专利名称：厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置，特别是涉及一种用于除去废水等含氮液的氮、将作为含氮液中的氮成分的氨和亚硝酸作为基质而用于有效地培养进行厌氧性氧化处理的厌氧性氨氧化细菌的厌氧性氨细菌的培养方法及装置。
背景技术：
在污水或产业废水等含氮液中含有的氮成分，从成为湖沼等水系中富营养化的原因、水系中的溶解氧降低的原因等理由出发，在向体系外排出含氮液之前需要除去其氮成分。作为该含氮液中含有的氮成分，氨态氮、亚硝态氮、硝态氮、有机态氮是主要成分。
以往，作为此种处理废水的方法，在含有的氮浓度低时，也使用基于离子交换法的除去或基于臭氧的氧化，但在氮为中高浓度的情况下，采用利用生物处理的方法。
在上述生物处理中，进行的是通过需氧硝化和厌氧脱氮的硝化/脱氮处理。在需氧硝化中，在硝化槽中利用氨氧化细菌(亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)属、亚硝化球菌(Nitrosococcus)属、亚硝化螺菌(Nitrosospira)属、亚硝化叶菌(Nitrosolobus)属等)和亚硝酸氧化细菌(硝化杆菌(Nitrobactor)属、硝化螺菌(Nitrospira)属、硝化球菌(Nitrococcus)属、硝化刺菌(Nitrospina)属等)，对已处理的含氮液中的氨态氮以及亚硝态氮进行需氧性氧化。另一方面，在厌氧脱氮中，在脱氮槽中利用脱氮假单胞菌属(Pseudomonas denitrificans)等的他养细菌，进行厌氧脱氮。
另外，在需氧硝化中，是在硝化槽的负荷为0.2～0.3kg-N/m3/d的范围内进行运转。另一方面，在厌氧脱氮中，是在脱氮槽的负荷为0.2～0.4kg-N/m3/d的范围内进行运转。因而，当处理的含氮液中的总氮浓度在30～40mg/L的范围时，在硝化槽需要6～8小时、脱氮槽需要5～8小时的滞留时间，所以必须设置大规模的各处理槽。
此外，在产业废水等只含有无机物的含氮液中，硝化槽和脱氮槽的负荷被设定为与上述负荷相同，但在进行脱氮时需要有机物。因而，有如下所示的新问题，即，必须添加相对于处理的含氮液中的氮浓度为3～4倍浓度的甲醇，不仅需要最初成本，而且还需要大量的运行成本。
与此相对，最近，如专利文献1中公开的那样，利用厌氧性氨氧化法除氮受到人们的关注。该厌氧性氨氧化法是，将处理的含氮液中的氨作为电子供体、将亚硝酸作为电子受体，利用厌氧性氨氧化细菌群，按照下面所示的化学式1(参照非专利文献1)，同时对氨和亚硝酸进行脱氮的方法。
通过上述的厌氧性氨氧化法，将处理的含氮液中的氨作为供氢体进行利用，具有可以大幅度减少在以往的脱氮法中必需的甲醇等的使用、可以减少由处理导致的污泥的产生量等优点，作为以后的除氮方法，认为是有效的方法。
作为承担该厌氧性氨氧化反应的微生物，在非专利文献2中报道了浮霉菌(Planctomycetes)属的微生物。
但是，上述的在废水除氮处理中利用的微生物，通常增殖速度慢而且菌体收率低。因而，在废水处理中需要大量这些微生物的菌体，所以微生物的培养或驯化(acclimatization)需要很多时间。
为了应对这些问题，在专利文献2中提出了在硝酸细菌的对数增殖期，通过控制作为基质的氨的添加量而有效地培养增殖速度慢的硝酸细菌的方法。
专利文献1特开2001-037467号公报专利文献2特开平9-187272号公报非专利文献1Strous M.et al.，(1998)The sequencing batch reacture as apowerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium-oxidezingmicroorganisms.Appl.Microbiol.Biotechnol.，50，589-596非专利文献2Strous M.et al.，(1999)Missing lithotroph identified asnew planctomycete.Nature，400，446-449发明内容然而，上述的厌氧性氨氧化法尽管有很多提议，但仍难以实用化，一般都没有被普及。
作为其原因，可以举出在厌氧性氨氧化处理法中使用的厌氧性氨氧化细菌不仅增殖速度缓慢，而且菌体收率低。特别是，浮霉菌(Planctomycetes)属的微生物被报道说由1个菌体增殖为2个菌体的时间(倍增时间)需要11天，其增殖缓慢成为通向实用化的大课题。那么，目前的现状是尚没有与该厌氧性氨氧化细菌的培养法有关的具体报道。
为了开动通过厌氧性氨氧化法处理废水的设施，需要含有厌氧性氨氧化细菌的种污泥，为了在短期内稳定地调试废水处理装置，必须投入菌数多的种污泥。
但是，将倍增速度需要多达11天的细菌作为种污泥进行有效培养，这是利用厌氧性氨氧化法的废水处理通向实用化的大课题，解决该问题成为厌氧性氨氧化法通向实用化的当务之急。
而且，在厌氧性氨氧化法中，可以如上所述进行高速处理，因此，需要在如专利文献2所示的硝化细菌的培养中没有经历过的那样的基质消耗速度，还由于细菌的增殖速度缓慢而需要较长的培养时间，所以在培养时需要庞大量的基质。因而，不仅在供给基质中需要很多成本，而且通过培养会产生大量的废液，所以也会产生处理该废液需要很多成本这样的新问题。
本发明正是鉴于这样的情况而完成的发明，其目的在于，提供一种如下所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置，其中，是在将氨和亚硝酸作为基质的厌氧性氨氧化细菌的培养中，在没有浪费的情况下供给基质，能够产生菌体浓度高的种污泥，或者在短期内进行运转的调试。
