提高含有水溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(gdh)的组合物热稳定性的方法

专利名称：提高含有水溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(gdh)的组合物热稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高含有以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶等可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(本说明书中将葡萄糖脱氢酶记载为GDH)的组合物热稳定性的方法及使用了该方法的组合物。
背景技术：
自测血糖通常对于糖尿病患者把握自己的血糖值以进行有效治疗是重要的。用于自测血糖的传感器通常利用以葡萄糖为底物的酶。这样的酶例如有葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)等。由于葡萄糖氧化酶具有对葡萄糖特异性高、热稳定性优良的优点，因此，一直用作血糖传感器用酶，其最初发表实际上可追溯到大致40年前。在利用了葡萄糖氧化酶的血糖传感器中，氧化葡萄糖变成D-葡萄酸-δ-内酯的过程中产生的电子通过介体(电子传递物)转移到电极，由此可以进行测定，但是由于葡萄糖氧化酶容易将反应中产生的质子转移给氧，因此存在溶解氧影响测定值的问题。
为了避免这样的问题，例如，使用NAD(P)依存型葡萄糖脱氢酶(EC1.1.1.47)或吡咯并喹啉醌(本说明书中将吡咯并喹啉醌记载为PQQ)依存型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.5.2(旧EC 1.1.99.17))作为血糖传感器用酶。这些在不受溶解氧的影响方面是有利的，但是前者的NAD(P)依存型葡萄糖脱氢酶(本说明书中也将NAD(P)依存型葡萄糖脱氢酶记载为NADGDH)存在欠稳定和必须添加辅酶的烦琐性。另一方面，后者的PQQ依存型葡萄糖脱氢酶(本说明书中将PQQ依存型葡萄糖脱氢酶记载为PQQGDH)存在如下缺点由于其底物特异性低，对麦芽糖和乳糖这些葡萄糖以外的糖类也有作用，因此，影响测定值的正确性。
另外，WO 2004/058958中公开了曲霉属由来的黄素结合型葡萄糖脱氢酶(本说明书中将黄素结合型葡萄糖脱氢酶记载为FADGDH)。该酶在底物特异性优良且不受溶解氧的影响方面是有利的。关于热稳定性，在50℃处理15分钟，活性残存率为89％左右的，其稳定性就可以说优良。但是，如果考虑在传感器探头制作工序中有时需要加热处理，则绝对不可以说有充分的稳定性。

发明内容
本发明的目的，在于克服如上所述的众所周知的血糖传感器用酶热稳定性方面的缺点，提供一种实际应用方面可以用于血糖值测定用试剂的组合物。本发明者在迄今为止的PQQGDH的研究中，取得了多个改善了该酶底物特异性的多重变异体，但发现其中一部分变异体和野生型PQQGDH相比，热稳定性降低了。因此，为了解决该课题，对其原因进行了专心致志的研究，结果发现，通过在本专利中提示的该酶中添加某种化合物，可以稳定地维持PQQGDH的立体结构，改善稳定性。
本发明者进一步研究发现，对FADGDH、NADGDH也有同样效果，完成了本发明申请。
迄今为止，关于提高PQQGDH稳定性的方法的报告有WO02/072839，报道了采用在基因水平上改造PQQGDH的研究结果，但对不采用改造酶而使稳定性增加的手段，连其可能性都未提及。
另外，本发明者进行了专心致志的研究，结果发现，通过将包含含有黄素化合物的GDH的组合物的pH保持在酸性pH，可以使该组合物能达到经受加热干燥水平的高热稳定性。
所谓可以加热干燥水平，是指在50℃处理15分钟后的残存活性在10％以上的状态，较好的可达45％以上的残存活性状态，更好的可达70％以上的残存活性状态。
而且，本发明者从和过去的方法不同的角度考虑，探索更简便的改良热稳定性的方法，进行了更加专心致志地研究，结果发现，通过在包含GDH的组合物中利用偏酸性的pH，并且使一种以上的二羧酸、盐类化合物与其共存，可以提高组合物整体的稳定性，从而完成了本发明。
亦即，本发明涉及以下内容。
一种提高葡萄糖脱氢酶(GDH)的热稳定性，使其比不与以下化合物共存时更高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该酶和选自糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质中的任一种以上化合物共存的工序。
[第一项]记载的提高稳定性的方法，其中辅酶是吡咯并喹啉醌或黄素化合物或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。
如[第一项]或[第二项]记载的提高了热稳定性的组合物，其中共存的各化合物的最终浓度为0.1％以上。
如[第一项]～[第三项]任一项记载的提高热稳定性的方法，其特征在于，所添加的化合物选自甘露醇、肌醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、肌醇、甘油酸钙、琥珀酸、氯化钾、氯化铵、柠檬酸氢二铵、富马酸、丙二酸、庚二酸、3-3’二甲基戊二酸、赖氨酸、苯二甲酸、马来酸、戊二酸、硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、牛血清白蛋白(BSA)中的任一种以上。
一种利用如[第一项]～[第四项]记载的任一项方法提高了热稳定性的含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物。
一种使用[第五项]记载的组合物的葡萄糖浓度测定方法。
一种含有如[第六项]记载的组合物的葡萄糖传感器。
一种使GDH热稳定性比不与以下化合物共存时热稳定性提高的组合物的制造方法，包含在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该酶和选自糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质中的任一种以上化合物共存的工序。
一种使组合物比在pH7.3以上时热稳定性提高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该组合物的pH保持在7以下的酸性的工序。
一种使组合物比在pH7.4时热稳定性提高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该组合物的pH保持在3.1～7.0的工序。
如[第九项]或[第十项]记载的提高组合物的热稳定性的方法，其可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)是以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)。
如[第十一项]记载的提高热稳定性的方法，其特征在于，以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)是由丝状真菌而来的。
一种利用如[第九项]～[第十二项]任一项记载的方法提高了热稳定性的组合物。
如[第十三项]记载的含GDH组合物，其特征在于，含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物经50℃、处理15分钟时，与在4℃保存的该组合物相比，GDH活性残存10％以上。
如[第十三项]记载的含GDH组合物，其特征在于，含有以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物在50℃处理15分钟时，与在4℃保存的该组合物相比，GDH活性残存45％以上。
如[第十三项]记载的组合物，其含有一种以上的二羧酸、盐类化合物。
如[第十三项]记载的组合物，其含有氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵、琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苯二甲酸、马来酸中一种以上的化合物。
一种使用如[第十三项]记载的组合物的葡萄糖浓度测定方法。
一种含有如[第十三项]记载的组合物的葡萄糖传感器。
一种比在pH7.3以上时热稳定性提高的组合物的制造方法，包含在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在7以下的酸性的工序。
一种比在pH7.4时热稳定性提高的组合物的制造方法，包含在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在3.1～7.0的工序。
利用本发明提高热稳定性，可以减少葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器制作时的酶的热失活，减少该酶的用量和提高测定精度。还可以提供采用保存稳定性优良的GDH的血糖值测定试剂。


