专利名称：大米草钠氢泵蛋白基因SaNHX及其应用的制作方法
大米草钠氢泵蛋白基因S"A^X及其应用技术领域 本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等 领域。具体地，本发明涉及一种在大米草(&"W""a"g//ca)中表达的钠 ^&蛋白(大米草Na+/H+ antiporter， SaNHX)和核酸序列及其应用。
背景技术：
全世界有10亿公顷的盐碱土，占陆地面积的 7%(Szabolcs,1994); 770万公顷的耕地被盐分所影响，约占耕地面积的 5。/。(Munns等,1999)。盐害对作物的产量影响极大，造成产量的大幅下降。土壤中的盐分含量过高时会对植物产生盐胁迫，危害植物的正常生长 和发育，主要表现在两个方面一，土壤中较高的溶质浓度导致的水分亏 缺；二，植物吸收水分的同时吸收了过多的盐离子所带来的离子毒害，特 别是Na+毒害。植物消除Na+毒害的策略包括降低Na+的吸收、Na+的外 排和Na+的区隔化。近年来钠氢泵蛋白在生物学方面的应用研究发展迅 速，它鼓大的特点在于其能够将Na+外排泵入液泡"仓储"，并与液泡的碱 性化有关，该蛋白在恢复细胞离子平衡过程中扮演着相当重要的角色 (尸/朋？P/2，/0/， 1985， 78: 163-167)。Apse, M. P. " 发现拟南芥的AA^tt7基因编码一个液泡膜的钠氢 乂蛋"，它i」」'以将Na+区域化丁液泡屮。并且发现^^V/iW基因的过量表 込可以提高拟南芥的耐盐性OSc&"ce, 1999, 285:1256-1258)。同时拟南芥的质膜上的Na+/H+ antiporter蛋白可以将Na+排出细胞膜， 将其过量表达后发现可以改善拟南芥的耐盐性(Shi Huazhong " 7Y加wre5/ofec/mo/ogy, 2003, 21(1): 81-85)。Hamada A等从盐生植物滨藜中分离了一个Na+7H+逆转运蛋白基因 /I^V//%/， JgAWX/在酵母NHX突变体中表达可以弥补酵母的盐敏感表 W 。上述研究表明钠氢泵蛋白在植物的耐盐性方面有着重要的作用。然而 与水稻同属禾本科的盐生植物的钠氢泵蛋白的基因的研究还未见报道。在 木发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的禾本科 盐生植物大米草钠氢泵蛋白序列及其核酸序列。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种新的大米草钠氢泵蛋白
基闲(5"aAWD 。本发明的第二目的是提供一种新的大米草钠氢泵蛋白(SaNHX)。 本发明的第三目的是提供这种大米草钠氢泵蛋白及其编码序列在利IH转基因技术改良水稻的耐盐性，培育出新的水稻耐盐中间材料。本发明提供的大米草钠氢泵蛋白基因名称为S"A^/X，是下列核苷酸序列之一1) 序列表中序列1的DNA序列；2) 与序列表中序列1限定的DNA序列具有卯。/。以上同源性，且编 码相同功能蛋白质的DNA序列。序列表屮序列1的DNA由2089个碱基组成，该基因的读码框为自5' 端第96到第1697位碱基。扩增&7A^X中任一片段的引物对也在本发明 的保护范围之内，其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到2000 个碱基之间；该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。本发明提供的一种由基因SavW/I编码的大米草钠氢泵蛋白质 SaNHX，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质、或者是将序 列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且 具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。利用任何…种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提 供的^A^X基因导入植物细胞，可获得耐盐性得到提高的转基因细胞系 及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始 核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因打t物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植 物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。被转化的植物宿主既可以是单于叶植物，如水稻；也可以是双子叶植物。本发明首次从大米草中克隆到钠氢泵蛋白基因，并通过转基因实验证 实了该基因能够提高水稻的抗盐能力。在此基础上可培育出抗盐的转基因 水稻新品种，使其能够正常生长在盐渍土地上。本发明的基因也可广泛用 厂培fT其他耐盐作物品种，有着巨大的经济价值和应用前景。
图1为大米草钠氢泵蛋白跨膜区预测结果。图2为大米草^AWX基因Southern杂交结果。图3为大米草S^W/Z基因盐胁迫下Northern杂交结果。其中1 6
