利用小波变换分析核酸扩增曲线的制作方法

专利名称：利用小波变换分析核酸扩增曲线的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析核酸扩增曲线的技术。
背景技术：
核酸分析可用于测序、克隆、基因定位和其它形式的核酸序列分析，或者用于通过 构建包括已知浓度样品的结果的标准曲线来确定样品中的核酸初始浓度。核酸分析可用于 分析包括例如DNA和RNA在内的核酸。核酸分析的类型包括聚合酶链反应(PCR)、转录介导 扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。一般说来，PCR依赖于DNA复制酶在高温下保持稳定的能力。单个PCR循环包括三 个主要步骤变性、退火和延伸。变性期间，在大约94°C下加热液态样品。在此过程期间， 双DNA链“熔”开成单链DNA，且所有的酶促反应均停止。在退火期间，将单链DNA冷却到 M°C。在此温度下，引物结合或“退火”至DNA链的末端。在延伸期间，将样品加热至75°C。 在此温度下，核苷酸添加至引物，并最终形成DNA模板的互补拷贝。PCR分析通常多(例如， 约40)次重复此PCR循环，从而产生大量的复制DNA链。当样品经历多个PCR循环时，实时PCR可以用来检测存在于样品中的核酸的相对 量。例如，样品可以包含当附着于双链DNA时发荧光的标记物。在这个例子中，检测器检测 到的荧光与存在于样品中的双链DNA的数目成比例。因此，随着PCR的进行，荧光增加。

发明内容
—般说来，本发明涉及基于小波变换的实时核酸扩增的新分析方法。也就是说， 描述的是分析核酸扩增数据的技术，可以利用小波变换将所述核酸扩增数据表示为扩增曲 线。小波变换一般将数据集从时域变换到时频域。当应用于其中对多个扩增循环收集强度 数据的实时核酸扩增数据时，小波变换将扩增数据从循环域变换成循环频率域。小波变换 可被用作识别对应于扩增数据生长期内的点的循环的辅助手段，所述点在本文中被称为数 据的Tmax值。例如，小波变换是通常具有复杂时间相关性的扩增曲线的循环-频率表示法。 在进行小波变换后，可以把Tmax值确定为变换的扩增数据内的循环，在此中变换的扩增数据 的一个或多个频率分量具有局部极大量值。可以应用所述技术来确定存在于未知样品内的核酸量。例如，对于相同核酸的多 个已知初始浓度不同的样品，对它们的扩增数据应用小波变换，据此确定的Tmax值可首先用 来构建样品的Tmax值对样品初始核酸浓度的对数的关系的标准曲线。然后可以使用此标准 曲线来确定相同核酸的样品的未知初始浓度。另外，所述标准曲线可用于确定PCR反应的 效率。
在一方面，本发明涉及包括实施核酸样品的PCR分析的方法。所述PCR分析包括 多个PCR循环。所述方法还包括由PCR分析获取扩增数据，所述扩增数据与多个PCR循环 中的每一个当中存在的核酸量成正比。所述方法进一步包括对扩增数据应用小波变换以确 定对应于扩增数据生长期内的点的PCR循环，并根据对应于扩增数据生长期内的点的PCR 循环更新显示。另一方面，本发明涉及一种计算机可读介质，其包含使处理器启动核酸样品的PCR 分析的指令。所述PCR分析包括多个PCR循环。计算机可读介质还包含使处理器由PCR分 析获取扩增数据(所述扩增数据与多个PCR循环中的每一个当中存在的核酸量成正比)并 对扩增数据应用小波变换以确定对应于扩增数据生长期内的点的PCR循环的指令。计算机 可读介质还包含使处理器根据对应于扩增数据生长期内的点的PCR循环更新显示的指令。在又一方面，本发明涉及包括控制模块、分析模块和接口模块的装置。控制模块初 始化核酸样品的PCR分析并接收扩增数据，所述扩增数据与多个PCR循环中的每一个当中 存在的核酸量成正比。分析模块对扩增数据应用小波变换以确定对应于扩增数据生长期内 的点的PCR循环。接口模块根据对应于扩增数据生长期内的点的PCR循环更新显示。附图和下文的具体实施方式
详细描述了本发明的一个或多个实施例。根据本发明 的具体实施方式
和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优点将显而易见。


图1是示出作为例子的PCR分析系统的实施例的方框图。图2是实例核酸样品的PCR扩增曲线。图3是实例核酸稀释物系列的标准曲线。图4是进一步详细地示出作为例子的荧光检测装置的实施例的方框图。图5是示出实例数据分析装置的功能方框图。图6是示出PCR分析系统的实例操作的流程图。图7是示出PCR分析系统的另一实例操作的流程图。图8是示出PCR分析系统的另一实例操作的流程图。图9是示出PCR分析系统实例操作的进一步细节的流程图。图10是示出PCR分析系统实例操作的进一步细节的流程图。图11是通过对核酸扩增数据应用小波变换产生的小波变换数据的实例图像。图12是图10的频率部分的小波变换值对时间平移的图线。图13-22是由数据分析装置提供给用户的实例用户界面画面。图23是包含不同初始cDNA量的多个样品的荧光对循环数目的实例图线。图M示出对于多个cDNA样品利用Haar小波基函数对小波变换的频率部分的峰 进行的抛物线型曲线拟合。图25示出对于多个cDNA样品利用高斯函数的导数对小波变换的频率部分的峰进 行的抛物线型曲线拟合。
