明的塑料，从而能使在GMP条件下激发和测量反应流体的荧光。
在本发明一个特定的实施方案中，所述室备有排气道(敞开体系)，使从储器灌注流体时室内所含的空气逸出。
在上述情况下，如果所述室(13)备有排气道(14)，通道(12)优选由具有不同直径的至少两部分(121和122)构成，第二部分(122)的直径小于第一部分(121)的直径，从而在通道(12)内产生压力降。如果一条通道在压力作用下比另一条灌注更迅速，在灌注第一部分(121)时，压力降作用将阻止流体在通道中前进，直到全部通道以相同方式被充满。这就使每条通道的体积被“预校准”以保证不同反应室的均匀灌注。通道的第二部分(122)可以例如由玻璃毛细管构成，它的直径比第一部分(121)的直径小得多，所述毛细管被包含于塑料卡盘内。
还可能提供槽(15)，反应室排气道(14)通向该槽。这些槽具有朝向卡盘外部(敞开体系)的开口(16)并且具有这样的优点首先，无污染的回收任何可能经由排气道(14)而离开反应室的过剩流体，以及其次，它们可在灌注反应室后被封闭。可以例如利用粘合带封闭它们，从而产生一个封闭体系以进行扩增本身。这样可避免或至少限制含于卡盘(1)中的流体蒸发。在实施例3中描述了、而且在图11A和12中阐释了该实施方案。
备选地，从下述这一点考虑可利用封闭体系方案，即，如下所述，灌注反应室，引起卡盘中的负压，接着恢复压力。反应室没有除通道入口(12)以外的开口(“封闭的”反应室)的卡盘也包括于本发明的范围内。
以敞开体系提供使用的或者以封闭体系提供使用的上述卡盘，优选包括一个开口，它适合用于调节储器(11)中压力的装置(4)，以便向反应室排放储器中存在的流体。
本发明还涉及一种灌注如上一段所述封闭体系中的卡盘(1)的反应室(13)的方法，其中，所述卡盘的反应室是封闭的，所述方法包括下列步骤
●将一种流体至少部分地注入储器(11)；●将卡盘(1)与用于调节压力的装置(4)连接；●在卡盘内应用负压，然后恢复压力。
在本发明卡盘的一个变体中，对每一条通道(12)在它与储器(11)的连接处提供一个抗回流腔(123)，所述抗回流腔由直径大于或等于通道(12)直径的大致垂直的通道部分构成。这种变体具有两个主要优点。首先，这些抗回流腔可防止流体偶然回流到储器(11)的情况下、或者在并不是全部流体注入所述通道的情况下的交叉污染。此外，这些能使本发明的装置配备一个盖，它的凹部适配这些垂直入口，从而在分配反应流体以后但在扩增反应之前盖住通道。这就使系统作为一个完全封闭的系统操作，于是避免了污染和蒸发的任何危害。然而，重要的是要注意，在如上述那些敞开体系(此时，反应室备有排气道)的情况下，也可利用抗回流腔，以及在储器中利用盖子来封阻储器侧通道的入口。
在本发明的卡盘一个优选的实施方案中，反应室(13)的至少一部分含有寡核苷酸。更优选的是，每个反应室(13)含有两种对于待扩增的核酸序列有特异性的引物，以及任选地一种或多种对所述序列有特异性的标记探针。可以标记这种探针，这样，当它与它的靶序列杂交时，它的信号增强了(SunriseTM体系)，或者以致从它所杂交的链伸长引起信号的减弱或增强(分别是AmpliSensorTM或TaqManTM体系)。反应室中这类探针的存在能使得利用如上述装备了荧光激发/检测装置的本发明装置来进行定量的实时扩增。对比探针，它们对于待扩增的序列不是特异性的，以及以与特异性探针不同的方式标记的，也可被用来检测任何污染。
在上述本发明的实施方案中，此时的反应室包含引物和一种或多种任选的探针，优选选定这些不同的探针和引物以致它们各自的熔点(Tm)接近。具体地说，不同引物的Tm优选在约5℃的范围内。同样，不同的探针将优选具有在约5℃的范围(它可能与引物的范围不同)内的Tm。在该情况下，将选定探针使它们的Tm高于引物的Tm，那么，不同类寡核苷酸Tm之间的差异优选约为5℃。用来进行扩增的杂交温度就相应于最低引物熔点。
