一株产生acc脱氨酶人参促生细菌的获得及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCCNo.8239，它是在大量人参内生细菌中，经初选得到了几株可产生ACC脱氨酶的菌株，再反复筛选得到的，经大量的实验证明，菌株JJ8-3不仅可产生ACC脱氨酶，同时也具有很强的促进人参生长作用，无致病性，经鉴定，菌株JJ8-3为荧光假单孢菌（Pseudomonasfluorescens），解决了我国最为重要的中药材之一，人参的种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。
【专利说明】—株产生ACC脱氨酶人参促生细菌的获得及应用
【技术领域】
[0001]本发明属微生物【技术领域】，具体地说是一株产生ACC脱氨酶人参促生细菌及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，自然灾害的发生以及化肥的不合理利用对土壤和作物生长造成了极大的负面影响。从环境中筛选具有促进植物生长，提高植物抗逆能力并改善环境的微生物菌株具有重要的意义。目前已报道的一些具有促生功能的菌株，其主要特性包括产IAA、固氮、解磷、解钾、产铁载体等。而1-氨基环丙烷1-羧酸(ACC)脱氨酶及其活性菌株研究的报道较少，也是近年来比较受关注的植物促生菌特性之一。乙烯是一类重要的植物内源生长调节剂，主要在植物果实成熟、植株衰老或不利条件下发挥调节作用，亦称“应激激素”，乙烯的过量产生会抑制植物种子根的伸长、植株的生长、抗性下降、提早凋谢等。而ACC脱氨酶具有降解乙烯并促进植物生长的作用。据报道ACC脱氨酶在促进植物抗盐碱、干旱、重金属离子及植物促生方面具有重要的调节作用。
[0003]植物遭受胁迫会产生乙烯。高水平的乙烯会抑制植物的生长。具有A CC脱氨酶的细菌能够吸收植物细胞分泌到胞外的用来合成乙烯的直接前体A CC，通过A CC脱氨酶催化，将A CC水解成a —酮丁酸和N H 3，从而降低植物体内胁迫乙烯的水平，解除胁迫乙烯对植物生长的抑制。大量的研究证实接种具有A CC脱氨酶的细菌能够促进植物的生长，尤其是在植物遭受生物或非生物胁迫的逆境下。因此，具有A C C脱氨酶活性已经成为评估细菌是促植物生长细菌的一个重要指标。但是，近年来，从某些致病菌的基因组序列中已经发现A CC脱氨酶基因，从某些致病菌中也检测到了 A CC脱氨酶活性，还发现具有A CC脱氨酶的假单胞菌(Pseudomonas bicacearum )能够让番爺莖和果实产生病症。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的是为克服人参种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，而提供一株产生ACC脱氨酶人参促生细菌。
[0005]人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCC N0.8239。
[0006]人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株在促进人参生长方面的应用。
[0007]本发明提供了人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCCN0.8239，它是在大量人参内生细菌中，经初选得到了几株可产生ACC脱氨酶的菌株，再反复筛选得到的，经大量的实验证明，菌株JJ8-3不仅可产生ACC脱氨酶，同时也具有很强的促进人参生长作用，无致病性，经鉴定，菌株JJ8-3为荧光假单孢菌
解决了我国最为重要的中药材之一，人参的种子发芽率低、生长缓慢、抗逆性差等缺点，该菌株的发现为人参促生菌肥的开发及其利用奠定了良好的基础。【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为JJ8-3菌株ACC脱氨酶活性测定，其中，I JJ8-3菌株反应后变为棕色；2:对照；
图2为JJ8-3菌株其他促生功能分析，其中，1:解磷特性，2:固氮潜能，3:产体载体能力；
图3为JJ8-3菌株在NA培养基上的菌落形态；
图4为JJ8-3菌株在紫外下的产生荧光；
图5为JJ8-3菌株电镜下观察的菌体形态；
图6为JJ8-3菌株的分子鉴定聚类图谱；
图7为JJ8-3菌株对人参种子发芽的促生作用；
图8为JJ8-3菌株对人参种子发芽的促生作用；
图9为JJ8-3菌株对人参根的促生作用；
图10为JJ8-3菌株对人参根鲜重的促生作用； 图11为JJ8-3菌株对人参根干重的促生作用。
【具体实施方式】
[0009]实施例1产生ACC脱氨酶人参活性内生细菌(荧光假单孢菌)的获得。
[0010]采用平板稀释法分离获得了 120株来源于吉林省的人参内生细菌，并对其进行了ACC脱氨酶活性菌株的筛选。
[0011]筛选分为初筛和复筛，初筛采用液体培养法对120株细菌进行筛选，将待测菌株分别接种到液体LB培养基中，28°C，160 r/min过夜培养。取0.2 mL培养基转接到8mL DF盐培养基中，相同培养条件下培养12 h。然后再取0.2mL培养基再次转接8mL ADF液体培养基。并以不含ACC的ADF培养基作为对照。培养24~48h测其600 nm处吸光值，三次重复，比对照吸光值显著增加的为阳性菌株。结果筛选得到筛选到8株阳性菌株。(DF盐培养基:KH2PO4 4.0 g, Na2HPO4 6.0 g ,MgSO4.7Η20 0.2 g，葡萄糖 2.0 g，葡萄糖酸 2.0 g，柠檬酸2.0 g, (NH4)2SO4 2.0 g，去离子水lOOOmL，pH 7.2 ;ADF培养基:ACC溶于灭菌的超纯水后，经0.22 μπι 一次性无菌过滤器过滤除菌，加到不含有(NH4) 2S04的DF盐培养基中，终浓度为3.0 mmol/L0)