本发明之一中记载的本发明为了达到上述目的，提供一种厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其是以亚硝酸和氨为基质，在培养槽中培养进行厌氧脱氮的厌氧性氨氧化细菌，将上述基质的供给速度设为Y、将上述基质的供给常数设为K、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、将培养运转开始时的基质浓度设为A，此时，从上述厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期开始，对提供给上述培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以满足下式Y＝A×exp(K×T)。
本发明人对以往报道的厌氧性氨氧化细菌的倍增时间持有疑问，在基因水平上研究增殖速度，结果得出如下观点，即倍增时间不是以往报道的11天，而是最大为1.8天。本发明以该新观点为基础，通过在培养槽中使厌氧性氨氧化细菌发生增殖，在没有浪费的情况下供给基质而生成菌体浓度高的种污泥，或者进行培养槽的调试。
如上所述，本发明中的培养槽并不限定于培养厌氧性氨氧化细菌的种污泥，在培养槽为实际装置的厌氧性氨氧化槽时，也可以将本发明用于厌氧性氨氧化槽的调试运转，同时也可以作为在运转中厌氧性氨氧化细菌失活时的驯化方法使用。
根据本发明之一，从厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期时开始，对提供给培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以使其满足Y＝A×exp(K×T)，所以可以有效地对厌氧性氨氧化细菌进行连续培养，可以容易地调制高浓度的厌氧性氨氧化细菌。另外，通过将供给常数K和作为新观点而得到的倍增时间即厌氧性氨氧化细菌的基质消耗速度结合起来，可以在不浪费的情况下供给基质，进行有效培养。这样，可以在不浪费的情况下供给基质并生成菌体浓度高的种污泥，所以可以降低基质的供给成本，同时可以大幅度地削减废液的处理成本。
本发明之二的特征在于，在本发明之一中，以上述厌氧性氨氧化细菌具有的16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的特定区域，含有序列表的序列编号1～9所示的序列中的至少1种以上的序列。
在这里，本发明之二中记载的厌氧性氨氧化细菌的基因序列，被注册在DDBJ(DNA Data Bank of Japan)中，序列编号1的注册号为AB164467、序列编号2的注册号为AB164468、序列编号3的注册号为AB164469、序列编号4的注册号为AB164470、序列编号5的注册号为AB164471、序列编号6的注册号为AB164472、序列编号7的注册号为AB164473、序列编号8的注册号为AB164474、序列编号9的注册号为AB164475。
本发明之二是对基于16SrRNA基因的DNA碱基序列的特定区域含有序列表的序列编号1～9所示序列中的至少1种以上的序列的厌氧性氨氧化细菌应用本发明之一，可以获得更好的效果。
本发明之三是在本发明之一或二中，提供给上述培养槽的氨和亚硝酸的比率被控制在1∶0.5～2.0的范围。
本发明之三规定了作为基质的氨与亚硝酸的比率的优选范围，比率优选在1∶0.5～2.0的范围，更优选在1∶1～1.5的范围，特别优选为1∶1.3。
本发明之四是在本发明之一至三的任一方案中，上述基质的供给常数K被设定在0.05～0.28的范围。
本发明之四是将供给常数K和作为新观点而得到的倍增时间结合起来而设定的优选范围，供给常数K优选为0.05～0.28的范围。
当用以往报道的倍增时间11设定供给常数K时，即使菌体与增殖速度为1∶1的关系即如果菌体增加到2倍则处理速度变为2倍的理想关系，在供给常数K的值中，0.069是可以设定的最大值。实际上，如果考虑菌体与增殖速度不可能为1∶1的关系，就供给常数K的值而言，不到0.05是常识的值。因而，基于发明者的倍增时间为1.8天这样的新观点，本发明之三中的供给常数K是可以在开始设定的值。
本发明之五是在本发明之一至三的任一方案中，上述基质的供给常数K被设定在0.06～0.15的范围。
本发明之五规定了供给常数K的更优选的值，所以供给常数K更优选在0.06～0.15的范围。这是因为，根据厌氧性氨氧化细菌培养的诸条件，最佳的供给常数K也会多少发生变化，为了使其很难受到培养的诸条件的影响，优选将供给常数K设定在0.06～0.15的范围。
本发明之六是在本发明之一至三的任一方案中，上述基质的供给常数被设定在0.07～0.12的范围。
本发明之六是更难以受到培养的诸条件的影响的范围，特别优选设定在该范围的供给常数K来培养。
本发明之七是在本发明一至六的任一方案中，近似于用上述式Y＝A×exp(K×T)的表示的增加曲线，阶段形地使上述基质供给速度Y’增加，同时每个阶段增加的培养槽内的亚硝态氮浓度被控制在最大不超过70mg/L。
这对于厌氧性氨氧化细菌而言，具有如下的特有性质如果将亚硝酸作为基质同时亚硝酸浓度过高，则活性降低，在极端的情况下会失活，如果考虑这种特性进行培养。则不能有效地进行培养。
在本发明之七中，是使其与用上述Y＝A×exp(K×T)的式子表示的增加曲线接近而阶段形地使基质供给速度Y增加，从而向培养槽供给基质的情况，每个阶段增加的培养槽内的亚硝态氮浓度被控制在最大不超过70mg/L。这样，厌氧性氨氧化细菌不会在培养中活性降低或失活。每个阶段增加的亚硝态氮浓度更优选被控制在最大不超过50mg/L。
本发明之八是在本发明之一至七的任一方案中，从上述厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期的时刻开始，由向上述培养槽中供给的基质浓度与在从上述培养槽排出的液体中残存的基质浓度之间的差，求得实际基质消耗速度y，在将上述基质的消耗速度设为y、上述基质的消耗常数设为k、进入对数增殖期之后的培养天数设为T、培养运转开始时的基质浓度设为a时，用y＝a×exp(K×T)表示的基质消耗速度的式子和上述求得的基质消耗速度y，算出基质的消耗常数k，将上述供给常数k设定为与上述已算出的消耗常数k一致。