除了引物和任选的探针以外，本发明卡盘的反应室(13)还可含有PCR反应所需的或者用来测定扩增的一种或多种其它反应物。实例有，盐，dNTPs，或者SybrGreen类(注册商标)荧光双链DNA报道基因。如上所述，所有这些反应物都有利地通过沉积一种液体随后干燥而沉积在反应室(13)内。
在本发明卡盘的备选实施方案中，卡盘旨在用于按少数判据筛选大量样品。这意味着，卡盘的使用者能轻易将他的样品存放在每一个反应室(13)内。为此，卡盘可以例如具有可移动的盖，当提起时，它可直接通入反应室。这样的卡盘还可被预装料而包含反应室中的扩增和/或检测所需的一种或多种反应物。
显然，上述本发明的装置可包括一个或多个相当于上述任意卡盘的卡盘。
在本发明装置的特定实施方案中(其中卡盘呈环状)，加热板(2)中不同的加热区优选是盘(图2A)或环(图2B)的扇区。借助于用于卡盘(1)和加热板(2)之间相对位移的装置(3)，可将每部分加热到不同温度而相继将反应室的内含物加热到所需的不同温度。为了限制关于卡盘(1)中蒸发和冷凝方面的问题，热板块优选足够宽，以便还加热一部分通道，如图11中所示，例如，在长方形卡盘的范围内。
重要的是要注意，不同加热区的数量可以是两个、三个或更多个。例如，就二-温度PCR来说，该板可具有一个95℃区而使双链核酸变性，以及一个60℃区，用于引物退火和伸长。就三-温度PCR来说，该板可具有一个95℃区(变性)，一个40℃和70℃之间的区(引物退火)和一个72℃区(伸长)。最后，该板可具有三个以上的区，例如，在每次循环给定的时刻暂时阻止反应。板上区的数量还可以是多组两个或三个区，于是，一轮卡盘相应于几次PCR循环。最后，重要的是要注意，有利地选定不同加热区的相对尺寸，使它与在所述区的温度下反应流体所需的保温时间成正比。在图2B中所示的板中，热板块21(变性步骤专用)的表面积是用于杂交步骤和伸长步骤(分别是板块22和23)的热板块的一半。通过选定相对于板上卡盘的旋转速率，使它在150秒内进行360°的一次旋转，达到这样的循环其中，变性需用30秒，杂交需用1分钟，而且伸长需用1分钟。
至于位移装置，应注意，在本发明一个优选的实施方案中，将板(2)固定，而通过位移装置(3)移动卡盘(1)。
然而，在其它实施方案中，可以固定卡盘，可通过位移装置移动加热板。
在本发明一个特别优选的实施方案中，其中，卡盘呈环形，位移装置(3)使所述卡盘和/或所述板旋转。
可在卡盘和加热板之间提供一个传导元件。然而，在本发明一个优选的变体中，所述卡盘与所述加热板直接接触。在该情况下，有利地对所述板提供一个涂层，促进在所述卡盘和所述板之间的位移。这种涂层可以例如是由Teflon(注册商标)构成的。
如前所示，系统的加热板可具有至少两个或三个可被加热到不同温度的区。优选地，该加热板由两块或三块不同的独立热板块构成，这些热板块被连接到为它们的温度编程序的装置。当加热板包括三块热板块(21到23)时，这些热板块的第一块(21)被加热到变性温度，第二块(22)被加热到杂交温度，而第三块(23)则被加热到伸长温度。这样的恒温热板块的应用简化了加热板的生产。
可生产呈很多形式的、用于卡盘相对于加热板相对位移的装置。在一个优选的实施方案中(示于图10)，卡盘(1)的底部具有一个包括一个入孔(182)的中央凸出部分(181)，于是，凸出部分(181)嵌套在加热板(2)中并且将卡盘(1)在通过微型马达(31)驱动的传动器或轴(32)处连接到位移装置(3)。凸出部分(181)的作用是设定卡盘相对于板(2)的位置，例如图2B中所示，并且保证它与移动装置(3)的连接。