具体实施例方式一般说来，本发明涉及利用小波变换分析核酸扩增数据的技术。在一方面，本发明涉及对在核酸分析中收集到的扩增数据应用小波变换。在一些实施例中，所述小波变换包 括连续小波变换(CWT)。在其它实施例中，所述小波变换包括离散小波变换(DWT)。虽然以 下的描述一般是涉及对实时PCR扩增数据应用小波变换，但可以理解的是，本文中所述的 技术可以应用于通过其它核酸分析收集到的数据，例如，基于核酸序列的扩增(NASBA)、转 录介导扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)等。图1是示出PCR分析系统10的示例性实施例的方框图，所述系统包括数据分析装 置11和荧光检测装置12。系统10从至少一个核酸样品中收集PCR扩增数据并利用小波 变换分析扩增数据，从而识别所述样品对应于扩增数据生长期内的点的循环。小波变换一 般将数据集从时域变换到时频域。当应用于其中对多个循环收集强度数据的PCR扩增数据 时，小波变换将扩增数据从循环域变换成循环频率域。在一些实施例中，识别出的循环大致 对应于生长期的开始。在一些扩增曲线分析中，这一循环一般可相当于阈循环(Ct)，但在本 文中被称为Tmax值，表示已经通过应用小波变换识别出所述循环。一般说来，如本文中所述， PCR扩增数据的实时分析可帮助用户确定样品中的核酸初始浓度或PCR反应的效率。数据分析装置11提供具有硬件和软件的操作环境，所述硬件和软件用于控制包 括控制单元19、光学模块16和检测器18的荧光检测装置12的操作以检测样品17中的荧 光染料。具体地讲，用户与数据分析装置11进行交互，从而在控制部件19的控制下启动对 容纳在转盘13的一个或多个小室内的一个或多个样品的核酸分析。作为响应，检测装置12 的光学模块16激发转盘13上的区并聚集由容纳在小室内的染料发射的荧光能量。盘13 安装在转台15上。控制模块19通过接合与转台15相连的电机来控制转台15以受控的速 度旋转盘13。当盘13转动时，光学模块16询问样品17并聚集荧光能量。例如，可以用足以收 集每个PCR循环数据的时间来活化模块16内的激发源。在一个实施例中，用初始大约二秒 的时间活化光学模块16内的激发源以达到稳态，然后是询问时间，持续进行有盘13转动 10-50转那么长。在其它实施例中，激发源可以被活化较短(例如大约1或2毫秒)或较长 的时间。虽然图1中例示的是单个样品17，但盘13可以包含多个容纳样品的小室。光学模 块16可以询问盘13的一些或所有不同的小室。在一个实施例中，盘13包含绕盘13的周 边间隔的96个小室。用具有96个小室的盘，系统10能够获取96个样品的数据，每一样品 包含类似或不同的核酸初始浓度。另外在一些实施例中，系统10能够同时获取包含不同核 酸和/或不同荧光染料的样品的数据。在一个实施例中，光学模块16包括至少一个是廉价高功率发光二极管(LED)的激 发源。LED是市售的，有多种波长，并且具有长久的寿命(例如，100，000小时或更长)。在 另一实施例中，常规的卤素灯泡或汞灯可以被用作激发源。如图1所示，光学模块16可连接至纤维光缆14。纤维光缆14会形成一种柔性装 置，用于收集来自光学模块16的荧光信号而没有灵敏度的损失。在这个例子中，纤维光缆 14将光学模块16连接至检测器18。纤维光缆14携带由光学模块16收集的荧光并有效地 将捕获的光传递至检测器18。在一个实施例中，检测器18是光电倍增管。在其它实施例 中，可以使用一个或多个固态检测器。可以从装置上取下光学模块16，并且可以很容易地与针对在不同波长询问而优化的其它光学模块进行互换。系统10的模块结构使所述装置容易适应用在给定分析环境(如 PCR)的所有荧光染料。在系统10中可以采用的其它化学技术包括hvader (Third Wave, Madison, Wisconsin)、转录介导扩增(GenProbe，San Diego, California)、荧光标记的酶联 免疫吸附测定(ELISA)或荧光原位杂交(FISH)。系统10的模块结构可以提供的另一优点 是，为了选择性地激发和检测PCR分析中的相应染料，可以通过对具体的靶波长范围选择 相应的激发源(未显示)以及激发和检测滤光器(未显示)来优化每一光学模块16的灵 敏度。虽然在图示的实施例中，系统10包括单个光学模块16，但在其它实施例中，系统 可以包括多个光学模块16。例如在一些实施例中，系统10可以包括四个光学模块16，它们 提供用于四种不同染料的光学检测的四个“通道”。能够在实时PCR中检测多个靶物种的系 统10可以被称为多重PCR系统。这四个光学模块各自可以在任何给定的时间激发转盘13 的不同区并收集由染料以不同的波长发射的荧光能量。在包括多个光学模块的实施例中， 可以基本上同时地询问发生在样品17内的多个平行反应。在包括多个光学模块16的其它 实施例中，可以基本上同时地询问发生在盘13的不同小室中的多个不同反应。可以将多个光学模块中的每一个光学连接至形成光纤束的一部分的纤维光缆14。 光纤束可以将光学模块光学连接至单个检测器18或多个检测器。使用单个检测器18可以 是有利的，原因在于其容许使用高度灵敏且可能是昂贵的检测器(例如，光电倍增管)，同 时保持成本最低，因为只需要使用单个检测器。在图1的例子中，样品17容纳在盘13的小室中，所述盘安装在受控制单元19控制 的转台15上。槽型传感器触发器20提供控制单元19和数据分析装置11所使用的输出信 号，用于在盘转动期间用小室位置进行同步数据采集。槽型传感器触发器20可以是机械或 光学传感器。例如，传感器可以是向盘13发送光束的激光器，控制单元19使用传感器检测 通过盘13上的槽的光以确定盘上的小室位置。在其它实施例中，盘13除了槽之外可以包 括凸块、突出部或反射面，或者用这些代替槽。槽传感器触发器20可以使用任何物理结构 或装置来确定盘13转动时的径向位置。光学模块16可以物理地安装在转台15上方。因 此，光学模块16在任一时刻与不同的小室交叠。分析系统10可以还包括加热元件(未显示)，用于调整盘13上的样品17的温度。 在一个实施例中，加热元件可以包括容纳在反射罩内的圆柱形卤素灯泡。反射罩的形状能 将辐射从灯泡聚集到盘13的径向部分上面。一般来说，当盘13旋转时，盘13的受热区域 类似于环。在这一实施例中，反射罩的形状可以是容许精确聚集辐射能量的椭圆和球形几 何形状的组合。在其它实施例中，反射罩可以具有不同的形状，或者灯泡可以广泛地照射较 大的区域。还在其它实施例中，反射罩的形状可以将辐射从灯泡聚集到盘13的单个区域上 面，如容纳样品17的单个处理小室。在一些实施例中，加热元件可以加热空气并强制热空气到达一个或多个样品17 的上面以调整温度。另外，可以通过盘13直接加热样品17。在这种情况下，加热元件可以 位于平台15，并与盘13热连接。