如上所述的供给常数K被设定在0.05～0.28的范围内，在本发明之八中，也设定了在该范围中的最适供给常数K。
本发明之八设定供给常数K以使基质供给速度与基质消耗速度一致，由此进一步消除基质浪费，进行有效的培养。即，由提供给培养槽中的基质浓度与在从培养槽排出的液体中残存的基质浓度之间的差，可以求得实际基质消耗速度y，所以使用该求得的基质消耗速度y，由作为基质消耗速度的式子的y＝a×exp(K×T)，计算出消耗常数k。如果将供给常数K设定为与已算出的消耗常数k一致，可以在没有浪费的情况下将提供给培养槽的基质用于培养。另外，本发明之一所述的A是从基质供给速度侧观看时的培养运转开始时的基质浓度，本发明之八所述的a是从基质消耗速度侧观看时的培养运转开始时的基质浓度。由此，虽然改变A和a的符号，都同样是指培养运转开始时的基质浓度。
本发明之九中记载的发明为了达到上述目的，提供一种厌氧性氨氧化细菌的培养装置，其是以亚硝酸和氨作为基质而在培养槽中培养进行厌氧脱氮的厌氧性氨氧化细菌，其具备供氨机构，其以规定浓度向上述培养槽中供给上述基质的一方的氨；供亚硝酸机构，其以规定浓度向上述培养槽中供给上述基质的另一方的亚硝酸；和控制机构，其在将上述基质的供给速度设为Y，将上述基质的供给常数设为K，将进入对数增殖期后的培养天数设为T，将培养运转开始时的基质浓度设为A时，从上述厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期开始，对提供给上述培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以满足式子Y＝A×exp(K×T)。
本发明之九将本发明作为装置的构成，当从供氨机构和供亚硝酸机构向培养槽中供给作为基质的氨和亚硝酸来培养厌氧性氨氧化细菌时，利用控制机构对提供给培养槽中的基质的供给速度Y进行控制，以便满足式子Y＝A×exp(K×T)。这样，可以在没有浪费的情况下提供基质，并生成菌体浓度高的种污泥，所以可以降低基质的供给成本，同时可以大幅度地削减废液的处理成本。
本发明之十是在本发明之九中，以上述厌氧性氨氧化细菌具有的16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的特定区域，含有序列表的序列编号1～9所示的序列中的至少1种以上的序列。
本发明之十是对基于16SrRNA基因的DNA碱基序列的特定区域含有序列表的序列编号1～9所示序列中的至少1种以上的序列的厌氧性氨氧化细菌应用本发明之九，可以获得更好的效果。
本发明之十一是在本发明之九或十中，上述控制机构对上述供氨机构与上述供亚硝酸机构进行控制，以使提供给上述培养槽的氨和亚硝酸之间的比率在1∶0.5～2.0的范围。
控制机构优选控制上述供氨机构与上述供亚硝酸机构，并使提供给培养槽的氨和亚硝酸之间的比率在1∶0.5～2.0的范围，更优选在1∶1～1.5的范围，特别优选为1∶1.3。
本发明之十二是在本发明之九至十一的任一方案中，具备对提供给上述培养槽的基质浓度进行测定的第1测定机构，和对从上述培养槽排出的液体中所残存的基质浓度进行测定的第2测定机构，上述控制机构从上述第1测定机构的测定结果和上述第2测定机构的测定结果之间的差，求得基质消耗速度y，当将上述基质的消耗速度设为y、上述基质的消耗常数设为k、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、培养运转开始时的基质浓度设为a时，用求得的基质消耗速度y和式子基质消耗速度y＝a×exp(K×T)计算出基质的消耗常数k，根据已算出的消耗常数k，设定上述供给常数K。
作为以消耗常数k为基础设定供给常数K的一个例子，将供给常数K设定成为与消耗常数k一致。这样，通过按照使基质供给速度与基质消耗速度一致的方式设定供给常数K，可以进一步消除基质的浪费，进行有效的培养。
如以上说明，通过本发明的厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置，在将氨和亚硝酸作为基质培养厌氧性氨氧化细菌中，可以在没有浪费的情况下提供基质而生成菌体浓度高的种污泥，或者在短时间内进行运转的调试。这样，可以降低基质的供给成本，同时大幅度地削减废液的处理成本。
图1是说明为了确认厌氧性氨氧化细菌的倍增时间而进行的连续培养试验的结果的示意图。
图2是表示在已实施适当的基质的供给速度时的培养时间和脱氮速度的关系图。
图3是说明为了设定Y＝A×exp(K×T)的供给常数K而进行的连续培养试验的结果的示意图。
图4是表示本发明的厌氧性氨氧化细菌的培养装置的整体结构图。
图5是说明作为基质的供给方法的一个实施方式的阶段形的供给方法的示意图。
图6是说明厌氧性氨氧化细菌的活性与亚硝酸的氮浓度之间的关系的示意图。
图中10-厌氧性氨氧化细菌的培养装置，12-培养槽，14-供氨机构，16-供亚硝酸机构，18-供废水机构，20-控制装置，22-氨储留罐，24-第1配管，26-第1泵，28-亚硝酸储留罐，30-第2配管，32-第2泵，34-废水储留罐，36-第3配管，38-第3泵，40-排出配管，42-第1测氮器，44-第2测氮器。
具体实施例方式
下面，按照附图对本发明的厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置的优选实施方式进行详细说明。
本发明人等在实现本发明的过程中得到如下的观点。
(1)检验关于以16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的特定区域含有序列表的序列编号1～9所示的序列中至少1种以上的厌氧性氨氧化细菌的倍增时间，结果并非以往报道的约11天，而是最大值为1.8天，为了培养这种倍增时间的厌氧性氨氧化细菌，需要技术与此相称的培养方法。下面将含有序列表的序列编号1～9所示的序列中至少1种以上的厌氧性氨氧化细菌称为“新型厌氧性氨氧化细菌”。