在一个备选的实施方案中，如图1和3中所示，卡盘具有至少一个挂耳(183)，位移装置(3)包括至少一条与所述挂耳协同操作而以旋转运动方式移动所述卡盘的轴(32)。
加热板和卡盘之间的相对位移方式可随实施方案而变。它可能包括以连续速率或间断地位移。位移速率可以是恒定的，或者它可能随时间而变。
在长方形卡盘的情况下，如实施例3中所述和如图11中所示，优选通过平移使卡盘相对于板(2)移动。
有利的是，本发明的系统还包括装备在例如所述卡盘的上方或侧部的光学荧光激发/测量装置。在本发明一个优选的变体中，这些装置将构成一个单一的固定体系。本发明的一个优选变体(其中，卡盘呈环形并且以旋转方式运动)的一个优点在于，它可使每个反应室依次位于光学系统的下方，于是减小了它的复杂性。位于卡盘(1)上的一个测量系统，例如能测定哪一个反应室位于所述光学系统对面。
可生产呈不同形式的、对所述反应室提供所述储器内存在的流体的装置。如上所述，可能区别两类将流体分配到反应室的方式敞开体系分配，它表现为储器内压力的增大和反应室内存在排气道(14)的形式，以及封闭体系分配，它始于在卡盘(1)内形成负压，接着恢复压力。
对反应室提供流体的装置(4)随选定的实施方案而不同。在敞开体系中，在压力下使含于储器中的流体分配到反应室而以均匀的方式灌注反应室。在该情况下，供应装置(4)优选包括一个活塞部件(41)，它具有一定的穿入储器的速率，它适合于促进反应室的准确灌注。这些供应装置也可包括一个连接的泵，为的是增大储器(11)中的压力。
如上所述，本发明一个进一步优选的变体涉及在封闭体系中操作。于是，按下列方法将含于储器中的流体分配入反应室首先，在卡盘内形成负压，如果必要的话，利用一个活塞部件或泵(42)，此时连接以便减小卡盘(1)内的压力。然后恢复压力而使流体进入所述通道并灌注周边反应室。
本发明还涉及利用上述系统来扩增核酸的任意方法，其特征在于，它包括下列步骤●在储器(11)中至少部分地注入一种流体，所述流体含有待分析的核酸样品和扩增反应所需的、除引物以外的全部反应物，以及任选的一种荧光插入剂；●在卡盘(1)中配备的反应室(13)内分配所述流体，所述反应室内分配有引物和任选的一种或多种对靶核酸序列有特异性的标记探针；●利用用于卡盘和加热板之间相对位移的装置按所需次数使每个反应室中的内含物依次达到由所述加热板的两个、三个或更多个区限定的温度。
在上述操作工艺的一个变体中，用于扩增反应和/或检测扩增产物所需的反应物(不同于引物和探针)被预先分配入卡盘(1)的反应室(13)内。导入储器(11)中的流体就不含那些反应物。
可这样进行在反应室(13)内分配流体的步骤在卡盘内部应用负压，然后恢复压力(封闭体系)；或者增大储器(11)内的压力，条件是反应室都备有排气道(敞开体系)。
从如下一些在附图中阐释的非限制性实施方案将更好地理解本发明及其各个优点。实施例1本发明装置的简化实施方案图1中示出的用于检测和量化靶核酸序列的系统包括一个2mm厚、直径为5cm的塑料材料环形卡盘。卡盘(1)备有一个中央储器(11)，参照图3和4将更详细描述该卡盘。在该实施方案中，储器的容量是400μl。它的底板是平的，但应注意在其它实施方案中，它可能呈拱曲状而有利于流体进入反应室但不形成气泡，特别是在分配结束、当储器几乎是空的时。
该系统还包括一块与卡盘(1)的下表面直接接触的加热板(2)和用于相对于加热板(2)移动卡盘(1)的装置(3)。这些位移装置包括一个微型马达(31)，该马达被连接到与卡盘(1)上的两个挂耳(183)协同操作的两条轴(32)上而使它呈转动方式在加热板(2)上运动，而加热板(2)保持静止。
