专利名称：中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因检测方法及检测试剂盒，尤其涉及中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
牛繁育中遗传缺陷一般遵循常染色体隐性遗传，携带者不表现症状，但携带者公牛冻精一旦被大规模使用，隐性缺陷基因就会在牛群中快速传播。这给广泛应用人工授精技术的奶牛业造成了巨大的经济损失。
瓜氨酸血症(Citrullinemia，CN)是荷斯坦牛尿素循环发生代谢紊乱的一种常染色体单基因隐性遗传缺陷病。病牛体内由于缺乏尿素代谢过程中催化瓜氨酸生成精氨酸琥珀酸的关键酶——精氨酸琥珀酸合成酶，导致瓜氨酸不能转变为精氨酸琥珀酸而大量积蓄于组织及血液中，从而造成尿素循环发生代谢障碍，使氨无法转变为尿素排出体外，引发一系列神经症状。病牛出生时表现正常，但不久后出现精神沉郁、步态紊乱、惊厥、失明等症状，一般出生后5d死亡，死亡率100％。
Robinson等通过分析瓜氨酸血症(CN)个体的基因型发现，CN个体精氨酸琥珀酸合成酶外显子5发生C-T的点突变，使密码子CGA转变为终止密码子TGA，从而其翻译产物——精氨酸琥珀酸合成酶变成了截短了的85个AA的蛋白质(正常为412个AA)，而失去活性。由于该位点突变丢失了一个AvaII酶切位点，这为通过分子生物学方法检测奶牛群，尤其是种公牛的遗传缺陷，并淘汰携带个体，为提高我国奶牛遗传育种水平，培育更加优良的种公牛，提供了有效的检测指标。并且利用分子生物学方法对牛瓜氨酸血症基因进行检测，将成为奶牛育种中提高牛群种质的一个重要手段。
发明内容
本发明的目的是利用分子生物学方法提供一种中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法及检测试剂盒。
本发明采用PCR-RFLP及DNA测序技术建立了检测中国荷斯坦牛遗传缺陷——瓜氨酸血症的分子生物学方法，为我国提高奶牛遗传育种水平，培育更加优良的种公牛提供了有效的技术手段。
本发明所述中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法，包括牛血样品采集，基因组DNA提取，PCR扩增引物的设计，PCR扩增，限制性内切酶消化，凝胶电泳步骤；其特征在于所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR扩增反应体系为25μl；其中DNA模板1μl，50ng；10×buffer 2.5μl；dNTPs2.0μl；引物各0.5μl；Mg2+1.5μl；H2O 16.8μl；Taq酶0.5U；循环参数为95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，降温至4℃结束；所述限制性内切酶消化用限制性内切酶Eco471酶切。
上述中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法，所述经PCR-RFLP检测为杂合子的样品，对其PCR产物进行直接测序；经PCR-RFLP检测为纯合子的样品，PCR产物进行克隆测序。
本发明所述中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测试剂盒，其特征在于包括PCR试剂盒、RFLP试剂盒两部分，其中PCR试剂盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl组成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存温度-20℃；RFLP试剂盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA组成；保存温度-20℃。
本发明通过PCR-RFLP技术和DNA测序技术分析了精氨酸琥珀酸合成酶外显子5基因，建立了检测该基因发生突变的方法。在检测过程中，申请人发现AvaII酶市场价格较高，不利于大规模检测，经对所得序列进行酶切位点分析后，找到了一个AvaII的替代产品Eco471，该酶不仅价格便宜，而且酶切效果好，适于大规模检测。
为验证PCR-RFLP检测CN的准确性，申请人分别对检测纯合子个体及杂合子个体进行DNA测序。测序方法分别采用克隆测序和PCR测序。克隆测序结果表明，序列同源性达到99％，证明扩增到了所要研究的序列。克隆测序虽然有其优点，但在克隆挑选过程中不能保证所挑选的克隆是否为突变链，相反PCR能够保证测序所得的序列与模板一致，这对验证杂合子是十分有用的。经测序分析发现，精氨琥珀酸合成酶外显子5基因在编码第86位氨基酸的密码子处存在一个由CGA到TGA的终止点突变，进一步验证了本发明所建立的PCR-RFLP方法检测遗传缺陷的正确性和准确性。
由于隐性缺陷的隐性遗传方式，携带缺陷基因的杂合子表型正常。根据孟德尔理论，一旦两个杂合体交配，后代就会有四分之一个体隐性纯合而表现发病。这使得在广泛应用人工授精技术的奶牛业中对牛群尤其是种公牛遗传缺陷基因的研究、检测从而淘汰携带缺陷个体至关重要。在申请人所检测的公牛群中未发现瓜氨酸血症的杂合子，是由于这些公牛亲代均进行了遗传缺陷的检测，并证明是非携带者。
本发明利用PCR-RFLP方法成功建立了适于大规模检测奶牛遗传缺陷—瓜氨酸血症的检测方法以及检测试剂盒，对建立健全奶牛育种体系，剔除隐性缺陷基因，保证牛群种质，获得稳定的遗传进展，保持奶业的可持续发展，有着重要的意义。
图1精氨酸琥珀酸合成酶基因的PCR-RFLP分析，Eco471酶切PCR产物，4％琼脂糖凝胶上电泳，结果显示3，4号牛产生了98bp和79bp的两条泳带，为正常个体；1，2号牛由于发生C-T的点突变，丢失了Eco471酶切位点，产生177bp，98bp和79bp三条泳带，为CN杂合子。
图2精氨琥珀酸合成酶外显子5基因突变测序峰图，测序结果表明，杂合子牛精氨琥珀酸合成酶外显子5基因发生C-T单碱基突变。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。
