专利名称：假单孢菌zjwp－14及其在不对称水解制备L－半胱氨酸中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物新菌种假单孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)及其在不对称水解制备L-半胱氨酸中的应用。
背景技术：
L-半胱氨酸所带有的巯基具有重要的生理功能，广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等行业。此外，L-半胱氨酸还可作为重要的中间体原料用于制备谷胱甘肽、色氨酸以及制备得到多种L-半胱氨酸的衍生物。L-半胱氨酸的生产方法主要有天然产物提取法、化学合成法和酶转化法。国内目前生产主要采用人或动物毛发原料先经酸水解或碱水解法提取L-胱氨酸后，再经过电解还原制得L-半胱氨酸，此法常受到原料来源的限制，而且产物中易混入其它的氨基酸。随着人们环保意识的增强，特别是近年来欧洲等地疯牛病的出现，迫使欧共体宣告从1998年7月1日起禁用由动物毛发原料制得的L-半胱氨酸。化学合成法不仅步骤较多，而且得到的产物通常为DL型的外消旋体，尚需经拆分后才能得到具有生理活性的L-半胱氨酸。由于酶转化法具有立体选择性好，可获得单一构型的产物；反应条件温和；对环境友好等优点而日益受到重视(杨金奎等.微生物方法生产L-半胱氨酸的研究进展.国外医药抗生素分册，2001，22(4)179)。
酶转化法生产L-半胱氨酸可选择采用三种底物(1)O-乙酰丝氨酸；(2)3-氯-L-丙氨酸；(3)DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)。1977年Sano等人从土壤中筛选到一些假单孢菌(Pseudomonas sp.)，可将DL-ATC不对称水解为L-半胱氨酸。除假单孢菌外，许多细菌也能转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。假单孢菌属的不同菌株其代谢途径存在差异，采用Pseudomonas putida AJ3865和Pseudomonas sp.ON-4a菌株进行转化时，中间产物为氮-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamoyl-L-cysteine，简称L-NCC)；而Pseudomonas sp.CU6和Pseudomonas thiazolinophilum菌株的转化中间产物为硫-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamoyl-L-cysteine，简称L-SCC)。刘忠等人从生产DL-ATC环境采取土样，从中分离得到一株假单孢菌(Pseudomonas sp.)TS1138菌株，可转化DL-ATC生成L-半胱氨酸。(刘忠等.微生物酶法合成L-半胱氨酸和L-胱氨酸.微生物学通报，2003，30(6)16-21.)前面所提到的可将DL-ATC不对称水解为L-半胱氨酸的假单孢菌Pseudomonas sp..ON-4a、Pseudomonas putida属恶臭假单孢菌(pseudomonas putida)株。
发明内容本发明的目的是提供一种可生物转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的微生物新菌株假单孢菌zjwp-14，以及利用该菌株生物催化DL-ATC不对称水解合成L-半胱氨酸的方法。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是假单孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO.M 206104，保藏日期2006年9月29日。
菌种来源假单孢菌zjwp-14(以下简写为zjwp-14)是从杭州祥符镇附近的土壤中分离培养得到的野生菌株HJ-14经过紫外线照射、微波诱变、Co60-γ射线辐照诱变处理，以及DL-ATC底物抗性筛选获得。紫外线照射功率为15w，照射距离30cm，照射时间为30～150s；微波诱变为低火档，冰浴处理20～120秒；Co60-γ射线辐照剂量范围在0.25KGy～2.0KGy。野生菌株HJ-14的分离方法为将采集土样采用含DL-ATC的培养液进行微生物富集培养，培养液经稀释后涂布在以DL-ATC为唯一氮源的固体培养基上，培养温度为25～36℃，培养2～4d。以HJ-14菌株为出发菌株，经过如下所示的诱变谱系选育得到zjwp-14菌株。
出发菌株HJ14→紫外诱变→微波诱变→Co60-γ辐照→底物DL-ATC抗性筛选→自然分离→菌株zjwp-14zjwp-14的生长特性zjwp-14为非发酵菌，生长迅速，30℃初代培养24h后长出细小、点状、圆形、湿润、乳白色的菌落，48h后菌落长到直径2-3mm，表面湿润，并联成一片。
zjwp-14的形态为革兰氏阴性、短小的杆菌。直径为0.5-1.0um，长为2um，革兰氏染色后显微镜照片见图1。
假单孢菌zjwp-14的生化特性细菌氧化酶阳性，过氧化氢酶试验阳性。采用API生化鉴定板条(法国biomerium公司)及经典的手工方法加以鉴定。结果显示zjwp-14与Pseudomonas mendocina相似，但符合率不到90％。将全自动微生物生化分析仪(API20NE，RapID，andVITEK-Ams60)分鉴定数据总结见表1。