所述系统还包括一个与所述储器(11)协同操作的活塞(41)以及位于卡盘(1)和加热板(2)上方的固定光学荧光激发/测量装置(5)(以给定的程序可控波长激发的发射源和一个发射的荧光的接受器)。
在图2A中可见，加热板(2)由三块呈圆盘的扇区形式的金属块(21、22、23)(下文称为热板块)构成。这里应注意，在该实施方案中，这些热板块具有基本相同的尺寸，但在其它实施方案中，它们可能具有不同尺寸，“尺寸”表示从上方观察它的角度大小。每块热板块(21、22、23)被设计成能被加热到相应于扩增循环(PCR)的阶段(变性、引物退火或伸长)之一的、恒定的程序可控温度，即，总的说来，分别是关于变性是94℃，关于伸长是72℃，以及关于引物退火在30～40℃和65～70℃之间，它取决于应用的引物的Tm(杂交温度)。可利用本领域已知的任意方法来控制热板块的温度。
参照图3，卡盘(1)配备了一个容量为400μl的中央储器(11)，通过在卡盘整个周边均匀分布的、相同数量的通道(12)将储器(11)与36个反应室(13)连接(图3中仅仅示出了几条通道和几个反应室)。这些反应室(13)备有在卡盘(1)的边沿开口的排气道(14)。在该实施方案中，通道直径是0.2mm，而反应室的容积是2.5微升。在其它实施方案中，上述直径和容积当然可以不同。
如前所述，该卡盘(1)还备有两个挂耳(183)，每个都被钻孔而让连接到微型马达(31)的轴(32)穿过。
在图4中，反应室深度是1mm。它们的底板约0.2mm厚。这足够薄而便利反应室(13)与热板块(21、22和23)之间良好的热交换。反应室(13)的上部通过透明的壁(17)封闭，所述壁也构成储器(11)的壁。
按下述方法使用阐述的装置中央储器(11)旨在容纳待分析的核酸样品与扩增反应所需的全部组分，以及任选地，一种荧光核酸报道基因(该总体被称为流体)，但被预先沉积在每个周边反应室(10)内的引物除外。
在本实施方案中，操作者将90μl(即，36×2.5μl)流体(包含75ng核酸)置于中央储器内。所述流体中的反应物浓度如下dNTPs 200μMTaq缓冲剂 1×MgCl2 1.5mMTaq4USybrGreen(注册商标)1×H2O qsp每个室(10)(关于负对比的几个除外)含有两种对于待扩增的靶序列有特异性的引物，以及任选地，一种或多种标记探针，能使进行特定的后续荧光测量。在该实施方案中，已经将10ng每种引物存放在除起负对比作用的室以外的每个室内。
用所述流体部分地灌注储器(11)以后，其中，流体的体积等于所述室的体积总和(一个室的体积被定义为“底板”的表面积乘以它的深度的积)，驱动活塞(41)而将流体分配在很多反应室(13)中。该活塞能增大储器(11)中的压力而使流体进入通向反应室的通道。活塞在储器中的位移速率约为每秒1mm，而且所述位移停止在一定的水平，它取决于待分配到反应室的流体体积。
通道(12)的小直径防止流体在重力作用下(在此标度下，通常可忽视的作用过程(例如毛细力)变得重要，而且在该情况下，毛细力足以将流体保留在储器内)从储器(11)扩散到通道(12)和反应室(13)。由于存在排气道(14)，室(13)中存在的空气被排出，这就保证对反应室的灌注。
热板块(21、22、23)被加热到三个温度，它们相应于PCR阶段的三个温度(或者加热到稍微更高的温度以补偿加热板(2)和卡盘(1)之间的任何热损耗)，并且促动位移装置(3)而移动卡盘(1)，引起每个反应室依次在三个热板块上通过达所需的次数。
更具体地说，将板块(21)加热到相应于变性阶段的温度(94℃)，热板块(22)被加热到相应于退火阶段的温度(36℃)，而热板块(23)被加热到相应于伸长阶段的温度(72℃)。