通过控制单元19进行控制，加热元件内的电阻可以对盘 13的选定区域进行加热。例如，一个区域可以包含一个或多个小室，并且有可能是全盘13。作为另外的选择或除此之外，系统10可以包括冷却部件(未显示)。系统10中可 以包括风扇以对盘13提供冷空气(例如室温空气)。适当地调整样品的温度以及在实验完成后存储样品17时可能需要进行冷却。在其它实施例中，冷却部件可以包括平台15与盘 13之间的热连接，必要时平台15可以降低其温度。例如，一些生物样品可以储存在4摄氏 度下以降低酶活性或蛋白质变性。关于可用来实施本发明的示例性装置的更详细的资料可见于例如美国专利申 请公开 No. 2006-0223172(题为 “MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE HAVING FIBER BUNDLE COUPLING MULTIPLE OPTICAL MODULES TO A COMMON DETECTOR”)、美国专 利 No. 7，507，575 (题为 “MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE HAVING REMOVABLE OPTICAL MODULES”)、美国专利申请公开 No. 2007-0009382 (题为 “HEATING ELEMENT FOR A ROTATING MULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE”)、美国专利申请公开 No. 2007-0009383(题为“VALVE CONTROL SYSTEM FOR A ROTATINGMULTIPLEX FLUORESCENCE DETECTION DEVICE”)和美国专利申请公开 No. 2007-001007 (题为 “SAMPLE PROCESSING DEVICEC0MPRESSI0N SYSTEMS AND METHODS”)。这些公开内容均全文以引用的方式并入本 文。对于实时PCR，可以使用荧光来测量利用三种常规技术之一的PCR分析期 期间的扩增量。第一种技术是使用经与双链DNA结合后荧光增加的染料，如Sybr· Green (Molecular Probes, Eugene, Oregon) 第二种技术使用荧光标记的探针(杂交探针、 发夹式探针等)，当与扩增的靶序列结合时，其荧光产生变化。这种技术类似于使用双链 DNA结合染料，但更具有特异性，因为探针只与靶序列的某个部分结合。第三种技术是使用 水解探针(Taqman ，Applied BioSystems, Foster City，California)，其中在 PCR 循环的 延伸阶段期间，聚合酶的核酸外切酶活性酶切探针上的猝灭剂分子，使其具有荧光活性。在每一种方式中，荧光量大致线性正比于扩增的核酸浓度。数据分析装置11测量 在每个PCR循环(或者任选地在PCR循环后通过控制单元19进行取样、缓冲和传递)期间 从检测器18输出的信号，从而以近实时的方式观察扩增。在一些实施例中，控制单元19或 数据分析装置11可以在一段PCR循环上对检测器18的输出信号进行积分，从而对每个PCR 循环产生单个荧光值。在其它实施例中，数据分析装置11可以对每个PCR循环测量和保留 指示检测器18的荧光的多个输出信号。数据分析装置11对每个PCR循环存储代表输出信 号的数据，作为矩阵或表格格式的扩增数据，其中，举例来说，一行的每一列存储循环数目， 第二行的同一列存储相关的荧光强度。数据分析装置11还可以对单个PCR分析期的多个PCR循环将检测器18的数据 转换成扩增曲线，如图2中所示的扩增曲线20。对于典型的PCR分析期，扩增曲线20代表 对多个PCR循环中的每一个通过荧光检测到的样品的扩增。扩增曲线20可以包括对多个 PCR循环中的每一个的单个荧光强度值。以曲线与数据拟合。曲线拟合可以采用例如线性 回归，或者可以简单地用平滑或非平滑线连接相邻循环的荧光数据。在其它实施例中，扩增 曲线20对多个PCR循环中的每一个可以包括不止一个荧光强度值。对单个PCR分析期的 扩增曲线一般可分为大致三个区基线期22、生长期M和平台期26。根据本文中所述的技术，数据分析装置11可以对扩增数据或扩增曲线20应用小 波变换，用以沿扩增曲线确定本文中称为Tmax值的点，其是对应于扩增数据或扩增曲线20 的生长期对内的点的PCR循环。具体来说，扩增数据或扩增曲线20的小波变换产生扩增 曲线20的循环-频率表示法，它一般具有复杂的循环依赖性。进行小波变换后，数据分析装置11识别出Tmax值作为变换的扩增数据内的循环值，在此中变换的扩增数据的一个或多 个频率分量具有最大的量值。也就是说，数据分析装置11对扩增数据应用小波变换，从而 将扩增数据分解成一系列基函数(即小波)。这样可容许分析扩增数据，以便识别较大量 值的频率分量，同时保持分量的循环关系。因而，数据分析装置11能够对变换的扩增数据 内的一个或多个频率部分识别具有最大局部小波量值的循环，并将其同与扩增数据相关的 PCR分析期的Tmax值相关联。然后数据分析装置11可以根据Tmax值更新显示。当系统10对包含不同的已知核酸初始浓度的多个样品进行PCR时，数据分析装 置11可以产生图线28，其包括样品的Tmax对初始DNA浓度(DNAtl)的对数的关系的标准 曲线29，如图3所示。标准曲线四可以包括利用线性回归或别的曲线拟合技术对多个 (In(DNAtl)，Tmax)数据点的拟合线。数据分析装置11随后可以使用标准曲线四或代表标准 曲线四的方程对具有未知核酸初始浓度的核酸样品的初始浓度进行定量。例如，装置11 可以对具有未知核酸初始浓度的样品确定Tmax值。然后装置11可以在对应于Tmax值的点沿 标准曲线四作Tmax值图，或者可以将Tmax值代入标准曲线四的方程，从而确定样品中的核 酸初始浓度。数据分析装置11还可以使用标准曲线四确定PCR反应的效率，进一步详细 描述如下。图4是作为例子的荧光检测装置12的实施例的功能方框图。