(2)作为其培养方法，在将基质的供给速度设为Y、基质的供给常数设为K、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、将培养运转开始时的基质浓度设为A时，从新型厌氧性氨氧化细菌进入对数期时开始，对提供给培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以便满足下式Y＝A×exp(K×T)…(计算式1)。这样，能够在消除浪费的基质供给的情况下进行有效培养。该培养方法中，重要之处在于，如果将培养运转开始时的基质浓度设定为A，则以该浓度并在一定条件下开始培养，增加基质的量以便从新型厌氧性氨氧化细菌进入对数期时开始使其满足上述(计算式1)式。这是因为，如果从进入对数增殖期之前的增殖运转初期开始向培养槽中投入大量基质，则直到到达对数增殖期为止，需要很长的天数，不能有效地进行增殖。是否进入对数增殖期的判断为已被确认为消耗基质的时刻，但通常优选将已供给的基质中基质浓度的大约一半被消耗掉的时刻作为已进入对数增殖期的判断。因而，优选在培养装置中设置用于检测已进入对数增殖期的机构，关于这一点，见后述。
另外，上述的式子Y＝A×exp(K×T)分别适用于作为厌氧性氨氧化细菌的基质的氨和亚硝酸，氨的基质供给速度表示为Ya＝A×exp(K×T)。在这种情况下，A表示氨的培养运转开始时的基质浓度，K表示氨的供给常数。另外，亚硝酸的基质供给速度表示为Yn＝A×exp(K×T)，A表示亚硝酸的培养运转开始时的基质浓度，K表示亚硝酸的供给常数。
(3)上述(计算式1)式中的基质供给常数K有必要为与倍增时间1.8天吻合的数值，供给常数K优选在0.05～0.25的范围内，更优选在0.06～0.15的范围，特别优选在0.07～0.12的范围。接着，为了更适当地设定该供给常数K，也可以设定为与从y＝a×exp(k×T)的(计算式2)表示的基质消耗速度求得的消耗常数k一致。在这里，基质的消耗速度为y，进入对数增殖期后的培养天数为T，消耗常数为k，以及培养运转开始时的基质浓度为a。
接着，对得到上述观点的培养试验进行说明。
(A)首先，对用于确认新型厌氧性氨氧化细菌的倍增时间(增殖速度)的最大速度的连续培养试验进行说明。
作为试验污泥，使用含有具有序列表的序列编号1～9全部的新型厌氧性氨氧化细菌的污泥(参照生田创，井坂和一，角野立夫(2004)通过连续培养系统的新型厌氧性氨氧化细菌的驯化，第38届水环境学会演讲论文集，p372)。
对于以新型厌氧性氨氧化细菌的16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的确认方法，在提取RNA之后，在使用Eub341f引物(文献1)以及AMX820引物(文献2)进行扩增之后，用测序仪(sequencer)确认碱基序列。
(文献1)Muyzer G.，Brinkhoff T.，Nubel U.，Santegoeds C.，Schafer H.，and Wawer C.，Denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE)in microbialecology，1998.3.4.4，p.1-27，In Akkermans A.D.L.，van Elsas J.D.，deBruijn F.J.(ed.)，Molecular microbial ecology manual.Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht，The Netherlands.
(文献2)Schmid M.，Twachmann U.，Klein M.，Strous M.，Juretschko S.，Jetten M.S.M.，Metzger J.W.，Schleifer K.H.，Wagner M.，2000.Molecularevidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobicammonium oxidation，System.Appl.Microbiol.23，93-106.
作为试验废水，使用表1所示的无机合成废水，通过使氨和亚硝酸的浓度发生变化来调节无机合成废水中的基质浓度。
表1
备考)T.Element S1EDTA5g/L，FeSO45g/LT.Element S2EDTA15g/L，ZnSO4·7H2O0.43g/L，CoCl2·6H2O0.24g/L，MnCl2·4H2O0.99g/L，CuSO4·5H2O0.25g/L，NaMoO4·2H2O0.22g/L，NiCl2·6H2O0.19g/L，NaSeO4·10H2O0.2lg/L，H3BO4·0.014g/L作为试验装置，使用向有效容积200mL的上升流型的培养槽(反应器(reactor))中以表观充填率为50％充填聚酯纤维的无纺布的装置，在培养槽的外周围绕水冷套(water jacket)，将水温调节到37℃。
接着，将含有新型厌氧性氨氧化细菌的污泥投入并使培养槽内的SS浓度成为180mg/L，然后在HRT 3小时、水温37℃的条件下进行连续培养试验。使培养开始时的亚硝酸浓度以氮浓度计为70mg/L，使氨浓度以氮浓度计为80mg/L。但是，有可能氨在培养试验中挥发而浓度降低，亚硝酸浓度出现残留，所以优选与厌氧性氨氧化法中的作为氨与亚硝酸的理论比率的1∶1.32相比，以多10～20mg/L左右的程度投入氨。