在该实施方案中，用于位移装置(3)的微型马达(31)被设计为引起卡盘(1)每2.5秒旋转10度(即，在1.5分钟内一次PCR循环)。然而，在其它实施方案中，该运动可在不同速率下进行，而且可以是连续的而不是间歇的。
应注意，在加热到相应于伸长温度的温度的相应板块23上方(更具体地说，处于相应于伸长阶段结束时的位置)装备了光学装置(5)。显然，光学装置(5)可处于不同位置，主要是随应用的化学品而选定的。例如，应用TaqMan化学品或非特异性荧光，合理的是如上所述在伸长阶段结束时进行测量。反之，Molecular BeaconsTM类化学品的应用意味着，测量应当在退火阶段进行。
该系统能迅速而且以可再现的方式灌注大量反应室，并且使反应室的内含物经历PCR；它还能对每次PCR循环进行荧光测量。
上述实施方案不想限制本发明的范围。所以，可对它进行一些修饰而不偏离本发明的范围。实施例2改良的环形卡盘图5～10示出了对实施例1的卡盘进行某些改进的环形卡盘的一个实例。
该卡盘供封闭系统中使用，即，反应室(13)没有除通道(12)的入口以外的其它开口。卡盘由彼此套合的两个元件构成下方部分或基底，示于图5和6中，以及上方部分或盖，示于图7和8中。两部分的装配图示于图9和10中。
该卡盘是按下述方法装料的操作者将待分析的核酸提取液加入中央储器。将一次性卡盘放入装置中。该后者在卡盘内产生负压(P约等于0.05巴)，例如，应用一个泵(42)。然后恢复压力，它能使流体进入通道而注入周边的反应室。所以，与实施例1的装置相比，不再通过增大压力而是通过负压分配流体，它的优点是不需排气道，从而使系统作为封闭体系操作。
如果必要的话，可提供很多小储器而不是一个储器，它的优点是同时处理几个样品。
储器的底部呈锥形而使流体分布在它的周边，即，接近通道的入口。
在通道和储器之间的连接处提供一个由垂直通道部分(123)构成的抗回流系统，它首先防止流体偶尔流回到中央部分时、或者不是所有的流体都进入通道时的交叉污染，再者，一旦分配完毕但在PCR以前，可通过一个盖子(它的凹部与这些垂直入口配合)封阻通道而使操作作为封闭体系进行(没有污染，也没有蒸发)。
卡盘是塑料的(优选是聚碳酸酯)，因为该聚合物具有有利的物理性质和光学性质以及有利的热性能。
所述通道尺寸例如是，0.4×0.2mm(半月形)横截面。
所述一次性卡盘例如是，直径100mm，具有80个室和1～8个小室。
如图10中所示，卡盘(1)的底部具有一个包括凹口(182)的中央凸出部分(181)，于是，凸出部分(181)嵌入加热板(2)，并且将卡盘(1)在由微型马达(31)驱动的传动器或轴(32)处与位移装置(3)相连。凸出部分(181)使卡盘相对于板(2)如图2B中那样放置，并且能保证它与位移装置(3)连接。
在反应室中装载对靶序列特异性的引物和(如果必要的话)TaqManTM型探针或对所述靶有特异性的其它探针。根据应用而定，所述靶将是病毒基因或细菌基因，转基因和需要检测和/或鉴定某些基因修饰的植物的基因组之间的接头等。
利用上述卡盘的一个变体(它包括36个体积为8μl的反应室和直径为0.3mm的通道)进行检测沙门氏菌(Salmonella)的试验。取288μl(即，36×8μl)下列溶液加入中央储器DUTP400μMdNTPs 200μMTaq缓冲剂 1×MgCl2 3mMTaq 15UTWEEN(注册商标) 0.007％SybrGreen(注册商标) 0.1×来自猪霍乱沙门氏菌猪霍乱亚种(Salmonellaenteritidis)的基因组DNA 1ngH2O qsp将1.6皮摩尔由Cohen，Mechanda等(1996)描述的FinA1和FinA2引物存放在反应室中。