具体地讲，图4表示 装置部件之间的电连接以及光通过部件的一般路径。在图4的例子中，装置12包括至少一 个处理器344或其它逻辑控制单元、存储器346、盘式电机348、光源330、激发滤光器334、 透镜338、检测滤光器340、聚光透镜342、检测器18、槽传感器触发器27、通信接口 350、加 热元件354、激光器355和电源352。如图4所示，透镜338和聚光透镜342不必与别的部 件电连接。另外，光源330、滤光器334和340、透镜338和聚光透镜342代表了一个光学模 块16。装置12可以包含另外的光学模块16，如前面所述，虽然在图4中没有显示。在这种 情况下，每个增加的光学模块可以包括基本上与图4中所示类似设置的部件。光按一定的路径通过图4中的若干部件。光线一旦由光源330发出，它便进入激 发滤光器334，并且作为离散波长的光离开。然后其穿过透镜338，在那里离开检测装置12， 并激发处理小室(未显示)内的样品17。样品17通过发不同波长的荧光作出反应，此时光 线进入透镜338并由检测滤光器340滤光。滤光器340除去样品17中波长在所需荧光之 外的背景光。其余的光在被检测器18检测之前通过聚光透镜342送进纤维光缆14。随后 检测器18将收到的光信号放大。处理器；344、存储器346和通信接口 350可属于控制单元19。处理器；344控制盘式 电机348转动，或者根据需要旋转盘13，从而收集荧光信息或通过盘13移动流体。处理器 344可使用从槽传感器触发器20收到的盘位置信息来识别转动期间盘13上的小室位置，并 同步获取从盘13上收到的荧光数据。处理器344还可以控制光学模块16内的光源330何时开和关。在一些实施例中， 处理器344控制激发滤光器334和检测滤光器340。根据被照射的样品情况，处理器344可 以更改滤光器以使不同波长的激发光到达样品或者使不同波长的荧光到达聚光透镜342。 在一些实施例中，可以为特定的光学模块16的光源330优化一方或两方的滤光器，并且不 可由处理器344进行更改。聚光透镜342连接于纤维光缆14，后者提供光从聚光透镜342到检测器18的光路。处理器344可以控制检测器18的操作。虽然检测器18可以不断地检测着所有的光， 但许多实施例中应用其它的获取模式。处理器344可以确定检测器18何时收集数据，并且 可以对检测器18的其它配置参数进行编程设定。在一个实施例中，检测器18是从聚光透 镜342提供的光中捕捉荧光的光电倍增管。作为响应，检测器18产生代表收到的光的输出 信号343(例如模拟输出信号)。虽然图3中未显示，但在包括多个光学模块的实施例中，检 测器18可同时接收来自装置12的其它光学模块16的光。在这种情况下，输出信号343是 由检测器18从各光学模块16收到的光输入的组合的电学表示。处理器344还可以控制来自装置12的数据流。可以把数据(如，自检测器18取 样的荧光、来自加热元件3M及相关传感器的样品温度和盘转动信息)存储到存储器346 里面用于分析。处理器344可以包括任何一个或多个微处理器、数字信号处理器(DSP)、专 用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)或其它数字逻辑电路。此外，处理器344提 供存储在计算机可读介质(如存储器346)上的用于固件、软件或其组合的操作环境。存储器346可以包括一个或多个用于存储多种信息的存储器。例如，一个存储器 可以包含具体的配置参数、可执行指令，一个存储器可以包含收集的数据。因此，处理器344 可以使用存储在存储器346中的数据控制装置的操作和校准。存储器346可以包括任何 一个或多个随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、电可擦除可编程ROM (EEPROM)、闪存等。处理器344可另外地控制加热元件354。基于包含在存储器346内的指令，可以选 择性地驱动加热元件354，从而根据所需的加热曲线控制一个或多个小室的温度。一般来 说，当盘旋转时，加热元件加热盘13的一个径向部分。加热元件3M可以包括卤素灯泡和 用于将热能聚集到盘13的特定区域上的反射器。在其它实施例中，加热元件3M可以顺序 地加热一个或多个小室。这种实施例要求盘13不动而加热小室。在任何实施例中，加热元 件354能够根据需要极其快速地开启和关闭。处理器344利用通信接口 350与数据分析装置11进行通讯。通信接口 350可以用 单一方法或组合方法传输数据。一些方法可以包括通用串行总线(USB)端口或IEEE 1394 端口，用于以高数据传输速率进行硬线连接。在一些实施例中，可以把存储装置直接连接至 这些端口中的一个，以便进行用于后处理的数据存储。可以通过处理器344对数据进行预 处理以备查看，或者可能需要在可以开始分析之前对原始数据进行完全的处理。还可以通过射频(RF)通信或局域网(LAN)连接来完成与分析装置11的通信。此 外，可以通过直接连接或者通过网络接入点来实现连接，该网络接入点例如是可以支持有 线或无线通信的网络集线器或路由器。例如，检测装置12可以以一定的RF频率发送数据 供目标数据分析装置11接收。此外，检测装置12能够经由网络(如因特网)从远程装置上下载更新的软件、固 件和校准数据。通信接口 350还可以使处理器344能够监视、盘存和报告任何故障。如果 发生操作问题，处理器344能够输出错误信息，从而通过提供操作数据来协助用户进行故 障排除。例如，处理器344可以提供信息以帮助用户诊断故障加热元件或同步问题。电源352对装置12的部件输送操作功率。电源352可以使用来自标准115伏电插 座的电力，或者用电池和发电电路来产生操作功率。在一些实施例中，电池是可再充电的， 从而可容许进行长期操作。例如，装置12可以是便携式的，从而能够在紧急情况下(例如在灾区)检测生物样品。可以通过115伏电插座完成再充电。在其它实施例中，可以使用 传统电池。