图1来自土曲霉(Aspergillus terreus)亚种的FADGDH的热稳定性与pH的相关性图2来自薄刺青霉(Penicillium lilacinocchinulatum)NBRC6231株的FADGDH的热稳定性与pH的相关性为实施发明的最佳方式GDH是催化以下反应的酶。
D-葡萄糖+电子传递物质(氧化型)→D-葡萄酸-δ-内酯+电子传递物质(还原型)这是一种催化D-葡萄糖氧化生成D-葡萄酸-1，5-内酯反应的酶，其来源和结构没有特别限制。
可以应用于本发明方法的GDH，只要是可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)，就无特别限制。
辅酶可以采取例如吡咯并喹啉醌或黄素化合物或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)等的形式。
可以应用于本发明方法的，以吡咯并喹啉醌作为辅酶的GDH(PQQGDH)，没有特别限制，可以例示的例如有来自醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)LMD79.41菌株的(A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacteriol.，170.2121(1988)及Mol.Gen.Genet.，217，430(1989))、来自大肠杆菌(Escherichia coli)的(A.M.Cleton-Jansen等，J.Bacterliol.，172.6308(1990)、来自氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)的(Mol.Gen.Genet.，229.206(1991))及WO 2004/058958中报道的鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517菌株等微生物由来的物质等。
其中，改变存在于大肠杆菌等细菌中的膜型酶使其成为可溶型是困难的，原始材料最好选择醋酸钙不动杆菌或鲍氏不动杆菌等细菌的可溶性PQQGDH。
需要说明的是，鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517株以前被归类为醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)。
这些PQQGDH可以使用例如东洋纺织制GLD-321等市售产品。或者，可以使用以该技术领域中常规技术由本领域技术人员很容易地制造出来的产品。
可以应用于本发明方法的，以FAD作为辅酶的GDH(FAD结合型GDH)，没有特别限制，例如有来自于属于真核生物范畴的丝状真菌的青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)等微生物的酶。这些微生物菌株通过从各菌株保藏机构购买，可以而很容易地得到。例如，青霉属的薄刺青霉(Penicillium lilacinoechinulatum)，已经以菌钟保藏编号NBRC6231，在产品评审技术基础机构·生物资源部门注册。
可以用于本发明方法的以NAD作为辅酶的GDH，没有特别限制，可以使用东洋纺织销售的市售品(GLD-311)。或者，可以使用种种常规方法进行制备。
可以应用于本发明方法中的GDH，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，可以在上述例示过的酶中进一步使其氨基酸残基一部分发生缺失或被其它的氨基酸残基取代，也可以添加其它氨基酸残基。
这样的改变可以使用该技术领域中的常规技术，由本领域技术人员很容易地实施。例如，为了在蛋白质上引入部位特异的变异，可以采用置换或插入编码该蛋白质的基因的碱基序列的种种方法，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York一书中有记载。
例如，将上述产生GDH的天然微生物或编码天然GDH的基因，直接或使其变异后，插入表达用载体(多数是该技术领域中已知的，例如质体)，培养转化到适当宿主(多数是该技术领域中已知的，例如大肠菌)中得到的转化子，用离心分离等方法从培养液中回收菌体后，用机械的方法或溶菌酶等酶的方法将菌体破碎，另外，根据需要，可添加EDTA等螯合剂和表面活性剂等进行使其可溶化，可以得到含有GDH的水溶性部分。或者，通过使用适当的宿主载体系统，可以使表达的GDH直接分泌在培养液中。
如上所述操作得到的含GDH溶液，可以通过例如减压浓缩、膜浓缩、进一步进行的硫酸铵、硫酸钠等的盐类析处理或利用亲水性有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙酮等分级沉淀法进行沉淀。另外，加热处理和等电点处理也是有效的纯化手段。另外，通过利用吸附剂或凝胶过滤剂等的过滤、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和性色谱法，可以得到纯化了的GDH。该纯化酶制品应达到在电泳(SDS-PAGE)时显示单一条谱带的程度。
上述工序前后，为了提高全酶型GDH在整个GDH酶蛋白质中所占的比例，可以在25～50℃、最好在30～45℃进行加热处理。
本发明中的GDH的浓度没有特别限制，因酶的特性等不同其适宜范围不同，在实用上，本领域技术人员可以判断使用该酶能充分可靠地进行葡萄糖测定时，该浓度即可。
例如，本发明中的PQQGDH的浓度没有特别限制，在溶液中，可以为0.1～100U/mL，较好为1～50U/mL，更好为2～10U/mL。粉末或冷冻干燥剂型最好是有相同程度的浓度，但用粉剂型制品配制，可使其浓度为100U/mL以上。
例如，本发明中的NADGDH的浓度没有特别限制，在溶液中，可以为10～1000U/mL，较好为20～500U/mL，更好为50～150U/mL。用粉末或冷冻干燥制剂最好有相同程度的浓度，但用粉剂型制品配制，可以使其浓度为1000U/mL以上。
例如，本发明中的FADGDH的浓度没有特别限制，在溶液中，可以为0.01～100U/mL，较好为0.1～50U/mL，更好为0.2～10U/mL。用粉末或冷冻干燥制剂最好有相同程度的浓度，但用为粉剂型制品配制时，可以使其浓度为100U/mL以上。
培养上述微生物的培养基，只要是微生物能生长且能产生本发明所述GDH的，就没有特别限制，含有适合微生物生长所必须的碳源、无机氮源及/或有机氮源的培养基即可，适于通气搅拌的液体培养基则更好。在液体培养基中，碳源例如有葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源例如有铵盐类类、硝酸盐类类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、牛肉膏、脱脂大豆、马铃薯提取液等。另外，也可以根据需要含有其它营养素(例如，氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等无机盐类、维生素类等)。
培养方法依照该领域中已知的常规方法。例如，在含有上述营养素的液体培养基中，接种微生物的胞子或生长状态的菌体，利用静置或通气搅拌，使菌体增殖，最好是通气搅拌培养。培养液的pH可以为5～9，较好为6～8。温度通常为14～42℃，较好为20℃～40℃。通常继续培养14～144小时，最好在各种培养条件下GDH的表达量达到最大时刻结束培养。确定这种时刻的方法，是采集培养液测定培养液中的GDH活性，监控其变化，随时间变化的GDH活性不再上升时刻的活性当作峰值，停止培养即可。
从上述培养液中抽提GDH的方法，当回收菌体内蓄积的GDH时，，用离心分离或过滤等操作只收集菌体，使该菌体再悬浊在溶剂、最好是水或缓冲液中。用常规的方法破碎悬浊了的菌体，可以将菌体中的GDH抽提至溶剂中。破碎的方法可以使用溶菌酶，另外也可以使用物理的破碎方法。至于溶菌酶，只要是具有消化真菌细胞壁能力的物质，并无特别限定，可以应用的酶例如有SIGMA公司“Lyticase”等。另外，物理破碎的方法例如有超声波破碎、玻璃珠破碎、弗氏细胞压碎器(フレンチプレス)破碎等。破碎处理后的溶液，利用离心分离或过滤除去残渣，可以得到GDH粗抽提液。
另外，本发明中的培养方法也可以采用固体培养。可以通过适当控制温度和湿度等在小麦等的麸皮上，培养能产生本发明的GDH的真核微生物。这时，可以静置培养，也可以通过搅拌等手段混合培养物。GDH的抽提通过以下方法进行在培养物中加入溶剂、可以是水或缓冲液，使GDH溶解，利用离心分离或过滤除去菌体和麦麸等固形成份。
GDH的纯化可以根据存在GDH活性的部分通过适当组合通常使用的各种分离技术来进行。上述GDH的抽提液，可以适当选择利用例如盐类析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、非改性PAGE、SDS-PAGE、离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、亲和性色谱法、逆相高速液体色谱法、等电点聚焦电泳等常规的方法进行酶的分离。