表1zjwp-14生化特性(表中-表示阴性；+表示阳性)
zjwp-14的16S rDNA特性用细菌的16S rDNA的序列可比较精确地鉴定细菌的属和种。将zjwp-14的16S rDNA的PCR产物的序列与基因库NCBI中的16S rDNA序列比对，发现与假单孢菌属中一些菌，如Pseudomonas sp.BS有99.7％的同源性，zjwp-14的16S rDNA的部分核苷酸序列如下ATTGACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAGGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTCATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG。
本发明假单孢菌zjwp-14可用于DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸(DL-2-amino-Δ2-thiazolin-4-carbonic acid，DL-ATC)不对称水解制备L-半胱氨酸。
所述的应用为以假单孢菌zjwp-14进行常规培养获得的湿菌体或湿菌体经处理得到粗酶液为酶源，以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸为底物，在转化液中于20～52℃下进行微生物转化反应1～9h，反应完全得含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。
所述的底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸初始质量浓度为0.5％～2.5％。
所述的酶源为湿菌体，所述湿菌体来自发酵酶液，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为0.5～5∶1计。
具体的，所述的应用是以假单孢菌zjwp-14进行种子培善养和发酵培养，从发酵酶液中离心得到的湿菌体作为酶源，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，以含0.1～1.5％DL-ATC的磷酸盐缓冲溶液为转化液，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为0.5～5∶1计，控制转化温度为20～52℃，进行微生物转化反应1～9h，反应完全得含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。
所述应用按如下方法取得湿菌体(1)斜面培养挑取保存的假单孢菌zjwp-14转接到斜面培养基，30℃培养24～48h得活化的菌种；所述的斜面培养基组成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油10～30g/L，酵母浸出物2.0～10g/L，牛肉膏2.0～10g/L，NaCl 1.0～5.0g/L，琼脂15～25g/L，pH7.0～8.0；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养用接种环挑取一环假单孢菌zjwp-14转接到种子培养基，30℃，摇床转速200r/min，培养10～24h得种子培养液；所述的种子培养基组成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油5.0～30.0g/L，酵母浸出物5.0～30g/L，蛋白胨5.0～30g/L，牛肉膏5.0～30g/L，NaCl 1.0～5.0g/L，pH7.0～8.0g/L；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成种子培养基；(3)产酶培养取种子培养液接种，接种量为0.5～5％，25～35℃，摇床转速100～250r/min，在产酶培养基中进行摇瓶培养10～24h，获得发酵酶液；所述的产酶培养基组成(同种子培养基)；按上述条件得到的发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6。
(4)将发酵酶液离心、洗涤，收集湿菌体。
由于半胱氨酸不稳定，而胱氨酸比较稳定，本发明将生物转化得到的半胱氨酸氧化成胱氨酸后进行提取。具体方法为转化结束后，将反应液离心(10,000rpm，10min，4℃)，上清液加入微量的FeSO4，在往复式摇床上通气振荡20～30h后，用浓HCl溶液调节至pH2左右，经旋转蒸发浓缩至一定浓度，冷却后离心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液作为上柱样品。将样品用恒流泵以0.5mL/min的速度流加到装有732树脂的离子交换柱中，用去离子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱过程中随时监测流出液中的L-胱氨酸含量，洗脱完毕后合并含量较高的各管，真空干燥得到固体样品。样品经旋光测定，证实确为L型产物。比较制备样品与标准品的薄板层析图、质谱图，确定为同一物质。