图5是示出示例性数据分析装置11的进一步细节的功能方框图，该数据分析装置 可以是一般的计算装置，如执行一个或多个微处理器上的软件的台式计算机。在图示的实 施例中，数据分析装置11可以在功能上被视为包括控制模块31、接口模块32、数据库模块 33、通信模块34和分析模块35。接口模块32代表与用户交互所需的软件和硬件，例如用于接收来自用户38的输 入以及对用户38输出信息。接口模块32可以接收来自输入装置37的输入以及对使用户 能够与系统10交互的输出装置36输出数据。例如，用户38可以改变检测装置12和分析 装置11的操作参数以及存储在数据库模块33中的操作数据。此外，用户38可以与接口模 块32交互，从而启动对盘13的小室内存储的样品17的实时核酸扩增。另外，用户38可以 与数据分析装置11交互，从而对获取的数据进行观察和操作。在此过程期间，接口模块32 可以给用户提供用于与分析装置11交互的用户界面画面，包括例如图13-22中所示的示例 性用户界面画面。示例性输入装置37包括键盘、触摸屏、鼠标、麦克风等。输出装置38可 以包括例如IXD屏、LED阵列、CRT屏或触摸屏显示器。控制模块31代表响应通过接口模块32从用户38接收的输入来指示荧光检测装 置12操作的逻辑控制单元。例如，控制模块31可以包含软件指令，所述软件指令被执行时 对荧光检测装置12的控制单元19提供用于传达命令的控制逻辑，从而开始进行PCR分析 和数据收集。此外，在每个PCR循环或PCR分析期或者完成每个PCR循环或PCR分析期后， 控制模块31可以提供命令要求和接收来自控制单元19的缓冲扩增数据。此外，控制模块 31提供控制逻辑，用于存储数据库模块33内的缓冲扩增数据，以及用于请求分析模块35响 应来自用户38的命令处理数据。分析模块35接收来自控制模块31的扩增数据，利用小波变换对扩增数据进行处 理，并对与扩增数据相关的一个或多个PCR循环的PCR分析期确定Tmax值。例如，分析模块 35对扩增数据应用小波变换以识别对应于扩增数据生长期内的点的PCR循环，即，对于曲 线的Tmax值。在一些实施例中，PCR循环可对应于大约生长期的开始、可对应于生长期的结 束或可对应于生长期内的一些其它点。在一些实施例中，分析模块35可确定对PCR分析期 的Tmax值至循环的一部分。此外，分析模块35可任选容许用户38选择和应用手动或自动阈值技术来识别对 应于扩增数据生长期内的点的循环(例如，阈值循环，ct)。手动阈值技术有赖于用户设置 阈荧光强度。然后分析模块35确定何时扩增数据跨越此阈值和返回其作为Ct值发生的循 环。如果选择自动阈值技术，分析模块35自动确定阈值荧光强度。例如，分析模块 35可以确定扩增曲线基线区上的荧光信号的平均值和标准偏差。然后分析模块35可以 设定阈值在平均基线荧光信号以上的一定数目的标准偏差，例如在平均荧光信号以上的五 个标准偏差。阈值技术的进一步细节描述在美国专利申请公开No. 2003/0044826(题为 "AUTOMATIC THRESHOLD SETTING FOR QUANTITATIVE POLYMERASE CHAIN REACTION”)中， 上述申请全文以引用的方式并入本文。在其它实施例中，分析模块35还可容许用户38选 择导数技术作为确定对应于扩增数据生长期内的点的循环的不同办法。
在导数技术中，分析模块35可以计算扩增数据的η阶导数，确定η阶导数的极 大值、极小值或零值，并输出此导数值作为Ct值出现的PCR循环。导数技术的进一步细节 描述在美国专利申请公开 No. 2002/0(^8452(题为 “METHOD FOR QUANTIFICATION OF AN ANALYTE ”)，上述申请全文以引用的方式并入本文。分析模块35还可以容许用户38选择其它技术作为确定对应于扩增数据生长 期内的点的循环的办法。其它技术包括扩增生长曲线的傅里叶变换(进一步细节如 美国专利申请公开No. 2006/0286587中所述，其内容全文以引用的方式并入本文)和 Levenberg-Marquardt回归处理方法(进一步细节如美国专利申请公开No. 2007/0143385 中所述，题为“METHOD FOR QUANTIFICATION OF AN ANALYTE”，其内容全文以引用的方式并 入本文)。当对扩增数据应用小波变换以确定Tmax值时，扩增数据被分解成系列的基函数 (即小波)，其可以是多种函数。基函数的一个例子是Morlet小波。其它有用的小波包括 例如Haar小波或方脉冲函数；Marr小波或墨西哥帽；Paul小波；Daubechies小波；Mathieu 小波；Legendre小波；β小波；Hermetian小波；Siannon小波；高斯函数的导数等。—般来说，分析模块35对扩增数据应用小波变换以产生数据的三维表示，其中一 维是循环，第二维是膨胀(例如倒频)，第三维是小波幅值。这使得能沿循环和频率维度分 析扩增曲线，以便识别较大的幅值分量，同时保持分量的循环关系。因而，分析模块35能够 识别具有最大小波幅值的分量，并根据那些分量的循环关系将那些分量与扩增曲线上指示 生长区的点相关联。例如，根据幅值以及它们的循环相关性，分析模块35能够对与扩增数 据相关的PCR分析期识别Tmax值。例如，当应用小波变换时，分析模块35将扩增数据分解成选定小波的平移和膨 胀，其中每个时间平移值代表扩增数据内的循环偏移，每个膨胀值代表不同的小波倒频。分 析模块35这样做的方式可以是，用以时间平移值和膨胀值赋值的选定小波乘以代表扩增 数据(例如扩增曲线)的函数，或者对扩增数据直接应用以时间平移值和膨胀值赋值的选 定小波。然后分析模块35在所有循环上对结果函数进行积分，从而产生在该时间平移值和 膨胀值时的小波变换的幅值。然后分析模块35可以在保持膨胀值的同时增加时间平移值， 实施扩增函数与小波的乘法，并对结果函数进行积分，从而确定在此时间平移值和膨胀值 时的小波变换的幅值。分析模块35可以对每对儿时间平移和膨胀重复此过程，以便对选定 的小波建立扩增数据的三维循环-频率-幅值表示法。