本发明的提高GDH的热稳定性的方法的一种形态，包含在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使(1)该酶和(2)选自糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质中的任一种以上化合物共存的工序。
添加的化合物可以是例如选自甘露醇、肌醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、缬氨酸、组氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、肌醇、甘油酸钙、琥珀酸、氯化钾、氯化铵、柠檬酸氢二铵、富马酸、丙二酸、庚二酸、3-3’二甲基戊二酸、赖氨酸、苯二甲酸、马来酸、戊二酸、硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、牛血清白蛋白(BSA)中的任一种以上化合物。
这些共存的各种化合物的浓度没有特别限制，在溶液中，可以为0.001～30重量％，较好为0.01～5％，更好为0.01～1％。如果是粉末或冷冻干燥制剂也希望是同程度的浓度，但在粉末或冷冻干燥制剂中，和溶液中相比，有添加更低浓度的化合物即可发挥其有效性的趋势。
需要说明的是，实施例中记载的化合物的浓度，是和GDH酶共存保存时的最终浓度。最佳组合有如将性质相近的盐类类化合物加以组合、例如将含羧酸化合物加以等量组合等，还可以将盐类化合物和含羧酸化合物等组合，使其相互效果互补。
在上述形态中，为了进一步提高热稳定性，可以保持组合物的pH在7以下的酸性。或者，可以含有琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苯二甲酸、马来酸等二羧酸、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵等的盐类化合物。
提高本发明的GDH热稳定性方法的另一形态，包含是在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在7以下的酸性的工序，从而使该组合物的热稳定性比在pH7.3以上时更高。
提高本发明的GDH热稳定性方法的再一种形态，是在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在3.1～7.0的工序，从而使该组合物的热稳定性比在pH为7.4时更高。
pH可以为3.1～7.0，较好为4.0～6.5，更好为4.0～6.0。
上述组合物与在4℃保存过的该组合物相比，在50℃处理15分钟，残存10％以上的GDH活性。或在含有以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，与在4℃保存过的该组合物相比，在50℃处理15分钟时，残存45％以上的GDH活性。
在上述形态中，组合物中可以含有一种以上的二羧酸、盐类化合物。二羧酸例如有琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苯二甲酸、马来酸，盐类化合物例如有氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵等。在本发明中，可以含有这些化合物中的一种以上。
这些共存的各种化合物的浓度没有特别限制，在溶液中合，可以为1mM～10M，较好为5mM～5M，更好为20mM～1M。在制备粉末或冷冻干燥制剂时，通过对含有和溶液中同等程度化合物浓度的成分进行干燥处理可以得到具有同样效果的干燥制剂。
需要说明的是，实施例中记载的化合物的浓度，是和GDH酶共存保存时的最终浓度。最佳组合例如在性质相近的盐类化合物中的组合、含羧酸化合物之间的等量组合等，例如可以将盐类化合物和含羧酸化合物等加以组合，使其相互效果互补。
在上述形态中，为了进一步提高热稳定性，其可以含有糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质，例如甘露醇、肌醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、缬氨酸、组氨酸、苯基丙氨酸、亮氨酸、肌醇、甘油酸钙、琥珀酸、氯化钾、氯化铵、柠檬酸氢二铵、富马酸、丙二酸、庚二酸、3-3’二甲基戊二酸、赖氨酸、苯二甲酸、马来酸、戊二酸、硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、牛血清白蛋白(BSA)等化合物。
另外，本发明的包含GDH的组合物可以以液体状态提供，可以利用冷冻干燥、真空干燥或喷雾干燥等进行粉末化。这时，GDH可以使用溶解在缓冲液等液体中的形态，而且可以添加本发明中使用的上述化合物以外的糖、糖醇类、氨基酸、蛋白质、肽类等作为赋形剂或稳定剂。还可以在粉末化后进一步进行造粒。这样的物质例如有海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、赤藓醇、甘油等为代表的糖、糖醇类；谷氨酸、精氨酸等为代表的氨基酸、牛血清白蛋白、卵清白蛋白和以伴侣蛋白等为代表的蛋白质和肽类等。
用于如上所述的GDH的抽提·纯化·粉末化及稳定性试验中应用的缓冲液的组成，没有特别限制，可以是在pH为5～8的范围具有缓冲能力的物质，例如硼酸、Tris-盐酸、磷酸钾等缓冲剂和称为BES、Bicine、Bis-Tris、CHES、EPPS、HEPES、HEPPSO、MES、MOPS、MOPSO、PIPES、POPSO、TAPS、TAPSO、TES、Tricine等的缓冲剂试剂盒。
这些物质中，可以单独使用一种，也可以使用两种以上。还可以是包含上述以外的一种以上的复合组成物。
另外，这些缓冲剂的添加浓度，只要是在具有缓冲能力的范围内，无特别限定，但上限可以在100mM以下，更好为50mM以下。最佳下限为5mM以上。
粉末或冷冻干燥制剂中缓冲剂的含量，没有特别限定制，使用范围可以为0.1％(重量比)以上，更好是在0.1～30％(重量比)。
这些缓冲剂可以使用各种市售试剂。
如上所述的各种化合物可以在测定时添加，也可以在制作后述的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖检测测试剂盒或葡萄糖传感器时预先包含。还可以在GDH的抽提·纯化和粉末化等各制造工序中添加至加工液中。需要说明的是，这时，与液体状态、干燥状态等形态无关，只要使其测定时能发挥作用就可以。
本发明中所谓的热稳定性的提高，是指将包含GDH酶的组合物在某一定温度处理一定时间后，保持的GDH酶的残存率(％)增大。在本发明申请中，将几乎完全维持活性的4℃保存样品设为100％，将其和在一定温度处理一定时间后的GDH溶液的活性值进行比较，算出其酶的残存率。该残存率和不添加该化合物时的相比增大，则判定为GDH的热稳定性提高了。
具体来讲，稳定性是否提高的判断是如下进行的。
在后述GDH酶活性的测定方法中记载的活性测定法中，测定4℃保存过的溶液的GDH活性值(a)和在一定温度热处理一定时间后的GDH活性值(b)，求出以测定值(a)为100时的相对值((b)/(a)×100)。将该相对值设定为残存率(％)。然后，将有无添加该化合物时的残存率进行比较，由于添加而使残存率增大时，判断为稳定性提高了。
本发明的效果在包含介体的体系中更加显著。可以适用于本发明方法的介体没有特别限定，例如N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)和2，6-二氯苯酚靛酚(DCPIP)的组合、PMS和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)的组合、单独的DCPIP、单独的铁氰化物离子(化合物为铁氰化钾等)、单独的二茂铁等。其中最佳的是铁氰化物离子(铁氰化钾等作为化合物)。
由于这些介体在灵敏度上存在很大差异，因此，添加浓度不必统一规定，但通常希望添加1mM以上。
这些介体可以在测定时添加，也可以在制备后述的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖检试剂盒或葡萄糖传感器时，使其预先含有。需要说明的是，这时，与液体状态、干燥状态等形态无关，只要在测定时反应时使其离解成离子状态就可以。
本发明中，可以进一步根据需要使与各种成分共存。例如，可以添加表面活性剂、稳定剂、赋形剂等。
例如，选自谷氨酸、谷氨酰胺及赖氨酸中的氨基酸，可以是一种或两种以上。在此，还可以含有牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)。
对于PQQGDH，通过添加例如钙离子或其盐、以及谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸等氨基酸类、还有血清白蛋白等，可以使PQQGDH更加稳定。
例如，通过含有钙离子或钙盐类，可以使PQQGDH稳定化。钙盐类例如有氯化钙、醋酸钙、柠檬酸钙等无机酸或有机酸的钙盐类等。另外，在水性组合物中，钙离子的含量优选为1×10-4～1×10-2M。