优选的，所述应用如下所述应用为将发酵酶液直接制成的湿菌体用0.1M，pH8.0的磷酸缓冲液清洗，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，再将湿菌体转入所述的缓冲液中，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为2∶1计，同时加入底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸浓度使底物初始质量浓度为1％，于42℃、水浴反应6h，反应结束后将反应液分离提取制得L-胱氨酸形式存放，所述的分离提取步骤为反应液离心，取上清液加入FeSO4足以使足以L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，此时最好通入空气促使加速FeSO4将L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，振荡20～30h后，用浓HCl溶液调节至pH2，蒸发浓缩，冷却后离心，上清液流加到装有732树脂的离子交换柱中，用去离子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脱，洗脱完毕后合并L-胱氨酸含量较高的流出液，真空干燥得到所述L-胱氨酸。
本发明的有益效果主要体现在提供了一株新的可不对称水解DL-ATC生产L-半胱氨酸微生物菌种，本发明提供的假单孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)有别于背景技术中提到的恶臭假单孢菌，应用于制备L-半胱氨酸立体选择性好、反应条件温和、对环境友好，产率高。
图1为假单孢菌zjwp-14的革兰氏染色后显微镜照片；图2为不同菌株转化产物的扫描谱图；图3为实施例2产物红外谱图；图4为L-胱氨酸红外标准谱图；图5为不同培养时间的菌体浓度；图6为产酶时间曲线。
(五)
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1从杭州祥符镇附近的土壤中分离培养得到的野生假单孢菌株HJ-14、HJ-3、HJ-6、HJ-21、HJ-17、HJ-10，分别按下述顺序方法进行初筛富集培养基I(g/L)甘油10.0，DL-ATC 3.0，FeSO4.7H2O 0.01，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。121℃灭菌20min，灭菌后冷却接种，将少量土样接种到培养基中，200rpm回转式摇床，30℃培养2d，作为进一步富集培养的种子。
富集培养基II(g/L)甘油10.0，DL-ATC 6.0，FeSO4.7H2O 0.01，KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH7.0。121℃灭菌20min，灭菌后冷却接种。将经过第一次富集的富集液接入培养基II，200rpm回转式摇床，30℃培养2d，作为初筛平板的种子。
平板培养基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油10.0，NaCl 5.0，琼脂2.0，pH7.0。121℃灭菌20min，灭菌后冷却接种。将经过二次富集的菌体稀释后涂布在平板上，30℃培养2d。挑取单菌落转接斜面。
斜面培养基(g/L)DL-ATC 2.0，甘油10.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH7.0。121℃灭菌20min，灭菌后冷却，接种后30℃培养1d。
种子培养和发酵培养基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。装液量为250ml三角瓶装50ml培养基，121℃灭菌20min，灭菌后冷却接种斜面种子，200rpm摇床，30℃培养12h，作为种子或发酵酶液。
发酵酶液稀释10倍后菌体浊度范围为OD6000.4～0.6，离心10min(4,000rpm)，收集菌体，用磷酸缓冲液(0.1M，pH8.0)清洗两次，将菌体转入相同的缓冲液中，使菌体浓度为原发酵酶液的两倍，同时加入浓度为1％的DL-ATC底物，于42℃，水浴反应2h后，加入1M HCl，离心除去菌体后得上清液。上清液采用酸性茚三酮法进行产物的初步定性和定量分析。结果如图2所示。
结论菌株HJ-14、HJ-3、HJ-6、HJ-21、HJ-17、HJ-10的转化产物与标样半胱氨酸的扫描曲线一致，可以判定这些菌株的转化产物为半胱氨酸，其中HJ-14的转化产物在560nm处的吸收最大，说明其半胱氨酸含量最高。
实施例2按照实施例1中的结果选出菌株HJ-14，进行发酵培养后，加入底物DL-ATC(终浓度为1％)，于42℃，水浴反应6h后，将反应液离心(10,000rpm，10min，4℃)，上清液加入微量的FeSO4，在往复式摇床上通气振荡20～30h后，用浓HCl溶液调节至pH2左右，旋转蒸发浓缩，冷却，离心(10,000rpm，20min，4℃)，上清液作为上柱样品。将样品用恒流泵以0.5mL/min的速度流加到732树脂柱中，用去离子水淋洗后，用0.5mol/L的氨水进行洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱过程中随时监测流出液中的L-胱氨酸含量，洗脱完毕后合并含量较高的各管，真空干燥得到固体样品。