作为新型厌氧性氨氧化细菌的计量方法，使用FISH(Fluorescence InSitu Hybridization)，染色后，在显微镜观察下计量菌数。FISH法是使用只让厌氧性氨氧化细菌的基因显色的探针而选择性使其显色的方法。使用的引物是AMX820引物。在这种情况下，由于在FISH法的计量时菌死亡，所以不能在从一个培养槽取出污泥进行计量之后再放回到培养槽中进行连续培养。因而，准备四个相同培养条件的培养槽同时进行运转，从水质变化(脱氮性能)被确认的时刻开始，每一周清洗/回收一个培养槽内的大概所有菌体，然后进行计量。(参照Schmid M.，et al.，(2000)Molecularevidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobicammonium oxidation，System.Appl.Microbiol.23，93-106.)图1是表示连续培养试验的结果的图，是表示相对于培养天数的氨和亚硝酸的脱氮速度(kg-N/m3/天)，和相对于培养天数的厌氧性氨氧化细菌的菌数变化的图。
如图1所示，从被认为是对数增殖期的第14天开始到第21天为止，培养槽内的新型厌氧性氨氧化细菌数的浓度从1.1×106cells/mL(第14天)急速增殖到1.7×107cells/mL(第21天)。然后，在第27天缓慢增殖到2.1×107cells/mL，在第34天缓慢增殖到4.3×107cells/mL。
接着，由被认为是对数增殖期的第14天到第21天的新型厌氧性氨氧化细菌的菌数，算出新型厌氧性氨氧化细菌的增殖速度，结果倍增时间为1.8天，比增殖速度(μ)为0.39日-1，比以往报道的倍增时间11天短了很多。另外，从被认为是对数增殖期的第14天开始到第21天为止，可以使上述(计算式2)的基质消耗速度接近y＝0.003×exp(0.28×T)，此时的基质的消耗常数k为0.28。因而，通过将上述(计算式1)的基质供给速度Y的供给常数K设定为消耗常数0.28左右，可以有效地进行培养且没有浪费基质。
根据该结果，如果是从第14天开始到第21天的对数增殖期的增长速度，在倍增时间最大为1.8天，比以往报道的倍增时间11天远远更快的速度的增殖成为可能。
另外，在该连续培养试验中，通过克隆法(参照文献3)测定培养运转初期和培养后的新型厌氧性氨氧化细菌的种类及其相对数，结果确认为大致没有变化。即，表明以16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的特定领域具有序列表的序列编号1～9的各种新型厌氧性氨氧化细菌均进行了相同的增殖。另外，克隆法的具体内容参照文献3。
(文献3)金子直哉，吉江幸子，青井议辉，常田聪，平田彰(2004)与厌氧性氨氧化反应相关的微生物群的生物结构分析，第38届水环境学会演讲论文集，p373但是，从图1的结果可知，第21天以后的增殖速度比从第14天开始到第21天的增殖速度低。这是因为，由于基质的供给速度没有变化，所以与菌体的增殖相比基质的供给成为控速。因而，根据增殖速度得比以往报道的增殖速度还快，适当控制基质的供给速度是极为重要的。本发明是对适当的基质供给速度进行潜心研究并具体构成的发明，下面进行说明。
(B)有关用于培养倍增时间的最大值为1.8天的厌氧性氨氧化细菌的适当的基质供给速度的连续培养试验图2是使用已遮盖固定化的新型厌氧性氨氧化细菌以没有基质的控速的方式进行废水处理试验的结果，是对数显示已确认基质消耗的第10天以后、即对数增殖期以后的脱氮速度(kg-N/m3/天)的结果。如图2所示可知，各标绘(plot)在直线上，在长时间内，培养天数与脱氮速度在对数增殖期内有密切的关系。另外，此时的基质的消耗常数k为0.053。
因而可知上述图1的培养时间第21天以后，当成为问题的与菌体的增殖相比基质的供给成为控速的情况下，与该基质供给速度一致来供给基质是重要的。
在这里，对图1中的对数增殖期(第14天～第21天)，求得基质的消耗速度k，结果为k＝0.28。因此，对上述(A)的试验，改变基质供给方法，再次进行试验。即，从已确认基质消耗的时刻开始，进行培养并成为基质供给速度Y＝A×exp(K×T)。如果更详细地描述这一点，调节基质后进行供给，以达到如下要求即，就氨而言为Ya＝80×exp(0.28×T)，就亚硝酸而言为Yn＝70×exp(0.28×T)，其结果，培养时间27天的菌体浓度为2.7×108，确认了维持较快的增殖速度并继续增殖。另外，处理水中的氨以及亚硝酸分别为40mg/L以下，确认了可以降低培养后的废水中的基质浓度。
(C-1)从培养运转初期开始加入大量基质的情况试验是使用与上述(A)同样的装置，预先增加基质的浓度，进行培养。即，以氮浓度计将氨浓度设定为150mg/L，以氮浓度计将亚硝酸浓度设定为150mg/L。另外，种污泥向培养槽中的投入浓度作为培养槽内的SS浓度为180mg/L。
其结果，从增殖运转开始，在25天内排出以氮浓度计氨和亚硝酸分别为140mg/L这样的高浓度的废水，直到进入对数增殖期为止的天数需要为25天这样的长时间。另外，即使进入对数增殖期之后，基质消耗速度y中的消耗常数k为0.021这样的低值。
(C-2)将K设为0.09进行培养的情况试验是使用与上述(A)同样的装置进行培养，基质的初期浓度也与(A)的情况相同。接着，从已确认基质消耗的时刻(第18天)开始，调节基质后进行供给，并使氨和亚硝酸的供给速度分别满足下述，即，就氨而言为Ya＝80×exp(0.09×T)，就亚硝酸而言为Yn＝70×exp(0.09×T)。
其结果，能够以从培养时间第14天开始到第27天为止的新型厌氧性氨氧化细菌的增殖速度为倍增时间5天的速度进行培养。另外，处理水中的氨以及亚硝酸的浓度在第22天以后分别为5mg/L以下。从该结果可知，基质的控速会导致增殖速度或多或少地降低，但可以以比所报道的倍增时间11天更快的速度进行培养。
(C-3)确认消耗速度并基于此来控制基质消耗速度的方法(其一)试验是使用与上述(A)同样的装置进行培养。种污泥的投入浓度也与比较例相同为180mg/L。但是，就基质的供给方法而言，是在培养运转初期以氮浓度计将氨设定为38mg/L，以氮浓度计将亚硝酸设定为50mg/L，在一定条件下培养直到确认消耗了基质的大约半量为止。基质的大约半量是否已被消耗的监测是在培养槽的入口和出口设置氨和亚硝酸的氮测定器而进行的。