由于含有钙离子或钙盐而使PQQGDH稳定化效果，会由于含有选自谷氨酸、谷氨酰胺及赖氨酸中的氨基酸而进一步提高。选自谷氨酸、谷氨酰胺及赖氨酸中的氨基酸，可以是一种或两种以上。在此基础上，还可以进一步含有卵清白蛋白(OVA)。
或者，通过使它们与(1)选自天冬氨酸、谷氨酸、α-氧代戊二酸、苹果酸、α-氧代葡萄糖酸、α-环状糊精及其盐类中的一种或两种以上化合物及(2)白蛋白共存，可以使PQQGDH稳定化。
本发明中，可以利用以下各种方法测定葡萄糖。
本发明的葡萄糖测定用试剂、葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器，可以是液态(水溶液、悬浊液等)，真空干燥和喷雾干燥的粉末状态，冷冻干燥制剂等各种形态。干燥方法没有特别限制，可以依照常法进行。包含本发明的酶的组合物不限于冷冻干燥制剂，也可以是将干燥的组合物再溶解后的溶液状态。
在本发明中，可以利用以下各种方法测定葡萄糖。
葡萄糖测定用试剂本发明的葡萄糖测定用试剂，典型的包含GDH、缓冲液、介体等测定必须的试剂、用于制作标准曲线的葡萄糖标准溶液、以及使用指南。本发明的试剂盒可以例如冷冻干燥试剂，或溶解在适当保存溶液中的溶液形态提供。最好以全酶形态提供本发明的GDH，但也可以以脱辅基酶的形态提供，使用时进行全酶化。
葡萄糖检测试剂盒本发明的特征还在于，包含依照本发明制成的GDH的葡萄糖检测试剂盒。本发明的葡萄糖检测试剂盒包含至少足够进行1次检测的量的根据本发明得到的GDH。典型的试剂盒包含除本发明的GDH外还含有检测必须的缓冲液、介体、用于制作标准曲线的葡萄糖标准溶液、以及使用指南。依照本发明得到的GDH可以以各种形态提供，例如可以制成冷冻干燥试剂，或制成溶解在适当保存溶液中的溶液。最好以全酶本发明的GDH形态提供，但也可以以脱辅基酶的形态提供，使用时进行全酶化。
葡萄糖传感器本发明的特征还在于，使用根据本发明得到的GDH的葡萄糖传感器。电极使用碳电极、金电极、铂电极等，在该电极上固定本发明的酶。固定化方法有使用交联试剂的方法、包埋在高分子间质中的方法、用透析膜覆盖的方法、光交联性聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等，或者也可以和介体一起固定在聚合物中或吸附固定在电极上，也可以将这些方法组合使用。最好是将本发明的GDH以全酶形态固定在电极上，但也可以以脱辅基酶的形态固定，在另外的层次上或在溶液中提供辅酶。典型的产品是用戊二醛将本发明的GDH固定在碳电极上后，用具有氨基的试剂进行处理，将戊二醛封闭。
葡萄糖浓度的测定可以按如下操作进行。在恒温小池中加入缓冲液，加入介体并维持一定温度。作用电极使用固定化过的本发明GDH的电极、并使用对偶电极(例如铂电极)及参比电极(例如Ag/AgCl电极)。在碳电极上施加一定的电压，电流稳定后，加入包含葡萄糖的试样，测定其电流的增加。依照用标准浓度的葡萄糖溶液制作的标准曲线，可以计算试样中葡萄糖浓度。
实施例下面，根据实施例对本发明进行更详细地说明。
实施例1PQQ依存型葡萄糖脱氢酶基因的表达质粒的构建野生型PQQ依存型葡萄糖脱氢酶的表达质粒pNPG5，是在pBluescript SK(-)的多克隆(マルチクロ一ニング)部位插入了编码鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMBI1517菌株由来的PQQ依存型葡萄糖脱氢酶的结构基因的质粒。其碱序列如序列编号2所示，从该碱序列推定的PQQ依存型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如序列编号1所示。
将5μg pNPG5的DNA用限制酶BamH I及Xho I(东洋纺织制)切断，分离变异型PQQ依存型葡萄糖脱氢酶的结构基因部分。将分离的DNA和用BamH I及Xho I(东洋纺织制)切断了的pTM33(1μg)、1单位T4DNA连接酶，一同在16℃反应16小时，将DNA连结。用连结后的DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。将得到的表达质粒命名为pNPG6。
实施例2假单胞菌杆属细菌的转化子的制备将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)TE3493(微工研寄12298号)用LBG培养基(LB培养基+0.3％甘油)在30℃培养16小时，利用离心分离(12000rpm，10分钟)回收菌体，在该菌体中加入冰冷的含有300mM蔗糖的5mM K-磷酸缓冲液(pH7.0)8ml，悬浊菌体。再次利用离心分离(12000rpm，10分钟)回收菌体，在该菌体中加入冰冷的含有300mM蔗糖的5mM K-磷酸缓冲液(pH7.0)0.4ml，悬浊菌体。
在该悬浊液中加入实施例1中得到的表达质粒pNPG6 0.5μg，利用电穿孔法进行了转化。从含有100μg/ml的链霉素的LB琼酯培养基上生长出的菌落中，得到所需要的转化子。
实施例3PQQ依存型GDH制品的制备将500ml的Terrlfic broth(TB)培养基分注至2L坂口烧瓶中，在121℃进行20分钟的高压灭菌，放冷后，添加另外进行过无菌过滤的链霉素，使其浓度为100μg/ml。在该培养基中接种事先在含有100μg/ml链霉素的PY培养基上30℃培养了24小时的恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)TE3493(pNPG6)菌株的培养液5ml，30℃通气搅拌培养40小时。培养结束时的PQQ依存型葡萄糖脱氢酶活性，按前述活性测定方法，每1ml培养液约为30U/ml。
将上述菌体离心分离，收集菌体，在20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中悬浊后，利用超声波处理进行破碎，再进行离心分离，得到上清液作为粗酶液。将得到的粗酶液利用HiTrap-Sp(AMERSHAM-PHAMACIA)离子交换柱色谱法进行分离纯化。然后，用10mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)透析后，添加氯化钙使其最终浓度为1mM。最后，利用HiTrap-DEAE(AMERSHAM-PHAMACIA)离子交换柱色谱法进行分离纯化，得到纯化酶制品。利用本方法得到的纯酶，SDS-PAGE基本上显示单一的条带。
将这样操作得到的纯化酶用于评价PQQ依存型GLD。
实施例4NAD依存型GDH制品的制备NAD依存型GDH酶制品使用东洋纺织制造的市售产品(GLD-311)。
实施例5FAD依存型GDH制品的制备使用土曲霉(Aspergillus tcerreus)亚种和薄刺青霉(Penicilliumlilacinocchinulatum)NBRC6231(自独立行政法人产品制品评审技术基础机构购入)作为FAD依存型GDH生产菌，将各个冷冻干燥菌种分别接种在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Difco制)上，25℃保温活化。将被活化平板上的菌丝连带琼脂一起回收，在过滤灭菌水中悬浊。在2个10L小型发酵罐(ジヤ一ファ一メンタ一)中配制生产培养基(1％麦芽汁、1.5％大豆蛋白胨、0.1％MgSO4·7H2O、2％葡萄糖、pH6.5)6L，在120℃进行15分钟的高压灭菌后，分别投入上述菌丝悬浊液，开始培养。培养条件为温度30℃、通气量2L/分钟、以380rpm进行搅拌。从培养开始到64小时后停止培养，利用吸滤过滤器分别将各菌株的菌丝体吸滤收集到滤纸上。将培养液5L用截留分子量10000的超滤用中空纤维膜块浓缩至1/10量，在浓缩液中分别添加硫酸铵，使其最终浓度为60％饱和度(456g/L)。然后，用日立高速冷却离心机，进行8000rpm、15分钟的离心分离，使残渣沉淀后，使上清吸附在Octyl-Sepharose柱上，用0.6～0.0饱和度的硫酸铵进行梯度洗脱，回收有GDH活性的部分。得到的GDH溶液用G-25琼脂糖柱进行凝胶过滤回收蛋白质部分，将得到的GDH溶液脱盐，在脱盐液中添加相当于0.6饱和度的硫酸铵使蛋白质溶解。将蛋白质溶液吸附在Phenyl-Sepharose柱上，用0.6～0.0饱和度的硫酸铵进行梯度洗脱，回收有GDH活性的部分。再将得到的GDH溶液用G-25琼脂糖柱进行凝胶过滤回收蛋白质部分，得到的纯化酶作为FAD依存型GLD评价制品使用。
本发明的葡萄糖测定用组合物、葡萄糖检测试剂盒、葡萄糖传感器，或用于葡萄糖测定方法的介体，没有特别限定，但最好使用2，6-二氯苯酚-靛酚(2，6-dichiorrophenol-indophenol，略称DCPIP)、二茂铁或它们的衍生物(例如，铁氰化钾、N-甲基吩嗪甲基硫酸盐等)。这些介体可以由市场购买到。
试验例1PQQ依存型GDH活性的测定方法在本发明中，PQQ依存型GDH的活性测定在以下条件下进行。