将提取产物与L-胱氨酸标准品溶解于0.01M HCl，进行薄层分析，展开剂为正丁醇∶乙酸∶水＝2∶1∶1，提取产物的Rf为0.400，L-胱氨酸标准品的Rf为0.402，获得的产物与L-胱氨酸标准品有相同的Rf值。L-半胱氨酸标准品Rf为0.593，酶促反应液中产物Rf为0.596，证明转化产物确为半胱氨酸。
转化样品与标准品的红外光谱图对照见图3、图4所示。
样品与标准品的旋光分析将旋光仪中的读数代入公式计算该产物的比旋光度，对获得的产物测定3次，其读数分别为-0.634、-0.628、-0.627，取3次的平均值-0.629。代入公式计算[α]D20=αLC=-0.6291×0.003=-209.9]]>L-胱氨酸标准品3次测定的值为-0.628、-0.635、-0.633，取3次平均值-0.632，代入公式计算 由计算结果可知，纯化后的产物与L-胱氨酸标准品有十分接近的比旋光度，证明得到的胱氨酸是L型异构体，可以确定由DL-ATC酶促反应生成的半胱氨酸也是L型异构体。
实施例3实施例1筛选得到的野生菌株HJ-14经过紫外线照射、微波诱变、Co60-γ射线辐照诱变处理，以及DL-ATC底物抗性筛选(详细步骤如前所述)，获得假单孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)。
斜面培养基(g/L)DL-ATC 2.0，甘油10.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，pH7.0。121℃灭菌20min，灭菌后冷却，接入Pseudomonas sp.zjwp-14，30℃培养1d。
种子培养基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。装液量为250ml三角瓶装液50ml，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接入一环斜面种子，200rpm摇床，30℃培养12h，作为种子。
产酶培养基(g/L)DL-ATC 3.0，甘油20.0，酵母浸出物5.0，蛋白胨5.0，牛肉膏5.0，NaCl 5.0，pH7.0。装液量为250ml三角瓶装液50ml，121℃灭菌20分钟，灭菌后冷却接入1ml的种子，200rpm摇床，30℃培养，每隔2h，按实施例1方法测定菌体浊度和酶活。结果如图5、图6所示。
实施例4用Pseudomonas sp.zjwp-14，按实例3方法发酵产酶，发酵培养12h后，取10ml发酵酶液，离心后得到的湿菌体加于20ml试管中装0.1M，pH8.0磷酸缓冲液5ml，含底物DL-ATC量分别为0.1％，0.3％，0.6％，1.0％，1.3％，1.6％于42℃水浴下进行转化反应，反应2h后结束，加1ml HCl(1M)灭活酶源，反应液离心除去菌体，得上清液。上清液用酸性茚三酮法测定。结果如表2表2不同底物浓度对转化的影响
实施例5用Pseudomonas sp.zjwp-14，按实例3方法发酵培养12h后，取2.5～25ml的发酵酶液离心后得到的湿菌体加于20ml试管中装0.1M，pH8.0磷酸缓冲液5ml，起始底物DL-ATC量为0.05g/管，于42℃水浴下进行转化反应。2h后反应结束，加1mlHCl(1M)灭活酶源，离心除去菌体，得上清液。上清液用酸性茚三酮法测定，结果如表3。
表3不同的菌体量对转化的影响
实施例6用Pseudomonas sp.zjwp-14，按实例3方法发酵产酶，按实例5方法进行转化反应，5ml反应体系中含底物DL-ATC量为0.05g，金属离子含量分别为0.2mM和2mM，反应2h后取样，进行酸性茚三酮含量分析，结果如表4所示。
表4不同金属离子对酶活的影响
实施例7用Pseudomonas sp.zjwp-14，按实例3方法发酵产酶，5ml反应体系中含底物DL-ATC量为0.05g，按实例6方法进行转化反应，转化于20-52℃的水浴中反应2h，反应结束后，进行酸性茚三酮分析含量。结果如表5。
表5转化温度曲线
实施例8用Pseudomonas sp.zjwp-14，发酵产酶方法同实例3，进行转化反应方法同实例6，50ml反应体系中含底物DL-ATC量为0.5g。于反应不同时间取样，进行酸性茚三酮分析含量并计算转化产率。结果如表6所示。
表6转化时间曲线
序列表.ST25SEQUENCE LISTING<110>浙江工业大学<120>假单孢菌zjwp-14及其在不对称水解制备L半胱氨酸中的应用<130>