该试验产生预期的阳性结果。实施例3长方形卡盘在该实施例中，如图11中所示，储器不再位于中央，而是位于一侧；卡盘的运动不再需要旋转，而是可以平移。
分配和封闭方式可以完全同关于实施例2所述的环形模式描述的那样。
也可通过增大压力来分配流体。它们进入通道的第一部分(121)，其中，体积的总量略低于待分析的样品(核酸提取液)的体积。如图12所示，通道的第二部分(122)由直径小得多的、插入塑料体系中的玻璃毛细管构成。它的优点是产生压力降现象，使通道的第一部分被均匀地灌注(如果随着压力的增大，一条通过灌注比另一条更迅速，该现象就阻止流体在灌注的通道内前进，直至其它通道被注满)。这就使每条通道的体积被“预校准”而保证不同的下游室(13)被均匀灌注。在所述室的端头是通向槽(15)的排气道，这些槽的顶部具有孔，可通过这些孔回收可能经由所述排气道离开的任何多余的流体，并且可利用粘合带封闭所述槽(15)而防止蒸发。所述室的容积(和形状)与通道的第一部分的相同。
通道直径是0.4mm，即，如果通道之间的间距是0.6mm，每mm就有一条通道。所以，8cm长的卡盘含有80个室。
可设想封闭储器处的通道的两种可能性第一种可能性包括，利用如实施例2中那种凹进的盖子。所述增大压力的活塞和所述盖子就是同一个部件。在该情况下，必须在通过压力分配流体的步骤和该封闭步骤之间放松所述活塞，于是，封闭作用不引起压力的另外增大，否则会使流体溢出反应室。
第二种可能性包括，在流体上方沉积(过量的)油。一旦注满所述室，通道(121)就至少部分地被注入油，从而防止污染和蒸发。
参考文献Cohen，H.J.，S.M.Mechanda等，(1996)。“PCR amplification ofthe fimA gene sequence of Salmonella typhimurium，a specificmethod for detection of Salmonella spp”(鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的fimA基因序列的PCR扩增，一种检测沙门氏菌(Salmonella spp)的特异性方法)，Appl.Environ Microbiol62(12)4303～8。Gibson，U.E.，C.A.Heid等，(1996).“A novel method for real-timequantitative RT-PCR”(一种实时量化RT-PCR的新方法)。Genome Res.6(10)995～1001。Heid，C.A.，J.Stevens等，(1996).“Real-time quantitative PCR”(实时量化的PCR)。Genome Res6(10)986～94。Williams，P.M.，T.Giles等，(1998)“Development andapplication of real-time quantitative PCR”(实时量化PCR的开发和应用)。F，Ferrè(编辑)，Gene Quantification(基因定量分析)。Birkhuser.Boston。
权利要求
1.一种反应卡盘，它包括很多反应室(13)和至少一个储器(11)，并且具有下列特征●通过一条通道(12)将每个反应室与所述储器连接，所述通道(12)具有包含于直径小于3mm的环中的横截面；●所述储器的容量小于10ml；●反应室和通道相对于储器的布置使流体从储器均匀地分配入反应室。
2.权利要求1的卡盘，其中，通道(12)的直径是0.2mm或更小。
3.权利要求1或权利要求2的卡盘，其中，储器(11)的容量在0.1ml～1ml范围内。
4.权利要求1～3的卡盘，其特征在于，它包括20～500个反应室。