1材料与方法1.1牛血样品采集济南市周边牛场荷斯坦母牛120头，山东奥克斯生物技术有公司荷斯坦种公牛50头；母牛随机采样，公牛要求三代系谱清楚且祖先均记录无CN。颈静脉采血5ml，加1ml抗凝剂(ACD)。
1.2基因组DNA提取按常规酚氯仿法提取基因组DNA。
1.3引物序列引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.4应用本发明的中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测试剂盒，利用PCR-RFLP方法分析所采样本的基因型。
本发明的中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测试剂盒，包括PCR试剂盒、RFLP试剂盒两部分，其中PCR试剂盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl组成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存温度-20℃；RFLP试剂盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA组成；保存温度-20℃。
PCR-RFLP分析PCR反应体系约为25μl，其中DNA模板1μl(约50 ng)，10×buffer 2.5μl，dNTPs 2.0μl，引物各0.5μl，Mg2+1.5μl，H2O 16.8μl，Taq酶0.5U，循环参数为95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，降温至4℃结束。
限制性内切酶消化取10μl PCR产物用10个单位Eco471内切酶，在总体积为20μl的反应体积中酶解，37℃酶切2～3h。
凝胶电泳用4％琼脂糖凝胶电泳，80V，1.5h，凝胶成像系统照相，分析图形(见图1)。
1.5 DNA序列分析经PCR-RFLP检测为杂合子的样品，对其PCR产物进行直接测序；经PCR-RFLP检测为纯合子的样品，PCR产物进行克隆测序。
1.6结果与分析(1)PCR-RFLP结果分析经PCR-RFLP分析，所检测母牛群中有两头杂合子，所检测公牛群中均为纯合子，未发现突变的杂合子，杂合子频率为1.12％。
(2)DNA测序结果分析所得序列比对分析发现，与澳大利亚荷斯坦牛同源性达到99％以上，该序列已被GenBank收录(登录号DQ344626)。杂合子精氨琥珀酸合成酶外显子5基因在编码第86位氨基酸的密码子处存在一个由C-T的点突变，使遗传密码子CGA变为终止密码子TGA，而使翻译终止，与国外报道一致(见图2)。
权利要求
1.中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法，包括牛血样品采集，基因组DNA提取，PCR扩增引物的设计，PCR扩增，限制性内切酶消化，凝胶电泳步骤；其特征在于所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR扩增反应体系为25μl；其中DNA模板1μl，50ng；10×buffer 2.5μl；dNTPs 2.0μl；引物各0.5μl；Mg2+1.5μl；H2O 16.8μl；Taq酶0.5U；循环参数为95℃ 5min，94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min，降温至4℃结束；所述限制性内切酶消化用限制性内切酶Eco471酶切。
2.如权利要求1所述中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法，其特征在于所述经PCR-RFLP检测为杂合子的样品，对其PCR产物进行直接测序；经PCR-RFLP检测为纯合子的样品，PCR产物进行克隆测序。
3.中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测试剂盒，其特征在于包括PCR试剂盒、RFLP试剂盒两部分，其中PCR试剂盒包括10×buffer 2.5μl，由100mM Tris-HCl，500mM KCl组成；2.5mMdNTPs 2.0μl；引物各25mM 0.5μl，；25mM Mg2+1.5μl，；dd H2O 16.8μl；保存温度-20℃；RFLP试剂盒包括Eco471酶1μl，10U；dd H2O 7μl；Buffer 2μl，由10mM Tris-HClpH8.5，10mM MgCl2，100mM KCl，0.1mg/ml BSA组成；保存温度-20℃。
全文摘要
本发明公开了一种中国荷斯坦牛瓜氨酸血症基因的检测方法，包括牛血样品采集，基因组DNA提取，PCR扩增引物的设计，PCR扩增，限制性内切酶消化，凝胶电泳步骤；其中所述引物序列是1，GTGTTCATTGAGGACATC；2，CCGTGAGACACATACTTG；所述PCR扩增反应循环参数为95℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃ 30 s，35个循环，72℃延伸10min，降温至4℃结束；所述限制性内切酶消化用Eco471酶切。本发明还同时公开了瓜氨酸血症基因的检测试剂盒，包括PCR试剂盒、RFLP试剂盒两部分。本发明对建立健全奶牛育种体系，剔除隐性缺陷基因，保证牛群种质，获得稳定的遗传进展，保持奶业的可持续发展，有着重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK1952175SQ200610069458
公开日2007年4月25日 申请日期2006年10月23日 优先权日2006年10月23日
发明者李建斌, 高运东, 王红梅, 仲跻峰 申请人:山东奥克斯生物技术有限公司