然后分析模块35可以应用构建的三维表示，以便对PCR分析期识别Tmax值，和/ 或将小波变换幅值输出为图形、文本、表格、图像等，进一步的详细描述如下。在一个实施例 中，分析模块35构建二维图象，其中第一轴是时间平移，第二轴是膨胀，每个时间平移-膨 胀坐标上的颜色、阴影或图像的强度代表在该点的小波变换的幅值。在其它实施例中，举例 来说，分析模块35可以构建三维图形，其中第一轴是时间平移，第二轴是膨胀，第三轴是小 波变换的幅值。接口模块32可以显示分析模块35对用户的输出，作为分析PCR期间的辅 助手段。如下文中进一步详述的那样，一旦计算了扩增数据的小波变换，分析模块35可以 对扩增数据确定Tmax值。例如，分析模块35可以选择膨胀值，并确定对于此膨胀值来说，在 什么时间平移值下出现局部极大的小波变换幅值。分析模块35可以根据一定的规范选择此局部极大的小波变换幅值，包括例如忽略边缘伪影，如使用有限数目的膨胀值所出现的 那些。出现局部极大的小波变换幅值的时间平移值是对于此膨胀部分的Tmax值。在一些 实施例中，分析模块35可以选择指定的膨胀值(例如，频率部分，如下所述)，在此确定Tmax 值。在其它实施例中，用户可以通过接口模块32指示分析模块35选择一定的膨胀值，或者 可以选择不止一个确定Tmax值的膨胀值。在此实施例中，分析模块35可以对为每个膨胀值 确定的Tmax值取平均值，从而确定平均Tmax值。然后接口模块32可以把Tmax值显示在输出装置36的显示器上。接口模块32可 以以文本、图形上的数据点、表格的一部分等的形式显示Tmax值。在一些实施例中，Tfflax值包 括在Tmax值对初始核酸浓度的对数的关系的标准曲线上的一个点。在其它实施例中，接口模块32可以根据TTmax值在输出装置36的显示器上显示信 息。例如，分析模块35可以将Tmax值的测定解释为简单地表示在已经历PCR分析的样品中 存在某种核酸。然后接口模块32可以显示指示出在样品中存在此核酸片段的信息。反之， 如果没有对样品确定Tmax值(即，没有发生扩增)，分析模块35可以将此解释为表示样品中 不存在具有某种序列的核酸，并且接口模块32可以显示相应的信息。在其它实施例中，当样品包含未知初始浓度的已知核酸时，分析模块35可以对未 知样品确定Tmax值，对已知的核酸应用标准曲线，并且在不显示Tmax的情况下显示未知样品 的浓度。在一些实施例中，在利用小波变换分析扩增数据之前，分析模块35或控制模块31 可以应用数据准备技术，如曲线平滑、噪声降低等。数据分析装置11可以是通用工作站、台式计算机、膝上型计算机；手持计算装置、 个人数字助理(PDA)或其它的计算装置。数据分析装置11可以包括微处理器、数字信号处 理器(DSP)、现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或用于实施所述技术的其它 硬件、固件和/或软件。换言之，如本文所述，可以用硬件、软件、固件及其组合等执行PCR 扩增数据的分析。如果以软件执行，计算机可读介质可以存储可以由处理器或DSP执行的 指令(即程序代码)，用以实施如上所述的一项或多项技术。例如，计算机可读介质可以包 括磁介质、光学介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、非易失性随机存取存储器 (NVRAM)、电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、闪存或适于存储程序代码的其它介质。图6是示出数据分析装置11收集和分析PCR扩增数据的示例方法的流程图。首 先，分析装置11初始化PCR分析42。例如，分析装置11 (例如控制模块31)根据存储在数 据库模块33中的参数或用户通过接口模块32的输入来控制荧光检测装置12的操作。所 述参数可以包括例如样品类型和数量、荧光标记物类型、检测器波长、循环数目、循环步骤、 循环温度分布和升温速率、盘转速、荧光检测时间等。分析装置11初始化PCR分析的方式 例如是，对控制单元19输出命令，根据由用户指定的工作参数指示荧光检测装置12准备新 的PCR分析期。此外，分析装置11可以初始化一个或多个文件，用于存储要接收自荧光检 测装置12的扩增曲线数据。作为响应，控制单元19利用光学模块16和检测器18获取PCR扩增数据44。控制 单元19可以对每个PCR循环获取荧光数据，并且可以收集一定时间长度的数据，例如，对于 每个PCR循环，盘13经过一定的转数。控制单元19可以对由检测器18检测到的荧光进行 积分，从而对每个PCR循环产生单一的荧光值，或者可以为单个PCR循环获取和保留多个荧光值。在PCR分析期结束之前，控制单元19可以缓冲扩增数据，或者可以将数据传递给分 析装置11，后者可把扩增数据存储在数据库模块33中用于过后分析，或者可以把扩增数据 传送至分析模块35，用于进行基本上实时的分析。在任何情况下，数据分析装置11的分析模块35对PCR扩增数据46应用小波变换。 如下文进一步详述，小波变换把强度对循环扩增数据的关系变换成基于频率-时间的数据 集，后者是两个新变量的涵数膨胀和时间平移。对于每对上述新变量，转换的数据具有小 波变换幅值。根据转换的数据，分析模块35识别Tmax值，其可对应于局部极大小波变换幅 值的时间平移坐标、多个局部极大幅值的平均时间平移坐标，或者可以代表由用户选定的 扩增曲线的另一特性。然后，接口模块32根据Tmax值更新显示48。在一些实施例中，接口模块32可以在 图形上、作为表格中的项目或者以任何其它合适的格式显示Tmax值。另外，如图7和8的上 下文所述，Tmax值可形成为标准曲线的一部分，或者分析模块35可以使用Tmax值来确定样品 中的初始核酸浓度。在其它实施例中，接口模块32可以根据Tmax值在输出装置36的显示器上显示信 息。例如，分析模块35可以将Tmax值的测定解释为简单地表示在已经历PCR分析的样品中 存在某种核酸片段。然后接口模块32可以显示信息，表示在样品中存在此核酸片段。