5.权利要求1～4的卡盘，其特征在于，所述反应室的体积在0.2μl～50μl范围内，优选在1μl～10μl范围内。
6.权利要求1～5的卡盘，其中，通道(12)和储器(11)之间的连接在储器的周边形成，而所述储器的基体是倾斜和/或凸出的，以便保证含于储器内的流体分配到通道的入口。
7.权利要求1～6的卡盘，其特征在于，它具有旋转体的几何结构，其中，储器(11)大致位于所述卡盘的中央，反应室(13)分布在所述储器周围的环，而连接所述储器与所述反应室的通道(12)基本呈辐射状。
8.权利要求7的卡盘，其中，储器(11)的基体呈圆锥形。
9.权利要求7或权利要求8的卡盘，其中，反应室(13)位于所述卡盘的周边。
10.权利要求7～9的卡盘，它的直径在1～10cm范围内。
11.权利要求1～6的卡盘，其特征在于，它具有平移几何结构，其中，储器(11)位于所述卡盘的一侧，反应室(13)排列在该卡盘的另一侧，而连接储器与所述室的通道(12)大致彼此平行。
12.权利要求11的卡盘，其中，储器(11)的基体是倾斜的平面。
13.权利要求1～12任一项的卡盘，其中，储器(11)被分成2～8个小储器(111～118)，而且通过通道(12)将每个反应室(13)只与所述小储器中的一个连接。
14.权利要求1～13任一项的卡盘，其中，反应室的深度在0.5～1.5mm范围内。
15.权利要求1～14任一项的卡盘，其特征在于，它是从塑料原料、优选是聚碳酸酯生产的。
16.权利要求1～15任一项的卡盘，其中，厚度在0.5～5mm范围内。
17.权利要求1～16任一项的卡盘，其中，反应室(13)的底板在0.05～0.5mm厚度范围内，优选约0.25mm厚。
18.权利要求1～17任一项的卡盘，其中，反应室(13)是通过上方的透明壁(17)关闭的。
19.权利要求1～18任一项的卡盘，其中，反应室(13)备有排气道(14)。
20.权利要求1～18任一项的卡盘，其中，反应室(13)被关闭了。
21.权利要求1～20任一项的卡盘，其中，储器(11)包括一个开口，它可适应于用于调节所述储器内的压力的装置(4)。
22.权利要求l～21任一项的卡盘，其中，每条通道(12)由具有不同直径的至少两部分(121和122)构成，第二部分(122)的直径小于第一部分(121)的直径，从而在通道(12)内产生压力降。
23.权利要求1～22任一项的卡盘，其特征在于，每条通道(12)在其与储器(11)的连接处配备了抗回流腔(123)，所述抗回流腔由直径等于或大于通道(12)直径的大致垂直的通道部分构成。
24.权利要求1～23任一项的卡盘，其中，反应室(13)的至少一部分含有寡核苷酸。
25.权利要求1～24任一项的卡盘，其中，每个反应室(13)包含两种对于待扩增的核酸序列有特异性的引物，以及任选地，对所述序列特异性的标记探针。
26.权利要求1～25任一项的卡盘，其中，反应室(13)的至少一部分含有通过沉积液体、接着干燥而加入的一些反应物，于是，所述反应室内流体的到达将所述反应物再次溶解成溶液。
27.一种用于进行需要至少两个不同保温温度的酶促反应和/或分子生物反应的装置，其特征在于，它包括●至少一个卡盘(1)，它具有很多反应室(13)和一个储器(11)，利用通道(12)将所述反应室与储器连接；●至少一块加热板(2)，它具有至少两个可被加热到至少两个不同温度的不同的区；●用于所述卡盘和所述板之间相对位移的装置(3)，能使反应室的温度循环变化。
28.权利要求27的装置，其中，所述酶促反应是核酸序列的热依赖性链扩增，而且其中，加热板(2)的区可被加热到至少两个不同的温度，相应于核酸扩增循环的阶段。