分别为NaCl胁迫O、 1、 3、 6、 10和24小时。上图为杂交图，下图为EB 染色的rRNA。图4为转基因水稻耐盐试验照片。其中上图为盐水处理前，下图为盐水处理后；左边为处理15天后，右边为处理1个月后。Ckl为淡水对照组培苗，ck2为盐水对照组培苗，t3为转基因植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解， 这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如J.Sambrook等 分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1:大米草SaA^X基因的克隆及其序列信息与同源性分析1. 组织和RNA的分离大米草来源于福建省罗源湾。取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂 解液的50mL管，充分振荡后，抽提总RNA(TRIzol Reagents, Invitrogen， NY， USA)。2. SaTV/ZX的cDNA全长克隆根据水稻钠氢泵蛋白氨基酸保守序列，设计引物，利用同源性基因克 隆原理，采用RACE方法(Invitrogen试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行(1) 3'-RACEPCR (AUAP+GSP3-3)得到2003SN3， (793bp)，回收、克隆和测序。 测序结果在NCBI上BLAST,知其核酸序列及编码蛋白与已知的模式植 物拟南芥"ra^fo/w&f/^/Za"a)钠氢泵蛋白基因的同源性较高，故初步 认为它是一个钠氢泵蛋白基因。(2) 5'-RACE第一轮PCR (AAP + GSP5-2)第二轮PCR (AUAP + GSP5-3)得到2003SN 5' (553bp)(过程同(l))(3) 以序列表中序列1的第96—121和第1672 — 1697的DNA序列为 引物进行PCR扩增，得到2003SN编码区(1608bp)。 (过程同(l))BLAST的结果证明从大米草中新得到的基因确为一个植物钠氢泵蛋t^基w。山丁己知的同源钠氢泵蛋白，如拟南芥钠氢泵蛋白基因具有较强 的耐盐碱作用(Science, 1999,285: 1256-1258)，因此编码大米草钠氢泵 蛋白的基因C&7WiY)也具有相同的功能。通过组合使用上述3种方法，获得了候选的大米草钠氢泵蛋白的全长 编码序列。将3'、 5'和编码序列拼接获得序列表中序列1所示的DNA序 列。3. ^AWZ的序列信息与同源性分析本发明新的大米草钠氢泵蛋白全长cDNA的长度为2089bp，详细序 列见序列表中序列1，其中开放读框位于96 1697位核苷酸。根据全长 cDNA推导出大米草钠氢叛蛋白的氨基酸序列，共533个氨基酸残基，分 子量为58656.13道尔顿，等电点(pl)为8.563。详细序列见序列表中序 列2。对大米草SaNHX进行了跨膜区分析，结果如图l所示。跨膜区分析 显示大米草的SaNHX有12个跨膜区，可见大米草SaNHX蛋白为典型的 离子通道转运蛋白。将大米草钠氢泵蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋 白质用BLAST程序在NCBI数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索， 结果发现它与拟南芥钠氢泵蛋白在核苷酸水平上具有77%的相同性；在 氨基酸水平上，它与拟南芥钠氢泵蛋白蛋白有73%的相同性。由此可见， 大米草钠氢泵蛋白基因与拟南芥钠氢泵蛋白基因无论从核酸还是蛋白水 卞:卜.都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。实施例2:大米草SaW/7X基因的Southern杂交分析 大米草基因组DNA的提取按Paterson""/. (1993)的方法进行。取 llig基因组DNA，分别用五coRI和///"dill酶切。酶切产物经0.7%琼脂 糖凝胶电泳G0-50V， 0/N)分离，然后在摇床上处理凝胶0.125NHC1 跳15min，变性液(1.5MNaCl， 0.5NNaOH)浸洗30min，中和液(1.5M NaCl， 0.5MTris-HClpH7.2)浸洗30min。最后用20xSSC将DNA印迹 到HybondN+尼龙膜上。预杂交、杂交均按常规方法进行(金冬燕等，1996; Hybond 1ST mannual ， Amersham) 0探针及其标记杂交所用探针来源于&^//^基因cDNA中的一段约 800bp长的DNA片段。用Promega公司的Primer-a-Gene试剂盒进行标记 过夜。洗膜用高严紧方法进行(HybondhTmannual， Amersham) : 2xSSC， 0.1%SDS， 15min; lxSSC， 0.1%SDS， 65°C， 15min; 0.2xSSC， 0.1%SDS， 65°C， 15min。保鲜膜包裹杂交膜，-70^:下对乂光片曝光。结果如图2所示，从图中可以看出，该基因在5coRI的酶切泳道和 ///"dl1的酶切泳道中都杂交到两到三条带，但是每个酶切/探针组合中有 -条带显得更亮一些。所以初步断定大米草基因组中，该基因及与该基因 同源的基冈的拷贝数可能共有2 3个。实施例3:大米草&7V/iY基因的Northern杂交分析 Hoagland营养液培养大米草5天后，加入NaCl至终浓度为400 mmol/L，胁迫时间分别为0、 1、 3、 6、 10和24小时，提取叶片总RNA 进行Northern分析，结果如图3所示。从图中可以看出，6bTV/ZI表达受 盐胁迫诱导，且在胁迫6小时后即达到-较高水平，胁迫10小时后表达 量依然较高，24小时后表达量较高，但有所下降。未处理对照的表达量 也有，但较低。该结果与时间上的半定量RT-PCR结果基本一致。实施例4:大米草钠氢泵蛋白或多肽在水稻细胞中进行真核细胞表达 及转基因植株的耐盐性鉴定1. 含S的基W 的表达载体的构建根据大米草钠氢泵蛋白的全长序列(序列表中序列1)，设计扩增出完 整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可 视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物 为模板，经PCR扩增后，将的cDNA克隆至中间载体(如 T-simple)，进步克隆到双元表达载体，在保证阅读框架的前提下鉴定 好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用愈伤侵染法技术转化模式植物 水稻。2. 利用侵染愈伤法转化水稻日本晴(Nipponbare) 将水稻种子去壳，经消毒处理后，接种到诱导培养基NB上，27。C下培养。选择良好的愈伤组织经过2 3次的继代，挑选生长迅速且质地致 密的愈伤组织在继代培养基上预培养5 (1。将农杆菌在固体培养基(￥￡8 + 50mg/L利福平+500^/1^卡那霉素+ 1.5%琼脂)上培养48 h后，用AAM