测定原理D-葡萄糖+PMS+PQQGDH→D-葡萄酸-1，5-内酯+PMS(red)PMS(red)+DCPIP→PMS+DCPIP(red)由于N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)(red)还原2，6-二氯苯酚-靛酚(DCPIP)形成了DCPIP(red)，用分光光度计在600nm波长下进行测定。另外，在底物特异性的研究中，D-葡萄糖更换成其它糖类测定对各种底物的特异性。
单位定义1单位是指在下面记载的条件下，每1分钟形成1.0毫摩尔DCPIP(red)的PQQGDH酶量。
方法试剂
A.D-葡萄糖溶液1.0M(1.8g，D-葡萄糖(分子量180.16)/10ml H2O)B.PIPES-NaOH缓冲液，pH6.550mM(60mL水中悬浊的1.51gPIPES(分子量302.36)溶解于5N NaOH中，加入2.2ml的10％TritonX-100，在25℃，用5N NaOH调整pH至6.5±0.05，加水至100ml)C.PMS溶液24mM(73.52mg N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(分子量817.65)/10ml H2O)。
D.DCPIP溶液2.0mM(6.5mg氯化硝基四氮唑蓝(分子量817.65)/10ml H2O)。
E.酶稀释液含1mM CaCl2、0.1％Triton X-100、0.1％BSA的50mMPIPES-NaOH缓冲液(pH5.5)操作步骤1.在深色瓶中配制以下的反应混合物，在冰上贮藏(用时配制)4.5ml D-葡萄糖溶液 (A)21.8ml PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5) (B)2.0ml PMS溶液 (C)1.0ml DCPIP溶液(D)上述检测混合物的反应液中的浓度如下PIPES缓冲液 36mMD-葡萄糖 148mMPMS 1.58mMDCPIP0.056mM2.将3.0ml的反应混合物装入试管(塑料制)，在37℃预热5分钟。
3.加入0.1ml的酶溶液，平稳地将试管翻转混合。
4.维持37℃，用分光光度计记录4～5分钟在600nm波长下的相对于水的吸光度的减少，从曲线的初期直线部分计算每1分钟的ΔOD(OD测试)。
同时，除加入酶稀释液(E)替代酶溶液以外，重复同样的方法，测定空白样品(ΔOD空白)。
临检测之前用冰冷的酶稀释液(E)中溶解酶粉末，用同一缓冲液稀释至0.05-0.10U/ml(由于该酶的附着性，最好使用塑料管)。
为了评价底物特异性，以替代葡萄糖溶液的其它种类的糖溶液为底物，进行上述活性测定操作。
计算用下面的公式计算活性U/ml＝{ΔOD/min(ΔOD测试-ΔOD空白)×Vt×df}/(16.8×1.0×Vs)U/mg＝(U/ml)×1/CVt总体积(3.1ml)Vs样品体积(0.1ml)16.8在上述测定条件的DCPIP的毫摩尔分子吸光系数(cm2/微摩尔)1.0光径(cm)df稀释系数C溶液中的酶浓度(c mg/ml)试验例2NAD依存型GDH活性的测定方法在本发明中，NAD依存型GDH的活性测定在以下条件下进行。需要说明的是，NAD依存型GDH酶制品使用的是东洋纺织生产的葡萄糖脱氢酶(GLD-311)。
测定原理D-葡萄糖+NAD+→D-葡萄酸-1，5-内酯+NADH+H+用在340nm的吸光度的变化来测定NADH的生成量。
单位的定义1单位是指在下面记载的条件下，每1分钟使NADH形成1.0微摩尔NADGDH的酶量。
方法试剂A.D-葡萄糖溶液1.5M(2.7g，D-葡萄糖(分子量180.16)/10ml H2O)B.Tris-HCl缓冲液，pH8.0 100mM(将90mL水中悬浊的1.21gTris(分子量121.14))，在25℃、用5N HCl调整pH至8.0±0.05，加水至100ml)C.NAD溶液8％(80mg NAD(分子量717.48)/ml H2O)D.酶稀释液磷酸钾缓冲液(pH7.2)操作步骤1.在深色瓶中配制以下的反应混合物，在冰上贮藏(用时配制)0.9ml D-葡萄糖溶液 (A)7.8ml Tris-HCl缓冲液(pH8.0) (B)0.3ml NAD溶液 (C)上述检测混合物的反应液中的浓度如下D-葡萄糖148mMTris-HCl缓冲液 77mMNAD 0.26％2.将3.0ml反应混合物装入试管(塑料制)，在37℃预热5分钟。
3.加入0.05ml的酶溶液，平稳地进行翻转混合。
4.维持37℃，用分光光度计记录在340nm波长下相对于水的吸光度的变化4～5分钟，从曲线的初期直线部分计算每1分钟的ΔOD(OD测试)。
同时，除加入酶稀释液(D)替代酶溶液以外，重复同样的方法，测定空白样品(ΔOD空白)。
临检测之前用冰冷的酶稀释液(D)中溶解酶粉末，用同一缓冲液稀释至0.05-0.70U/ml(由于该酶的附着性，最好使用塑料管)。
为了评价底物特异性，以替代葡萄糖溶液的其它种类的糖溶液为底物，进行上述活性测定操作。
计算用下面的公式计算活性U/ml＝{ΔOD/min(ΔOD测试-ΔOD空白)×Vt×df}/(6.22×1.0×Vs)U/mg＝(U/ml)×1/CVt总体积(3.05ml)Vs样品体积(0.05ml)6.22NADH的毫摩尔分子吸光系数(cm2/微摩尔)1.0光径(cm)df稀释系数C溶液中的酶浓度(c mg/ml)试验例3FAD依存型GDH活性的测定方法在本发明中，NAD依存型GDH的活性测定在以下条件下进行。
<试剂>
50mM PIPES缓冲液pH6.5(含0.1％Triton X-100)14mM 2，6-二氯苯酚靛酚(DCPIP)溶液1M D-葡萄糖溶液将上述PIPES缓冲液15.8ml、DCPIP溶液0.2ml、D-葡萄糖溶液4ml混合作为反应试剂。
<测定条件>
将反应试剂2.9ml在37℃预先保温5分钟。添加GDH溶液0.1ml，慢慢混合后，以水为对照用37℃控温分光光度计，在600nm波长下记录5分钟的吸光度变化，测定从直线部分开始1分钟的吸光度变化(ΔOD测试)。空白检测是在试剂混合液中加入溶解GDH的溶剂替代GDH溶液，同样测定1分钟的吸光度变化(ΔOD空白)。根据这些数值，依照下式求出GDH活性。在此，所谓1单位(U)GDH活性的定义是，在浓度200mM的D-葡萄糖存在下，1分钟期间还原1微摩尔的DCPIP的酶量。
活性(U/ml)＝{-(ΔOD测试-ΔOD空白)×3.0×稀释倍数}/(16.3×0.1×1.0)需要说明的是，式中的3.0表示反应试剂+酶溶液的液体量(ml)、16.3是在本活性测定条件中的毫摩尔分子吸光系数(cm2/微摩尔)、0.1是酶溶液的液量(ml)、1.0是比色池的光径(cm)。
研究了3种利用不同辅酶的GDH，在不同条件下的热稳定性的提高情况。例如，在以下的实施例6-8中，PQQGDH在用pH6.5的缓冲液配成5U/ml的酶液中于50℃热处理16小时后，比较残存的PQQGDH活性，确认提高了热稳定性。同样，NADGDH在用pH7.2的缓冲液配制成85U/ml的酶液中于50℃热处理1小时后，比较残存的NADGDH活性，确认提高了热稳定性。同样地，FADGDH在用pH7.2的缓冲液配制成5U/ml的酶液中于55℃热处理15～30分钟后，比较残存的FADGDH活性，确认提高了热稳定性。
另外，在以下的实施例9及10中，实测用50mM的各种缓冲液配制成的酶液组合物(0.4～5.1U/ml)的pH后，进行50℃15分钟50℃30分钟、55℃15分钟或55℃30分钟热处理，测定其GDH活性，算出活性残存率(％)。通过比较该活性残存率，确认了热稳定性的提高。
实施例6用作葡萄糖测定体系统的热稳定性的确认1
根据前述试验例1的PQQGDH活性测定方法进行了研究。另外，为了测定也包含脱辅基酶型形态的PQQGDH的酶活性，用添加了最终浓度为860nM的PQQ的反应混合液测定活性。
首先，准备50ml用50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5))溶解的PQQGDH浓度为5.0U/ml的酶稀释液(包含1mM CaCl2、0.1％TritonX-100、0.1％BSA的溶液)。在该酶溶液0.33ml中，添加0.1ml表1、2记载的10倍浓度的各种化合物，再添加表1、2记载的基础缓冲液、总容量为1.0ml，同样准备2份。另外，为了对照，准备2份添加蒸馏水0.1ml替代各种化合物的溶液。这两份样品，一份在4℃保存16小时，另外一份在50℃处理16小时。处理后，用酶稀释液将各样品稀释10倍，再测定PQQGDH活性。以4℃保存16小时的酶活性为100，和在50℃处理16小时的活性值比较，算出相对值(％)。
可以看出，在PQQGDH组合物中，由于与表1、2所示的全部化合物共存，提高了热稳定性。在以磷酸钾缓冲液为基础的溶液中，添加琥珀酸、庚二酸、二甲基戊二酸时，全酶型PQQGDH的热稳定性下降，可以认为这是由PQQ从该酶上脱落引起的。看到含有脱辅基酶的样品热稳定性提高了，可以认为这些化合物在维持酶自身立体结构上发挥了作用。
表1表示以PIPES缓冲液(pH6.5)为基础与各种化合物共存的PQQGDH组合物在50℃处理16小时后，PQQGDH活性的残存率(％)。
表2表示以苯二甲酸缓冲液(pH7.0)、磷酸钾缓冲液(pH7.0)为基础与各种化合物共存的PQQGDH组合物在50℃处理16小时后，PQQGDH活性的残存率(％)。
表1