复筛采用α -酮丁酸法对初筛得到的菌株进行筛选:①菌株接种到LB液体培养基中，28°C, 160 r/min过夜培养，培养液经8000 r/min离心5min后将菌体重新悬浮于7.5 mLADF液体培养基，28°C，160 r/min继续培养16 h。取出培养液8000 r/min离心，弃上清，收集菌体。菌体再悬浮于0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲液后超声破碎，得粗酶液保存；②α-酮丁酸标准曲线的绘制，分别吸取α-酮丁酸标准样品200 PL加入无菌试管中，另加入1.6mL HCl (0.56 mol/L)和 300 μ? 2，4-二硝基苯肼(0.2%)，30°C水浴 30 min。取出后加入2 mL NaOH (2mol/L)溶液混匀，540nm测定吸光值。③取两试管，分别加入200 μ L粗酶液。其中一支试管中加入0.5mmol ACC 20 μ L混匀，30°C水浴15min后加入ImL 0.56 mol/L HCl 终止反应，120001'/111丨11离心5111丨11，取上清液11^，加入80(^1^ 0.56 mol/L 和 300 μ L
0.2%的2，4- 二硝基苯肼，30°C水浴30min，取出后加入2mL 2mol/L NaOH溶液混匀。另一只试管未加入0.5mmol ACC为对照管,在540nm处测定吸光值。复筛实验结果显示，JJ8-3菌株具有ACC脱氨酶活性(图1 )，其酶活性为α-酮丁酸6.702 ymol/mg*h0
[0012]实施例2:活性菌株JJ8-3其他促生指标的测定
1、解无机磷能力的筛选:初筛采用PKO固体培养法，将JJ8-3菌株在NA培养基上培养12h后，打菌碟接种于PKO固体培养基，28°C恒温培养3d后观察解磷圈大小。复筛采用钥锑钪比色法，将JJ8-3打孔接种于50mL LB液体培养基，160 r/min培养12h。取I mL接种于装有50 mLPKO液体培养基的150 mL三角瓶中，3 d后取培养液5mL，8000 r/min离心5min后取上清，钥锑钪比色法测量可溶性磷含量。结果显示，在PKO平板上，JJ8-3菌株具有明显的解磷圈(图2);定量测定其解磷含量，可达到380 Pg/mL。
[0013]2、固氮能力的测定:将菌株划线接种于Ashby固体培养基上，30°C恒温培养2d，观察菌株长势，结果发现菌株JJ8-3无氮条件下长势良好(图2 )。
[0014]3、产铁载体能力的测定:初筛采用固体培养法，将JJ8-3菌株在NA培养基上培养12h后，打菌碟接种于刃天青固体培养基，28°C恒温培养2d后观察菌落周围颜色变化。复筛方法为比色法，用接种环挑取一环新鲜菌苔于MKB培养液内，280C、160r/min摇床培养2d后取菌液10000r/min离心lOmin，取上清3ml于试管中，加入3ml CAS检测液混匀后20°C反应lh，在630nm处测定吸光值As ;另取3ml CAS检测液与3ml未接菌的MKB液体培养基上清液混匀，同样测吸光值Ar。根据公式((Ar — As) /Ar) X 100)计算铁载体产生量。结果显示，JJ8-3菌株具有产生铁载体活性(图2)，其活性高达91.8%。
[0015]实施例3:菌株JJ8-3的鉴定
将JJ8-3菌株划线接种在NA培养基上，28 °C培养12~24h后，观察记录单菌落形态。JJ8-3在NA培养基上呈浅绿色不透明圆形菌落，边缘完整微透明(图3)，革兰氏染色阴性，无运动性，紫外下观察产生荧光(图4)。
[0016]取在LB液体培养基中培养24h的JJ8-3菌株菌液，离心用无菌水反复冲洗后，悬浮于适量无菌水中进行负染色制备样品，用镊子夹住带膜的铜网蘸取微量菌液，静置2min，从边缘用滤纸吸干剩余液；然后再用镊子夹住带菌的铜网浸入盛有双蒸水的烧杯内漂洗，再用滤纸吸干液体，接着用2%磷钨酸负染色5 min，干燥后用透射电镜观察发现菌体呈杆状，生有极端生长鞭毛(图5)。
[0017]参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰系统鉴定手册》中推荐的部分培养基(表1)和方法测定JJ8-3菌株的生理生化特性发现，JJ8-3菌株接触酶、氧化酶反应为阳性，V-P反应为阴性；能利用柠檬酸、不能使硝酸盐还原、淀粉水解，但能使油脂水解、明胶液化，石蕊牛奶还原但不胨化，对NaCl的耐受性为7%;可以利用葡萄糖、甘露醇和半乳糖。
【权利要求】
1.人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株，保藏编号为CGMCCN0.8239。
2.权利要求1所述的人参内生细菌荧光假单孢菌JJ8-3菌株在促进人参生长方面的应用 。
【文档编号】C12R1/39GK103820359SQ201410011921
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年1月12日 优先权日:2014年1月12日
【发明者】陈长卿, 姜云, 田磊, 张冠军, 李桐 申请人:吉林农业大学