29.权利要求28的装置，其特征在于●将对于待扩增的靶序列有特异性的引物预先分配在反应室(13)中；●储器(11)旨在容纳由待分析的核酸样品和聚合酶链扩增反应所需的除引物之外的反应物构成的流体；●加热板(2)具有可被加热到三个不同温度的三个不同的区，这三个温度相应于聚合酶链反应扩增循环的三个阶段。
30.权利要求28或29的用于核酸序列实时热依赖性链扩增的装置，其特征在于，它包括用于荧光激发/测量的光学装置(5)，该装置被放置以便激发和测量每个循环中反应室内含物的荧光。
31.权利要求27～30任一项的装置，其中，所述卡盘(1)是权利要求1～26任一项的卡盘。
32.权利要求27～31任一项的装置，其中，用于对板(2)加热的不同的区被分配成至少两个或三个圆盘部分。
33.权利要求27～32任一项的装置，其中，将所述加热板(2)固定，而所述卡盘(1)则通过位移装置(3)移动。
34.权利要求27～32任一项的装置，其中，将所述卡盘(1)固定，而所述加热板(2)则通过位移装置(3)移动。
35.权利要求27～34任一项的装置，其中，所述位移装置(3)引起所述卡盘(1)和/或所述加热板(2)旋转。
36.权利要求27～35任一项的装置，其中，卡盘(1)和加热板(2)直接接触。
37.权利要求27～36任一项的装置，其中，所述板(2)具备一个涂层，它促进在所述卡盘(1)和所述板(2)之间的相对位移。
38.权利要求27～37任一项的装置，其中，加热板(2)包括两块或三块不同的热板块(21、22和如果必要的话，23)，这些热板块被连接到为它们的温度编程序的装置。
39.权利要求27～38任一项的装置，其中，卡盘(1)的底部具有一个包括一个凹口(182)的中央凸出部分(181)，而位移装置(3)包括至少一个与所述凹口(182)协同操作的传动器(32)，从而引起所述卡盘(1)以旋转运动方式运动。
40.权利要求27～39任一项的装置，它包括用于荧光激发/测量、位于卡盘上方或侧边的光学装置(5)。
41.权利要求27～40任一项的装置，它进一步包括用于对反应室(13)提供储器(11)内存在的流体的装置(4)。
42.权利要求41的装置，其中，所述供应装置(4)包括一个活塞部件(41)，而所述流体则是通过增大压力对反应室提供的。
43.权利要求41的装置，其中，所述供应装置(4)包括一个泵(41)，而所述流体则是通过在产生负压后恢复压力而对反应室提供的。
44.权利要求43的装置，其中，卡盘(1)的反应室(13)都是封闭的。
45.一种利用权利要求27～44任一项的装置来扩增核酸的方法，它包括下列步骤●在储器(11)中至少部分地注入一种流体，所述流体含有待分析的核酸样品和进行扩增反应所需的除引物以外的组分，以及任选的荧光核酸报道基因；●将所述流体分配到卡盘(1)的反应室内，该反应室中含有引物和任选的一种或多种标记探针；●利用用于卡盘和加热板之间的相对位移的装置(3)按所需次数使每个反应室中的内含物依次达到由所述加热板的两个、三个或更多个区限定的两个、三个或更多个温度。
46.权利要求45的扩增方法，其中，将流体分配入反应室(13)的步骤是通过在卡盘内应用负压、然后恢复压力而进行的。
47.一种用于封闭系统灌注权利要求21的卡盘(1)中的反应室(13)的方法，它包括下列步骤●将一种流体至少部分地注入储器(11)；●将卡盘(1)与用于调节压力的装置(4)连接；●在卡盘内应用负压，然后恢复压力。
全文摘要
本发明涉及一种用于扩增靶核酸的装置，用于该装置的反应卡盘，以及使用该装置的方法。
文档编号B01J19/00GK1458866SQ0181587
公开日2003年11月26日 申请日期2001年7月20日 优先权日2000年7月28日
发明者G·菲斯托克 申请人:基因系统公司