表2

实施例7用作葡萄糖测定体系统的热稳定性的确认2根据前述试验例2的NADGDH活性测定方法进行了研究。
首先，准备50ml溶解在酶稀释液中的NADGLD(东洋纺织制GLD-311)、浓度约为250U/ml的的酶液。在该酶溶液0.33ml中，添加0.1ml表3记载的10倍浓度的各种化合物，再添加磷酸钾缓冲液(pH7.2)、总容量为1.0ml，同样准备两份。另外，为了对照，准备2份添加蒸馏水0.1ml替代各种化合物的溶液。这两份样品，一份在4℃保存16小时，另外一份在50℃处理1小时。处理后，用酶稀释液将各样品稀释50倍，测定NADGDH活性。以在4℃保存16小时的酶活性设为100，和在50℃处理1小时的活性值比较，算出活性残存率(％)。
其结果表明，所研究的全部二羧酸都可以看出效果。其中，添加琥珀酸或马来酸时，可以看到最高的热稳定性提高效果。
表3表示与各种化合物共存的NADGDH组合物在50℃处理1小时后NADGDH活性的残存率(％)。
表3

实施例8用作葡萄糖测定体系统的热稳定性的确认3根据前述试验例3的FADGDH活性测定方法进行了研究。
首先，准备50ml溶解在酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH7.2))中的由实施例5得到的FADGLD、使其成为浓度约10U/ml酶液。在该酶溶液的0.5ml中，添加0.5ml 1％或0.5％的BSA、总容量为1.0ml的溶液，同时准备两份。另外，准备各2倍浓度的表5、6记载的琥珀酸、丙二酸、苯二甲酸、马来酸、戊二酸、氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵，各加0.5ml、总容量为1.0ml的溶液，同样准备两份。为了对照，还准备2份添加蒸馏水0.1ml替代各种化合物的溶液。
这两份样品，一份在4℃保存16小时，另外一份在50℃处理30分钟的。处理后，用酶稀释液将各样品稀释21倍，测定FADGDH活性。分别以4℃保存16小时的酶活性设为100，和在50℃处理1小时的活性值比较，算出活性残存率(％)。
这些研究结果表明，通过添加蛋白质性的稳定剂(BSA)，FAD-GLD的热稳定性增大(表4)。另外，通过添加各种二羧酸化合物或各种盐类化合物，可以看出FAD-GLD的热稳定性的提高效果，其中，添加二羧酸化合物中的琥珀酸、丙二酸、盐类化合物中的硫酸钠时，可以看出最大的效果(表5、表6)。可以认为，在琥珀酸、丙二酸、硫酸钠中，只要添加数摩尔，就可以看到提高稳定性的效果。另外，由于用氯化钠等的单纯的盐类化合物可以看到充分的效果，因此，首先发现在FAD-GLD中，单靠提高离子强度即可实现热稳定化。
表4表示蛋白质性的稳定剂共存的FADGDH组合物在50℃处理30分钟后，FADGDH活性的残存率(％)。
表5表示和二羧酸化合物共存的FADGDH组合物在50℃处理30分钟后，FADGDH活性的残存率(％)。
表6表示和盐类化合物共存的FADGDH组合物在50℃处理15分钟后，FADGDH活性的残存率(％)。
表4