反之， 如果没有对样品确定Tmax值(即，没有发生扩增)，分析模块35可以将此解释为表示样品中 不存在具有某种序列的核酸，并且接口模块32可以显示相应的信息。这(例如)在用于确 定病原体存在的核酸分析中是可取的。在其它实施例中，当样品包含未知初始浓度的已知核酸时，分析模块35可以对未 知样品确定Tmax值，对已知的核酸应用标准曲线，并且在不显示Tmax值的情况下显示未知样 品的浓度。图7示出PCR分析系统10的另一示例性操作。类似于参照图6所述的实施例，控 制模块31首先初始化荧光检测装置12以开始进行样品52的PCR分析。在图示的实施例 中，样品包括已知的初始核酸浓度。然后，荧光检测装置12的控制单元19利用光学模块16 和检测器18获取扩增数据M。然后数据分析11的分析模块35对扩增数据应用小波变换 56，从而确定Tmax值和利用接口模块32显示Tmax值58。接口模块32可以在图形上、作为表 格中的项目或者以任何其它合适的格式显示Tmax值。另外，在图7所示的实施例中，分析模块35进行计算和任选画出Tmax值对初始核 酸浓度对数的关系的标准曲线上的点60。要生成标准曲线上的点，分析模块35或控制模块 31计算出样品中初始核酸浓度的对数。然后分析模块35或控制模块31对照初始核酸浓 度的对数画出Tmax值，从而形成曲线上的一个点。然后分析模块35可以对包含不同初始浓 度的相同核酸的一组样品中的每一个重复这一程序，从而生成标准曲线。也就是说，分析模 块35可以对包含不同初始浓度的相同核酸的多个样品中的每一个获取扩增数据54，并且 对每一个样品来说，对扩增数据应用小波变换56以确定Tmax值，计算初始核酸浓度的对数， 并生成标准曲线60上的对应点。在一些实施例中，多个样品中不止一个可能包含相同的初 始核酸浓度。Tmax值可大致线性地正比于初始核酸浓度的对数。因此，数据点的线性回归拟合可 以是直线。分析模块35可以利用标准曲线或标准曲线的方程确定包含未知初始浓度的相同核酸的样品(例如用于生成标准曲线的样品，如参照图8的进一步详述)的初始浓度。分析模块35还可以利用标准曲线的方程确定PCR反应的效率。PCR反应的效率是 核酸量达到加倍每个PCR循环的接近程度的量度。PCR反应的效率与下述方程的曲线斜率 有关
权利要求
1.一种方法，包括实施核酸样品的PCR分析，其中所述PCR分析包括多个PCR循环；从所述PCR分析中获取扩增数据，所述扩增数据与所述多个PCR循环中的每一个当中 存在的核酸量成正比；对所述扩增数据应用小波变换以确定对应于所述扩增数据生长期内的点的PCR循环；以及根据对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循环更新显示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中应用小波变换包括由所述扩增数据生成扩增曲线，所述扩增曲线代表所述核酸样品的生长对PCR循环的 关系；以及对所述扩增曲线应用连续小波变换(CWT)以将所述扩增曲线分解成频率分量，同时沿 所述扩增曲线对所述频率分量保持PCR循环定位。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增数据代表所述核酸样品随时间推移的生长，且其中应用小波变换包括对所述扩增数据应用离散小波变换(DWT)，从而将所述扩增数 据分解成频率分量，同时相对于时间对所述频率分量保持PCR循环定位。
4.根据权利要求1所述的方法，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循 环包括PCR循环的一部分。
5.根据权利要求1所述的方法，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循 环被称为Tmax值。
6.根据权利要求1所述的方法，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循 环对应于所述生长期的大致开始。
7.根据权利要求1所述的方法，其中更新显示包括根据对应于所述扩增数据生长期内 的点的所述PCR循环显示信息。
8.根据权利要求5所述的方法，其中更新显示包括显示所述Tmax值。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸样品包含已知的初始核酸浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中更新显示包括在包含所述Tmax值对所述初始核酸 浓度的对数的关系的图上显示所述Tmax值。
11.根据权利要求10所述的方法，还包括对各包含已知初始核酸浓度的多个核酸样品的每一个重复进行权利要求1的方法。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述图还包含利用线性回归针对所述多个样品 的每一个进行的对所述Tmax值对所述初始核酸浓度的对数的关系的标准曲线拟合。
13.根据权利要求12所述的方法，还包括对包含未知初始核酸浓度的核酸样品重复进行权利要求1的方法。
14.根据权利要求13所述的方法，其中更新显示包括在所述图上显示包含未知初始核 酸浓度的所述核酸样品的Tmax值。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括根据包含未知初始核酸浓度的所述核酸样品的Tmax值和所述标准曲线确定包含未知初 始核酸浓度的所述核酸样品中的核酸初始量。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述核酸样品包含未知的初始核酸浓度。
17.根据权利要求16所述的方法，还包括根据所述Tmax值和标准曲线确定所述核酸样品的初始浓度。
18.根据权利要求5所述的方法，其中对所述扩增数据应用小波变换包括生成多个频 率部分，其中所述多个频率部分的每一个包括多个时间平移值，且其中每个时间平移值包 括小波变换幅值。