液体培养基把菌落冲洗到一个无菌的三角瓶中，OD6。。调整到1.5 2.0。 静置lh后，浸泡经预培养的愈伤组织20min，将愈伤组织置无菌的滤纸 匕并在超净工作台吹20 30min，然后接到含有NB-AS培养基上，置 25t:条件卜'暗培养3 d。把愈伤用无菌蒸馏水冲洗2 3次，再用250 mg/L 的羧苄青霉素(或500mg/L的头孢霉素)浸泡30min，随后置滤纸上吸 千接种于抗性筛选培养基NBS1上培养。在NBIS1上的愈伤组织培养2 周后，转接到新的NBS2继续筛选。每块转化愈伤上长出的新愈伤记为一 个克隆。将经转化和相应未经转化的愈伤组织分别转接到分化培养基NBD 上。再生植株长到3 4 cm后转入生根培养基1/2 MSR上增加根的生长量。3. 利用PCR检测S^V/iY在转基因水稻植株中的整合 小量法提取抗性植株的总基因组DNA。用&^//1的特异引物对所提DNA进行PCR扩增，以日本晴为阴性对照。4. 含S^W/^的转基因植株的耐盐性鉴定鉴于编码钠氢泵蛋白如拟南芥的AtNHXl的基因已被证明对盐胁迫 n、.冇抗性，而大米草钠氢泵蛋白(SaNHX)与拟南芥的AtNHXl具有较高 的问源性，我们进一步对大米草钠氢泵蛋白转基因植株进行耐盐性鉴定。 将筛选出来的抗性愈伤经过预分化和分化培养后产生再生植株，经练苗后 移栽到玻璃温室继续生长。待T。代水稻阳性植株抽穗结实后收获种子。 T,代种子浸种、催芽后播于盆钵之中，待长到20天秧龄后用15Ommol/L NaCl水浇灌。IO天后改用清水浇灌，15天后观察表型变化；后再用150 mmol/LNaCl水浇灌IO天，后改用清水浇灌， 一个月后观察表型变化。 结果如图4所示，水稻组培苗对照植株在15天开始枯萎， 一个月后己经 死亡，水稻转基因植株由于耐盐而正常生长。结果证明，大米草钠氢泵蛋白对盐胁迫确有抗性，可耐受15Ommol/L 的NaCl溶液。人米草钠M泵蛋白将口J"用于利用转基因技术改良植物抗逆 (耐盐碱)的研究和产业化中。<formula>formula see original document page 9</formula>
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序列表 tC￡lC￡LElgatC
ctgtagttct tgctcccagc cccctctcct tcaggccttc ggcgcaaatt tctcccctgg 犯tga卿gg atceigtU诏"L
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cagcttcacg atggtgtttg acggtcacct g鄉gttctg atgctcctta ctgatgcggc gagc卿gcg gag犯gcata aataattctg caatgttcag ggcctgtaaa agtacaatta tgtgctctgg
〈210〉 2 〈211〉 533 〈212〉 PRT
〈213〉 Spartina anglica 僅)〉2
Mot Gly Pro Gly Leu Gly Val Leu Gly Ser Thr Ser Asp His Ala Ser
1
5 10
15
Vai Val Ser lie Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys lie Val
20 25
30
Leu Gly His Leu Leu G]u Glu Asn Arg Trp Val Asn Glu Ser Met Thr 35 40 45
A丄a Leu lie lie Gly Leu Cys Thr Gly Val Val lie Leu Leu Thr Thr
50
60
1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2089
Lys (;ly l,ys Ser Ser His lie Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe
65
70 75
80
lk」Tyr Leu Leu Pro Pro lie lie Phe Asn Ala Gly Phe Gin Val Lys
85
序列表
90
95
Lys Lys Gin Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr lie Thr Leu Phe Gly Ala 100 105 110
Val Glv Thr Met lie Ser Phe Phe Thr lie Ser lie Gly Ala lie Ala 115 120 125
Ik' Phe Ser Arg Met Asn lie Glv Ala Leu Asp Val Gly Asp Phe Leu 130 135 140
Ala lie G1y Ala I]e Phe Ser Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr Leu Gin M5 150 155 160