表5

表6

实施例9保持酸性pH提高GDH组合物热稳定性效果的研究根据前述试验例3的FADGDH活性测定方法进行了研究。
首先，准备10ml用酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5))溶解的实施例5中得到的两种FADGDH、浓度分别约为10U/ml的酶液。在该酶溶液0.2ml中，添加1.8ml 50mM磷酸钾缓冲液(pH4.3)、或50mM磷酸钾缓冲液(pH5.6)、或50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)，总容量为2.0ml。实测各种酶溶液的pH，其pH在5.6、6.0、7.2附近变动。准备2份样品，每份装入1ml，一份在4℃保存，另外一份在50℃进行热处理。处理后，用酶稀释液将各样品2倍稀释后，测定FADGDH活性。分别以4℃保存的酶活性设为100，和在50℃处理15分钟或30分钟的活性值比较，算出活性残存率(％)。
这些研究结果表明，使含GDH组合物的pH保持在酸性，含FADGLD的组合物热稳定性提高(表7)。
而且，为了研究更精确的pH条件，和前面的方法同样，用表8记载的各种缓冲液将酶液稀释10倍，在确认实测pH后，在50℃热处理15分钟，测定GDH活性，算出其残存率(％)。
其结果表明，含有来自土曲霉(Aspergillus terreus)亚种和薄刺青霉(Penicillium lilacinocchinulatum)NBRC6231菌株的任一种FAD-GLD的组合物，在pH3.14～6.97的范围内，比在pH7.4附近热稳定性提高(表8、图1、图2)。
在制作广泛采用GDH组合物的葡萄糖传感器的传感器探头时，有加热干燥的工序，维持含FADGDH的组合物在酸性，可使该组合物自身的稳定性提高，这对于提高采用FADGDH的传感器探头制品的稳定性、测定精度来讲，是非常重要的。
表7

用50mM磷酸钾缓冲液研究表8

实施例10在保持酸性pH的GDH组合物中使其与一种以上的盐类化合物或二羧酸共存而获得的提高该组合物的热稳定性效果的研究根据前述试验例3的FADGDH活性测定方法进行了研究。
首先，在50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，分别溶解硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵，使其浓度为1M。另外，准备20ml在酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5))溶解了实施例5中得到的两种FADGDH、使其浓度分别为约10U/ml的酶液。准备在4种化合物溶液中分别以1∶1混合了两种FADGDH的8种酶液样品(2ml)。另外，用不添加化合物的溶液作为空白对照，还准备将50mM磷酸钾缓冲液pH调整至6.25、6.25附近的对照酶液样品。测定各种酶液样品的实测pH，确认其维持在相当接近的pH范围。酶液样品每份分装1ml，共准备两份，一份在4℃保存，另外一份在55℃热处理30分钟。处理后，用酶稀释液将各样品稀释10倍后，测定FADGDH活性。各自将在4℃保存过的酶活性设为100％，和在55℃处理30分钟后的活性值比较，算出GDH活性残存率(％)。
这些研究结果表明，通过使含GDH组合物的pH保持在酸性，而且添加硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵等盐类化合物，可以得到高于使pH保持在酸性的对照酶液样品的热稳定性(表9)。
然后，用琥珀酸缓冲液将先前的两种FADGDH配制成pH5.3的酶液样品(5U/ml)中，添加等量的2M氯化钠或1M硫酸钠或1M柠檬酸三钠或1M硫酸铵而配成8种酶液样品(2ml)。另外，用不添加化合物溶液作为对照，还准备用50mM琥珀酸缓冲液(pH5.3)2倍稀释作为对照酶液样品。分别测定各种酶液样品的实测pH值，确认其维持在相当近的pH范围。分装酶液样品，每份样品1ml，共准备两份，一份在4℃保存，另外一份在55℃热处理30分钟。处理后，用酶稀释液将各样品稀释5倍后，测定FADGDH活性。各自将在4℃保存过的酶活性设为100％，和在55℃处理30分钟后的活性值比较，算出GDH活性残存率(％)。
这些研究结果可以确认，即使在pH为5左右的低pH条件下添加氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵等盐类化合物，也可以提高其热稳定性。像氯化钠之类特征不太明显的化合物，也能看出添加效果，由此可以推测，在借助与所有这些众多的盐类化合物共存，即可提高FADGDH组合物的热稳定性(表10)。
另外，发现使用琥珀酸缓冲液时，比以磷酸钾缓冲液为基础时有热稳定性提高的倾向，因此，推测包括琥珀酸缓冲液在内的二羧酸化合物和上述盐类化合物一样，具有提高热稳定性的效果。因此，使含GDH组合物的pH保持在酸性，而且添加二羧酸化合物，研究了热稳定性是否改变。
首先，准备好100mM醋酸钠(pH5.0)和100mM磷酸钾缓冲液(pH5.6)作为基础缓冲液。另外，准备20ml溶解在酶稀释液(50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5))中的实施例5中得到的两种FADGDH、浓度分别为约10U/ml的的酶液。然后，配制0.4M琥珀酸(用NaOH调整pH为7.0)、0.4M丙二酸(用NaOH调整pH为7.0)、0.4M戊二酸(用NaOH调整pH为7.0)。
使基础缓冲液0.8ml和酶液(10U/ml)0.2ml混合后，添加各种二羧酸化合物1ml，实测各自的pH。另外用不添加化合物，用蒸馏水替代二羧酸化合物的溶液作为对照，调整各样品的pH在实测值附近。分装酶液样品，每份样品1ml，共准备两份，一份在4℃保存，另外一份在55℃热处理30分钟。处理后，用酶稀释液将各样品两倍稀释后，测定FADGDH活性。各自将在4℃保存过的酶活性设为100％，和在55℃处理30分钟后的活性值比较，算出GDH活性残存率(％)。
这些研究结果可以确认，在pH为5.5或5.0左右的pH条件下中通过添加琥珀酸、丙二酸、戊二酸等二羧酸化合物，可以提高其热稳定性。根据以上结果推测借助与这些众多的二羧酸化合物共存，即可提高FADGDH组合物的热稳定性(表11)。
表9

用50mM磷酸钾缓冲液研究表10

用50mM磷酸钾缓冲液研究表11

*1使用醋酸钠缓冲液*2使用磷酸钾缓冲液实施例11用作葡萄糖测定系统的保存稳定性的确认根据前述试验例1的PQQGDH活性测定方法进行了研究。另外，为了测定包括脱辅基酶型形态的PQQGDH的酶活性，用添加了最终浓度为860nM的PQQ的反应混合液测定活性。
首先，准备10ml用酶稀释液(包含1mM CaCl2、50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5))溶解的浓度为5.0U/ml的PQQGDH。在该酶溶液0.54ml中，添加0.1ml表12记载的10倍浓度的各种化合物，总容量为0.6ml，同样准备3份。另外，为了对照，准备3份添加蒸馏水0.06ml替代各种化合物的溶液。将准备好的管形瓶进行冷冻干燥(FDR)，使其水分完全蒸发后，立即测定对照管形瓶中样品的活性。另一方面，测定样品的管形瓶在25℃、湿度70％条件下处理6小后，在37℃保存，测定1周后或2周后的残存活性。以FDR之后的活性值为100％，根据各测定样品的活性值算出活性残存率(％)。活性残存率变高者，判断为保存稳定性提高。
由于可以看出添加琥珀酸、氯化铵、丙二酸，有抑制全酶化率降低的效果，也可以看出粉末稳定性的提高。比较是否添加化合物时形成粉末时的形状的不同，很容易预想添加了化合物时粉末颗粒呈紧缩状态，因而其吸湿耐性增大。这次的研究中，受材料来源所限，虽然只研究了几种含羧酸化合物，但可以认为众多的各式各样的化合物也可以发挥同样效果。另外，推测粉末形状的变化与保存稳定性的增大有关，同样可以类推，对NAD-GLD、FAD-GLD也可以得到同样效果。
表12