确认了从运转开始第9天以后大约半量的基质被消耗，同时上述(计算式2)式的基质消耗速度y中的消耗常数k显示为0.1。
因此，判断为已进入对数增殖期，然后，在供给常数K＝0.1的条件下控制基质供给速度以便满足基质供给速度Y的上述(计算式1)式。就基质供给速度Y的控制而言，是在无机合成废水的流速一定的条件下进行，是通过使基质的浓度发生变化来进行的。具体地说，氨的供给速度为Ya＝38×exp(0.1×T)，亚硝酸的供给速度为Yn＝50×exp(0.1×T)。
其结果，能够从培养运转开始在短时间内使培养槽的脱氮速度提高到8.0(kg-N/m3/日)，而且还能够分别将处理水中的氨和亚硝酸的浓度降低到25mg/L以下。
如此可知，能够得到高活性，能够有效地进行培养，同时没有浪费的情况下供给基质，所以能够削减基质供给量。
(C-4)确认消耗速度并基于此来控制基质消耗速度的方法(其二)试验是使用与上述(A)相同的装置进行培养，种污泥的投入浓度为250mg/L，其量大于(C-3)中的试验。就基质的供给方法而言，是在培养运转初期以氮浓度计将氨设定为50mg/L，以氮浓度计将亚硝酸设定为66mg/L，在一定条件下培养直到确认消耗了基质的大约半量为止。基质的大约半量是否被消耗的监测与第1试验相同。
在培养运转开始至第4天，基质开始消耗，在第8天，氨与亚硝酸的消耗近似于上述(计算式2)式的基质消耗速度y，同时得到此时的消耗常数k＝0.14的值。
因此，控制基质供给速度Y以便从培养运转开始第9天满足上述(计算式1)式，同时设定成供给常数K＝0.14。
其结果，按照上述(计算式1)式的基质供给速度来消耗基质，能够将在对数增殖期下的培养槽内的亚硝酸浓度经常维持在50mg/L以下，厌氧性氨氧化细菌的活性不会降低。这样，能够从培养运转开始在短时间内就达到高活性并有效地进行培养，同时由于基质的供给也没有浪费，所以能够削减基质供给量。
从以上试验结果可知，比进入对数增殖期之后相比，在进入对数增殖期之前以更低浓度的基质在一定条件下进行培养，对提供给培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以便一旦进入对数增殖期后满足Y＝A×exp(K×T)，由此能够进行有效的培养且消除基质供给的浪费。
(D)接着，对用于设定上述(计算式1)式中的基质的供给常数K的连续培养试验进行说明。
这是因为，厌氧性氨氧化细菌是由共生微生物系统形成，难以分离厌氧性氨氧化细菌，所以通过新型厌氧性氨氧化细菌的固定化方法、固定化材料的种类、培养槽的形状、种污泥的活性等培养诸条件，导致基质的消耗速度k发生变动，因而最适合的供给常数K也多少发生变动。因而，在决定供给常数K的设定值方面，必须设定经验上频率高的范围的值。
培养试验使用的装置与在上述倍增时间的确认试验中的相同，对固定化厌氧性氨氧化细菌的固定化方法(遮盖固定化、附着固定化、利用微生物的自身造粒的颗粒(granule))或固定化材料的材质作出各种改变而进行。
其结果，从图3可知，如果看到已被确认的基质的消耗常数k与其频数(发生频率)之间的关系，基质的消耗常数k的值大多被观察到在0.05～0.28的范围，频数在0.06～0.15的范围则变得更多，在0.07～0.12的范围被观察到最多。因而，优选将上述(计算式1)式中的供给常数K设定为0.05～0.28的范围来控制基质供给速度Y。更优选的范围为0.06～0.15的范围，特别优选的范围为0.07～0.12的范围。通过将供给常数K设定在这些范围中，可以减小培养的诸条件的影响。
另外，当根据以往报道的倍增时间11来设定供给常数K时，即使假设菌体与增殖速度为1∶1的关系、即菌体如果增加至2倍则处理速度变为2倍的理想的关系，供给常数K可以取得的最大值为0.069。但是，如果考虑到实际上菌体与增殖速度不可能为1∶1的关系，就供给常数K的值而言，不到0.05是常识的值。因而，上述的供给常数K的范围是在有发明人认为倍增时间为1.8天这样的新观点的情况下，可以开始设定的值。
(E)接着，是基于上述观点而构成的本发明的新型厌氧性氨氧化细菌的培养装置的整体结构图。
如图4所示，新型厌氧性氨氧化细菌的培养装置10，主要由上升流型培养槽12、向培养槽12中供给氨(基质)的供氨机构14、向培养槽12中供给亚硝酸(基质)的供亚硝酸机构16、向培养槽12中供给含有上述基质的废水(例如无机合成废水)的供废水机构18、和控制提供给培养槽12的基质的供给速度的控制装置20构成。
向培养槽12内投入例如从水污泥集聚培养的厌氧性氨氧化细菌的种污泥。为了使厌氧性氨氧化细菌不从培养槽12流出，优选使用固定地板、附着型的载体、遮盖固定化载体。作为使用固定地板时的材料，可以适当地使用聚乙烯、聚酯、聚丙烯、氯乙烯等塑料原料，或活性炭纤维(fiber)等，但没有特别限定。作为固定地板的形状，有被整形成为纤维状或菊花状的形状，或者被整形为蜂窝状(honey comb)的形状等，但没有特别限定。对于固定地板，作为表观容积，优选为30～80％，更优选为40～70％。另外，作为固定地板的空隙率，优选使用空隙率为80％以上的固定地板。
作为附着载体的固定化材料，可以举出聚乙烯醇、藻酸、聚乙二醇系的凝胶或纤维素、聚酯、聚丙烯、聚乙烯等塑料载体等，但没有特别限定。对于形状，优选使用进行了球形、圆筒形、多孔性、立方体、海绵状、蜂窝状等整形的附着载体。
另外，作为遮盖固定化载体的固定化材料，优选聚乙二醇系的凝胶，但只要是对菌体没有不良影响的材料，就没有特别限定。另外，除了固定地板、附着载体、遮盖固定化载体以外，也可以将利用了微生物的自身造粒的颗粒用于本发明。