<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1456<212>DNA<213>Pseudomonas sp.zjwp-14<400>1attgacgctg gcggcaggcc taacacatgc aagtcgagcg gatgacggga gcttgctcct 60tgattcagcg gcggacgggt gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggacaacg120tttcgaaagg aacgctaata ccgcatacgt cctacgggag aaagcagggg accttcgggc180cttgcgctat cagatgagcc taggtcggat tagctagttg gtggggtaat ggctcaccaa240ggcgacgatc cgtaactggt ctgagaggat gatcagtcac actggaactg agacacggtc300cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag360ccatgccgcg tgtgtgaaga aggtcttcgg attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg420gcagtaagtt aataccttgc tgttttgacg ttaccgacag aataagcacc ggctaactct480gtgccagcag ccgcggtaat acagagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa540gcgcgcgtag gtggttcgtt aagttggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc600atccaaaact ggcgagctag agtagggcag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga660aatgcgtaga tataggaagg aacaccagtg gcgaaggcga ccacctgggc tcatactgac720actgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta780aacgatgtca actagccgtt ggaatccttg agattttagt ggcgcagcta acgcattaag840ttgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc900acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggccttga960catgcagaga actttccaga gatggattgg tgccttcggg aactctgaca caggtgctgc 1020atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc 1080ttgtccttag ttaccagcac gttatggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc 1140ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggcctgggc tacacacgtg 1200ctacaatggt cggtacagag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatct cacaaaaccg 1260atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320cgaatcagaa tgtcgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380tgggagtggg ttgcaccaga agtagctagt ctaaccttcg ggaggacggt taccacggtg 1440tgattcatga ctgggg 145权利要求
1.假单孢菌zjwp-14(Pseudomonas sp.zjwp-14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M.206104。
2.如权利要求1所述的假单孢菌zjwp-14，其特征在于所述假单孢菌zjwp-14的16S rDNA的部分核苷酸序列如下ATTGACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTAGGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTCATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGATTTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGAGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGG。
3.如权利要求1所述的假单孢菌zjwp-14，其特征在于所述假单孢菌zjwp-14的菌落特征如下为非发酵菌，生长迅速，30℃初代培养24h后长出细小、点状、圆形、湿润、乳白色的菌落，48h后菌落长到直径2～3mm，表面湿润，并联成一片，个体为短小的杆菌，直径为0.5～1.0μm，长为2μm；所述假单孢菌zjwp-14的生化特性如下革兰氏阴性，细菌氧化酶阳性，过氧化氢酶试验阳性，甘露醇阴性，L-丙氨酸阳性，D-葡萄糖阳性，蔗糖阴性，L-阿拉伯糖阴性，麦芽糖阴性，丙酸盐阳性，辛二酸盐阴性，L-丝氨酸阳性，L-脯氨酸阳性。