工业实用性利用本发明对热稳定性的改良，可以提高葡萄糖测定试剂、葡萄糖检测试剂盒及葡萄糖传感器的保存稳定性、测定精度。
序列表<110>东洋纺织株式会社(Toyo Boseki Kabushiki Kai sha)<120>提高含有水溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物热稳定性的方法(Method for improving heat stability of the composition containingwater soluble coenzyme-bound glucose dehydrogenase)<130>SPI060948-47<160>2<170>Patentln version3.1<210>1<211>455<212>PRT<213>Acinetobacter baumannii NCIMB11517<400>1Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ala Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Asn1 5 10 15Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu20 25 30Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly35 40 45Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Val Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Phe50 55 60Gln Val Pro Glu Ile Val Ser Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu65 70 75 80Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys His Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile85 90 95Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn100 105 110Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Thr Thr Asp Thr Phe115 120 125Glu Lys Pro Ile Asp Leu Ile Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His130 135 140Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr145150
155 160Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn165 170 175Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Ser Lys Asp Tyr180 185 190His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Val195 200 205Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr210 215 220Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Ala Pro Asn Gly Lys225 230 235 240Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu245 250 255Val Leu Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys260 265 270Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Thr Asn Lys275 280 285Ser Gln Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Ile Lys Val Ala Thr Gly290 295 300Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro305 310 315 320Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp325 330 335Pro Thr Cys Gly Glu Met Ala Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro340 345 350Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Thr Gly Gly Lys Lys Ala Ile Pro Gly Trp355 360 365Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg370 375 380Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Leu Asp Asp Ala Ile Pro385 390 395 400Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Glu405 410 415Gly Asn Thr Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys420 425 430
Asp Asp Gly Ser Val Thr His Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile435 440 445Lys Phe Thr Tyr Asn Gly Lys450 455<210>2<211>1368<212>DNA<213>Acinetobacter baumannii NCIMB11517<400>2gatatacctc tgacacctgc tcagttcgca aaagcgaaaa cagaaaattt tgataaaaaa60gtgattctgt ccaatttaaa taaaccacat gctttgttat gggggccaga taatcaaatt120tggttaaccg aacgtgcaac tggcaaaatt ttaagagtaa atcctgtatc tggtagcgcg180aaaacagtat ttcaggttcc tgaaattgtg agtgatgctg atgggcaaaa tggtttgtta240ggttttgctt ttcatcctga ctttaaacat aacccttata tctatatttc aggcactttt300aaaaatccaa aatctacaga taaagagtta cctaatcaga cgattattcg tagatatacc360tataataaaa ctacagatac atttgaaaag cctattgatt tgattgcagg tttaccgtca420tcaaaagatc atcagtctgg tcgtctcgtt attggtccag accaaaaaat ctactatacg480attggtgacc aaggtcgtaa tcagttagct tatctgttct taccgaatca ggcacagcat540actccgactc agcaagagct caatagtaaa gactaccata catatatggg taaagtatta600cgcttaaatc tggacggcag tgtacctaaa gacaacccaa gctttaacgg cgtagtgagt660catatctaca ctttagggca ccgtaatcca caaggtttag catttgcccc aaatggaaag720cttttacaat ctgagcaagg accaaattct gatgatgaaa ttaaccttgt attaaaaggt780ggtaactatg gctggccaaa tgtagctggt tataaagatg acagtggtta tgcctatgca840aactattcgg cagcaaccaa taaatcacaa attaaagatt tagctcaaaa cgggataaaa900gtagcaacag gtgttcctgt gactaaagag tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtgccg960cctttgaaaa ctttatatac ggtacaagat acctataact ataatgaccc tacttgtggt1020gagatggcat atatttgctg gccaacggtt gcaccgtcat cagcatatgt atatacggga1080ggcaaaaaag cgattccagg gtgggaaaat acattattgg tcccatcttt aaaacgtggg1140
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权利要求
1.一种提高葡萄糖脱氢酶(GDH)的热稳定性，使其比不与以下化合物共存时更高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该酶和选自糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质中的任一种以上化合物共存的工序。
2.如权利要求1记载的提高稳定性的方法，其中辅酶是吡咯并喹啉醌或黄素化合物，或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。
3.如权利要求1或2记载的提高了热稳定性的组合物，其中共存的各化合物的最终浓度为0.1％以上。
4.如权利要求1～3任一项记载的提高热稳定性的方法，其特征在于，所添加的化合物选自甘露醇、肌醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、半乳糖醇、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、肌醇、甘油酸钙、琥珀酸、氯化钾、氯化铵、柠檬酸氢二铵、富马酸、丙二酸、庚二酸、3-3，二甲基戊二酸、赖氨酸、苯二甲酸、马来酸、戊二酸、硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、牛血清白蛋白(BSA)中的任一种以上。
5.一种利用如权利要求1～4任一项记载的方法提高了热稳定性的含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物。
6.一种使用如权利要求5记载的组合物的葡萄糖浓度测定方法。
7.一种含有如权利要求6记载的组合物的葡萄糖传感器。
8.一种使GDH热稳定性比不与以下化合物共存时热稳定性提高的组合物的制造方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中，使该酶和选自糖醇、含羧基化合物、含碱金属化合物、碱土金属化合物、铵盐类、硫酸盐类、蛋白质中的任一种以上化合物共存的工序。
9.一种使组合物比在pH 7.3以上时热稳定性提高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在7以下的酸性的工序。
10.一种使组合物比在pH 7.4时热稳定性提高的方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在3.1～7.0的工序。
11.如权利要求9或10记载的提高组合物的热稳定性的方法，其中可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)是以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)。
12.如权利要求11记载的提高热稳定性的方法，其特征在于，以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)是由丝状真菌而来的。
13.一种其利用如权利要求9～12任一项记载的方法提高了热稳定性的组合物。
14.如权利要求13记载的含GDH组合物，其特征在于，含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物经50℃、处理15分钟时，与在4℃保存的该组合物相比，GDH活性残存10％以上。
15.如权利要求13记载的含GDH组合物，其特征在于，含有以黄素化合物为辅酶的葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物在50℃处理15分钟时，与在4℃保存的该组合物相比，GDH活性残存45％以上。
16.如权利要求13记载的组合物，其含有一种以上的二羧酸、盐类化合物。
17.如权利要求13记载的组合物，其含有氯化钠、硫酸钠、柠檬酸三钠、硫酸铵、琥珀酸、丙二酸、戊二酸、苯二甲酸、马来酸中一种以上的化合物。
18.一种使用如权利要求13记载的组合物的葡萄糖浓度测定方法。
19.一种含有如权利要求13记载的组合物的葡萄糖传感器。
20.一种比在pH 7.3以上时热稳定性提高的组合物的制造方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在7以下的酸性的工序。
21.一种比在pH 7.4时热稳定性提高的组合物的制造方法，包括在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶(GDH)的组合物中，使该组合物的pH保持在3.1～7.0的工序。
全文摘要
本发明通过在含有可溶性辅酶结合型葡萄糖脱氢酶的组合物中添加二羧酸或盐类化合物而提高热稳定性，可望提高葡萄糖测定试剂的测定精度。另外，通过将该组合物保持在酸性pH，该组合物可以达到能够加热干燥的高水平的热稳定性，可以提高葡萄糖测定试剂的保存稳定性、测定精度。
文档编号C12N9/96GK1962860SQ20061006782
公开日2007年5月16日 申请日期2006年3月13日 优先权日2005年11月10日
发明者北林雅夫 申请人:东洋纺织株式会社