在供氨机构14中，将第1配管24从储留规定浓度的氨溶液的氨储留罐22，延伸设置到培养槽12的底部，在第1配管24的中途设置调节供给量的第1泵26。在供亚硝酸机构16中，将第2配管30从储留规定浓度的亚硝酸溶液的亚硝酸储留罐28开始，与第1配管24的中途连接，同时在第2配管30的中途设置调节供给量的第2泵32。作为这些基质的供给源的氨储留罐22和亚硝酸储留罐28，优选被作为各自的罐，以液态储留氨和亚硝酸。但是，亚硝酸不稳定，所以最好不长时间使其为液态，而是在每次使用时作为液态使用。
在供废水机构中，将第3配管36从例如储留无机合成废水的废水储留罐34开始，与第2配管30的中途连接，同时在第3配管36的中途设置调节供给量的第3泵38。这样，添加氨与亚硝酸的基质，向培养槽12的底部供给废水，在培养槽12中培养新型厌氧性氨氧化细菌。在培养槽12的上端，连接有将已消耗基质的废水(在这里称为处理水)从培养槽12排出的排出配管40。
另外，在培养槽12的入口(在图4中为第1配管24)设置对被提供给培养槽12的氨的氮浓度和亚硝酸的氮浓度进行检测的第1氮测定器42，同时，在培养槽12的出口(在图4中为排出管40)设置对从培养槽12排出的处理水中所残留的氨的氮浓度和亚硝酸的氮浓度进行测定的第2氮测定器44。接着，由第1和第2氮测定器42、44测定出的测定值被依次输入到控制装置20。
在控制装置20中预先装有用Y＝A×exp(K×T)表示的基质供给速度Y的计算式1和用y＝a×exp(k×T)表示的基质消耗速度y的计算式2。在这里，Y基质的供给速度，K基质的供给常数，T进入对数增殖期后的培养天数、A培养运转开始时的基质浓度，y基质的消耗速度，k基质的消耗常数，a培养运转开始时的基质浓度。控制装置20利用计算式1控制向培养槽12中供给的基质的供给速度Y。另外，控制装置20根据第2氮测定器44的测定值相对于第1氮测定器42的测定值的差即从在培养中消耗的基质的量，求得实际的基质消耗速度y，从求得的基质消耗速度y和计算式2，算出基质的消耗常数k，根据已算出的消耗常数k设定在计算式1中设定的供给常数K。例如，设定供给常数K且与消耗常数k一致。这样，上述供给常数K的值可以在0.05～0.28的范围中以目标定点的方式将供给常数K设定成最佳值。
另外，为了利用如上所述构成的培养装置10培养新型厌氧性氨氧化细菌，如果控制装置20在培养运转开始时将氨和亚硝酸各自的基质浓度设定为A，在该浓度下、一定条件下开始培养，从新型厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期时开始，对提供给培养槽12的基质的供给速度Y进行控制，以便满足Y＝A×exp(K×T)的计算式1。在这里，提供给培养槽12的氨与亚硝酸的比率优选为1∶0.5～2.0的范围，更优选为1∶1～1.5的范围，特别优选为1∶1.3。
在该培养中，可以通过第1和第2氮测定器42、44了解是否已进入对数增殖期。即，如果进入对数增殖期且基质的消耗急剧增加，则第2氮测定器44的测定值相对于第1氮测定器42的测定值的差，向急剧变小的方向变化。因而，通过监测该变化，可以把握已进入对数增殖期。例如，如果第2氮测定器44的测定值相对于第1氮测定器42的测定值成为一半，则可以认为已进入对数增殖期。
另外，如上所述构成的本发明的新型厌氧性氨氧化细菌的培养装置10，是有效地培养厌氧性氨氧化细菌的装置，不是只以取得种污泥为目的的装置。例如，在将培养槽看作废水处理装置的厌氧性氨氧化槽的情况下，也可以作为装置运转开始时或厌氧性氨氧化细菌在厌氧性氨氧化槽内失活时的驯化方法利用。
然而，当将在培养槽12中培养的新型厌氧性氨氧化细菌添加到废水处理装置的厌氧性氨氧化细菌槽中时，优选对新型厌氧性氨氧化细菌进行遮盖固定化后使用，下面对遮盖固定化载体内的新型厌氧性氨氧化细菌的培养进行说明。
在该载体培养试验中，使用图4所示的培养装置10，在载体凝胶内对新型厌氧性氨氧化细菌进行遮盖固定化，然后将其添加到培养槽12内进行培养。作为固定化凝胶，使用聚乙二醇系预聚物，使聚合物浓度为15％。在该固定化凝胶内，对厌氧性氨氧化细菌进行遮盖固定化并使SS浓度成为3000mg/L。接着，将该遮盖固定化载体充填到培养槽12中并使载体充填率成为10％。
在用于试验的废水中，使用表1所示的无机合成废水，使运转开始时的氨和亚硝酸以氮浓度计分别为50mg/L。然后，一边进行水质测定一边向培养槽12中供给基质并且满足计算式1，同时供给基质并使从培养槽12排出的处理水中所残留的亚硝酸浓度不会成为50mg/L以上。
图5表示使用图4所示的培养装置10、向培养槽供给的基质的供给控制方法的变形例，是阶段式的供给方法。即，是使其接近用计算式1表示的增加曲线并使基质供给速度Y阶段形地增加，同时对每个阶段增加的培养槽内的亚硝态氮浓度进行控制使其最大不超过70mg/L的方法。另外，在本试验中，使亚硝酸浓度不超过50mg/L。
在废水中，使用表1的无机合成废水，使种污泥向培养槽12的投入浓度为220mg/L。另外，使培养运转初期的氨以氮浓度计为38mg/L，使亚硝酸以氮浓度计为50mg/L。接着，在一定条件下进行培养，直到确认以消耗到亚硝酸的氮浓度达到10mg/L，然后判断为已进入对数增殖期，将其控制为满足计算式1。
如图5所示，在基质的供给控制中，用○表示的增加曲线A是控制氨的供给速度以满足计算式1的情况，用口表示的增加曲线B是控制亚硝酸的供给速度以满足计算式1的情况。与此相对，用●表示的阶段形线C是使得接近于用计算式表示的增加曲线A并使氨的供给速度阶段形增加的情况，用■表示的阶段形线D是使得接近于用计算式1表示的增加曲线B接近并使亚硝酸的供给速度阶段形增加的情况其结果，第9天测定亚硝酸的氮浓度降低到了8mg/L。此时，从计算式2求得的增加曲线B的消耗常数k为0.08。