4.如权利要求1～3之一所述的假单孢菌zjwp-14在DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸不对称水解制备L-半胱氨酸中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为以假单孢菌zjwp-14进行常规培养获得的湿菌体或湿菌体经处理得到粗酶液为酶源，以DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸为底物，在转化液中于20～52℃下进行微生物转化反应1～9h，反应完全得含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸初始质量浓度为0.5％～2.5％。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的酶源为湿菌体，所述湿菌体来自发酵酶液，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为0.5～5∶1计。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用是以假单孢菌zjwp-14进行种子培善养和发酵培养，从发酵酶液中离心得到的湿菌体作为酶源，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，以含0.1～1.5％DL-ATC的磷酸盐缓冲溶液为转化液，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为0.5～5∶1计，控制转化温度为20～52℃，进行微生物转化反应1～9h，反应完全得含L-半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L-半胱氨酸。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用按如下方法取得湿菌体(1)斜面培养挑取假单孢菌zjwp-14单菌落转接斜面培养基，30℃培养24～48h得活化的菌种；所述的斜面培养基组成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油10～30g/L，酵母浸出物2.0～10g/L，牛肉膏2.0～10g/L，NaCl1.0～5.0g/L，琼脂15～25g/L，pH7.0～8.0；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养用接种环挑取一环假单孢菌zjwp-14转接到种子培养基，30℃，摇床转速200r/min，培养10～24h得种子培养液；所述的种子培养基组成DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸1.0～5.0g/L，甘油5.0～30.0g/L，酵母浸出物5.0～30g/L，蛋白胨5.0～30g/L，牛肉膏5.0～30g/L，NaCl1.0～5.0g/L，pH7.0～8.0g/L；121℃灭菌20min，灭菌后冷却制成种子培养基；(3)产酶培养取种子培养液接种，接种量为0.5～5％，25～35℃，摇床转速100～250r/min，在产酶培养基中进行摇瓶培养10～24h，获得发酵酶液；所述的产酶培养基组成同种子培养基；(4)将发酵酶液离心、洗涤，收集湿菌体。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为将发酵酶液直接制成的湿菌体用0.1M，pH8.0的磷酸缓冲液清洗，所述发酵酶液稀释10倍后OD600为0.4～0.6，再将温菌体转入所述的缓冲液中，所述湿菌体添加量按发酵酶液与转化液体积比为2∶1计，同时加入底物DL-2-氨基-噻唑啉-4-羧酸浓度使底物初始质量浓度为1％，于42℃、水浴反应6h，反应结束后将反应液分离提取制得L-胱氨酸形式存放，所述的分离提取步骤为反应液离心，取上清液加入FeSO4足以使足以L-半胱氨酸氧化成L-胱氨酸，振荡20～30h后，用浓HCl溶液调节至pH2，蒸发浓缩，冷却后离心，上清液流加到装有732树脂的离子交换柱中，用去离子水淋洗，再用0.5～1.0mol/L的氨水洗脱，洗脱完毕后合并L-胱氨酸含量较高的流出液，真空干燥得到所述L-胱氨酸。
全文摘要
本发明涉及一种假单胞菌及其在生物催化制备L－半胱氨酸中的应用，所述的假单胞菌zjwp－14(Pseudomonas sp.zjwp－14)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M.206104。以假单胞菌zjwp－14进行常规培养获得的湿菌体或湿菌体经处理得到粗酶液为酶源，以DL－2－氨基－噻唑啉－4－羧酸为底物，在转化液中于20～52℃下进行微生物转化反应1～9h，反应完全得含L－半胱氨酸的反应液，经分离提取制得L－半胱氨酸。本发明提供了一株新的可不对称水解DL－ATC生产L－半胱氨酸微生物菌种，应用于制备L－半胱氨酸立体选择性好、反应条件温和、对环境友好，产率高。
文档编号C12N15/31GK1995327SQ20061005393
公开日2007年7月11日 申请日期2006年10月21日 优先权日2006年10月21日
发明者王普, 吕国英, 何军邀, 王浩, 周丽敏 申请人:浙江工业大学