Val Leu Asn Gin Asp Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ser Leu Val Phe Gly 165 170 175
(;lv Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Va] Leu Phe Asn Ala Leu 180 185 190
G丄n Asn Phe Asp Leu Asn Lvs lie Asp Val Ala Val Val Leu Lys Phe 195 200 205
Lt)u Gly Asn Phe Phe Tyr Leu Phe Leu Ser Ser Thr Phe Leu Gly Val 210 215 220
Phe Ser Gly Leu Leu Ser Ala Tyr lie lie Lys Lys Leu Tyr lie Gly 225 230 235 240
Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr 245 250 255
l丄'u Cys Tyr Met 1x、u Ala G]u Leu Thr Asp Leu Ser Gly lie Leu Thr 260 265 270
Val Phe Phe Cys Gly lie Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val 275 280 285
Thr Glu Ser Ser Arg Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser 290 295 300
Pho l.]e Ala Glu Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu 305 310 315 320Asp lie Glu Lys Trp Lys Phe A丄a Ser 325
序列表
Ser Pro Gly Lys
Asp 330
Ser Val 335
Gh' lit' Ser Ser丄le Leu Leu G丄y Leu Val Leu Val Gly Arg Ala Ala 340 345 350
Phe Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys Lys Ala Asp 355 360 365
Pht' (;lu Us lie Ser Trp Arg Gin Gin Va] Val lie Trp Trp Ala Gly 370 375 380
Leu Met Arg Gly Ala Val Ser lie Ala Leu Ala Tyr Asn Lys Phe Thr 3 5 390 395 400
Arg Ser Gly His Thr Gin Leu His Gly Asn Ala lie Met lie Thr Ser 405 410 415
Thr lie Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe Gly Met Met Thr 420 425 430
l.ys Pro l.eu I]e Arg Phe Leu Leu Pro Ala Ser Ser His Thr Val Thr 435 440 445
Sc>r (;lu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His Ser Pro Leu Leu Val Ser 450 455 460
Met (;lu Giy Ser Asp Leu Glu Met Ala Ser His Ser His lie Val Arg 465 470 475 480
Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Thr Lys Pro Thr His Thr Val His 485 490 495
l'yr Trp Arg Lys Phe A邓Asn Ala Leu Met Arg Pro Met Phe Gly 500 505 510
(;ly Arg C'ly Phe Val Pro Phe Ser Pro Glv Ser Pro lie Glu Gin Ser 515 520 525
Val His Gly Gly Arg 530
权利要求
1、大米草钠氢泵蛋白基因SaNHX，是具有序列表中序列1的DNA序列。
2、 根据权利要求1所述的基因，其特征在于，该基因的读码框 为自5'端第96到第1697位碱基。
3、 大米草钠氢泵蛋白SaNHX，是具有序列表中序列2氨基酸残 基序列的蛋白质。
4、 含有权利要求1或2所述基因的表达载体。
5、 含有权利要求1或2所述基因的表达载体的水稻植物细胞系。
6、 权利要求1或2所述基因在培育耐盐水稻新品种中的应用。
全文摘要
大米草钠氢泵蛋白基因SaNHX及其应用，提供的大米草钠氢泵蛋白基因SaNHX，是序列表中序列1的DNA序列；或者是序列1限定的DNA序列有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。由基因SaNHX编码的大米草钠氢泵蛋白SaNHX，是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。本发明的基因对培育耐盐作物新品种，特别是培育耐盐水稻新品种具有重要意义。
文档编号C12N15/29GK101148671SQ200610069038
公开日2008年3月26日 申请日期2006年9月20日 优先权日2006年9月20日
发明者涛 兰, 吴为人, 周元昌, 段远霖 申请人:福建农林大学