19.根据权利要求18所述的方法，其中对所述扩增数据应用小波变换包括根据所述多 个时间平移值中的至少一个的小波变换幅值确定所述Tmax值。
20.根据权利要求1所述的方法，其中对所述扩增数据应用小波变换包括在小波变换 中对所述扩增数据应用Haar小波。
21.根据权利要求1所述的方法，其中对所述扩增数据应用小波变换包括选择小波。
22.根据权利要求18所述的方法，其中对所述扩增数据应用小波变换包括选择所述多 个频率部分中的一个，并根据在所述频率部分中的多个时间平移值中的至少一个的小波变 换幅值确定所述Tmax值。
23.一种包括指令的计算机可读介质，所述指令使处理器启动核酸样品的PCR分析，其中所述PCR分析包括多个PCR循环从所述PCR分析中接收扩增数据，所述扩增数据与所述多个PCR循环中的每一个当中 存在的核酸量成正比；对所述扩增数据应用小波变换以确定对应于所述扩增数据生长期内的点的PCR循环；以及根据对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循环更新显示。
24.根据权利要求23所述的计算机可读介质，其中所述核酸样品包含未知初始量的核 酸，并其中所述计算机可读介质还包括指令，所述指令使处理器根据对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循环和标准曲线确定所述核酸样 品的初始浓度。
25.一种装置，包括初始化核酸样品的PCR分析并接收扩增数据的控制模块，所述扩增数据与多个PCR循 环中的每一个当中存在的核酸量成正比；对所述扩增数据应用小波变换以确定对应于所述扩增数据生长期内的点的PCR循环 的分析模块；和根据对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR循环更新显示的接口模块。
26.根据权利要求25所述的装置，其中所述分析模块由所述扩增数据生成扩增曲线，所述扩增曲线代表所述核酸样品的生长对PCR循环的 关系；以及对所述扩增曲线应用连续小波变换(CWT)以将所述扩增曲线分解成频率分量，同时沿 所述扩增曲线对所述频率分量保持PCR循环定位。
27.根据权利要求25所述的装置，其中所述扩增数据代表所述核酸样品随时间推移的生长，且其中所述分析模块对所述扩增数据应用离散小波变换(DWT)，从而将所述扩增数据分解成频率分量，同时相对于时间对所述频率分量保持PCR循环定位。
28.根据权利要求25所述的装置，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR 循环包括循环的一部分。
29.根据权利要求25所述的装置，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR 循环被称为Tmax值。
30.根据权利要求25所述的装置，其中对应于所述扩增数据生长期内的点的所述PCR 循环对应于所述生长期的大致开始。
31.根据权利要求25所述的装置，其中所述接口模块根据对应于所述扩增数据生长期 内的点的所述PCR循环显示信息。
32.根据权利要求四所述的装置，其中所述接口模块显示所述Tmax值。
33.根据权利要求25所述的装置，还包括数据库模块以存储所述扩增数据。
34.根据权利要求四所述的装置，其中所述核酸样品包含已知初始量的核酸。
35.根据权利要求34所述的装置，其中所述接口模块在所述Tmax对所述核酸初始量的 对数的关系的图上显示所述Tmax值。
36.根据权利要求35所述的装置，其中所述分析模块对包含已知初始量的核酸的多个 核酸样品中的每一个确定Tmax值。
37.根据权利要求36所述的装置，其中所述图还包含利用线性回归对所述多个样品的 每一个进行的对所述Tmax值对所述核酸初始量的对数的的关系的线拟合。
38.根据权利要求37所述的装置，其中所述分析模块对包含未知初始量的核酸的核酸 样品确定Tmax值。
39.根据权利要求38所述的装置，其中所述接口模块在所述图上显示包含未知初始量 的核酸的所述核酸样品的Tmax值。
40.根据权利要求39所述的装置，其中所述分析模块根据包含未知初始量的核酸的所 述核酸样品的Tmax值和所述线确定包含未知初始量的核酸的所述核酸样品中的核酸初始量。
41.根据权利要求四所述的装置，其中所述核酸样品包含未知初始量的核酸。
42.根据权利要求41所述的装置，其中所述分析模块根据所述Tmax值和标准曲线确定 所述核酸样品的初始浓度。
43.根据权利要求四所述的装置，其中所述分析模块对所述扩增数据应用小波变换以 生成多个频率部分，其中所述多个频率部分的每一个包括多个时间平移值，且其中每个时 间平移值包括小波幅度。
44.根据权利要求43所述的装置，其中所述分析模块根据所述多个时间平移值中的至 少一个的小波幅度确定Tmax值。
45.根据权利要求25所述的装置，其中所述分析模块对所述扩增数据应用Haar小波。
46.根据权利要求25所述的装置，其中对所述扩增数据应用小波变换包括选择小波。
47.根据权利要求43所述的装置，其中所述分析模块选择所述多个频率部分中的一 个，并根据在所述频率部分中的所述多个时间平移值中的至少一个的小波变换幅值确定 T 佶
全文摘要
本发明提供一种方法，其包括获取正比于多个PCR循环中的每一个当中存在的核酸量的扩增数据，该方法包括对所述扩增数据应用小波变换以确定对应于所述扩增数据生长期内的点的PCR循环并更新显示。本发明还提供一种装置，包括控制模块、分析模块和接口模块，用于初始化核酸样品的PCR分析、接收正比于核酸存在量的扩增数据、对所述扩增数据应用小波变换以确定对应于所述扩增数据生长期内的点的PCR循环，以及根据所述扩增数据更新显示。
文档编号C12Q1/68GK102046807SQ200980119169
公开日2011年5月4日 申请日期2009年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者彼得·D·陆德外斯 申请人:3M创新有限公司