可以按照该增加曲线B来使亚硝酸的供给浓度发生变化，但在本试验的阶段形供给中，是以增加曲线B为基础、一边在亚硝酸不足的每大致5天，使培养槽12内的亚硝酸的氮浓度上升50mg/L，一边进行培养。另外，氨的供给量以亚硝酸的氮浓度为基准进行供给，并使其为用1.32去除亚硝酸的氮浓度而得到的值以上。其结果，厌氧性氨氧化细菌在可以维持高活性的同时维持k＝0.08的高消耗常数来进行培养。
这样，在厌氧性氨氧化细菌中，与以亚硝酸为基质相反，亚硝酸的浓度如果过高，则活性降低或失活，所以在阶段形供给基质培养厌氧性氨氧化细菌时，注意不要使培养槽12内的亚硝态氮浓度急剧变高很重要。这也可以从表示在培养槽12内残留的亚硝酸的氮浓度和厌氧性氨氧化细菌的活性的关系的图6得知。
图6是表示急剧升高培养槽12内的亚硝酸的氮浓度，求得残留于培养槽12内的亚硝酸的氮浓度和厌氧性氨氧化细菌的活性的关系的图。
从图6可知，残留于培养槽12内的亚硝酸的氮浓度如果为50mg/L以下，则活性为100，但如果超过50mg/L，则活性逐渐降低，如果超过70mg/L，则活性急剧降低。因而，在向培养槽12中阶段形供给基质来使其增加的情况下，优选对每个阶段增加的培养槽12内的亚硝态氮浓度进行控制并使其最大不超过70mg/L，更优选控制为50mg/L以下。
另外，基质的供给速度的调节方法可以通过基质的浓度进行，也可以通过调节基质的供给流速。
序列表<110>日立工程设备建设株式会社井坂 和一角野立夫常田聪<120>厌氧性氨氧化细菌的培养方法和装置<130>HP2006-006<160>9<170>PatentIn version<210>1<211>468<212>DNA<213>未知<220>
<223>引起厌氧性氨氧化反应的浮霉菌(planctomycetes)属微生物；16SrRNA基因的DNA序列<400>1tcgagaatct ttcgcaatgc ccgaaagggt gacgaagcga cgccgcgtgc gggaagaagg 60
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权利要求
1.一种厌氧性氨氧化细菌的培养方法，是以亚硝酸和氨为基质在培养槽中培养进行厌氧脱氮的厌氧性氨氧化细菌的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，当将所述基质的供给速度设为Y、将所述基质的供给常数设为K、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、将培养运转开始时的基质浓度设为A时，从所述厌氧性氨氧化细菌已进入对数增殖期开始，对提供给所述培养槽中的基质的供给速度Y进行控制，以便满足下式Y＝A×exp(K×T)。
2.根据权利要求1所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，以所述厌氧性氨氧化细菌具有的16SrRNA基因为基础的DNA碱基序列的特定区域，含有序列表的序列编号1～9所示的序列中的至少一种以上的序列。
3.根据权利要求1或2所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，提供给所述培养槽的氨和亚硝酸的比率被控制在1∶0.5～2.0的范围。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，所述基质的供给常数K被设定在0.05～0.28的范围。
5.根据权利要求1～3中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，所述基质的供给常数K被设定在0.06～0.15的范围。
6.根据权利要求1～3中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，所述基质的供给常数K被设定在0.07～0.12的范围。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，与用所述式子Y＝A×exp(K×T)表示的增加曲线接近而使所述基质供给速度Y阶段形增加，同时对每个阶段增加的培养槽内的亚硝态氮浓度进行控制并使其最大不超过70mg/L。
8.根据权利要求1～7中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养方法，其中，从所述厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期的时刻开始，根据向所述培养槽中供给的基质浓度与从所述培养槽排出的液体中所残存的基质浓度之间的差，求得实际的基质消耗速度y，在将所述基质的消耗速度设为y、所述基质的消耗常数设为k、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、培养运转开始时的基质浓度设为a时，根据用y＝a×exp(K×T)表示的基质消耗速度的式子和所述已求得的基质消耗速度y，算出基质的消耗常数k，设定所述供给常数K并使其与所述已算出的消耗常数k一致。
9.一种厌氧性氨氧化细菌的培养装置，是以亚硝酸和氨为基质在培养槽中培养进行厌氧脱氮的厌氧性氨氧化细菌的厌氧性氨氧化细菌的培养装置，其中，具备供氨机构，其以规定浓度向所述培养槽中供给所述基质的一方的氨；供亚硝酸机构，其以规定浓度向所述培养槽中供给所述基质的另一方的亚硝酸；和控制机构，其在将所述基质的供给速度设为Y，将所述基质的供给常数设为K，将进入对数增殖期后的培养天数设为T，将培养运转开始时的基质浓度设为A时，从所述厌氧性氨氧化细菌进入对数增殖期开始，对提供给所述培养槽的基质的供给速度Y进行控制，以满足Y＝A×exp(K×T)。
10.根据权利要求9所述的厌氧性氨氧化细菌的培养装置，其中，以所述厌氧性氨氧化细菌具有的16SrRNA基因为基础的DNA特定区域，含有序列表的序列编号1～9所示的序列中的至少1种以上的序列。
11.根据权利要求9或10所述的厌氧性氨氧化细菌的培养装置，其中，具备所述控制机构对所述供氨机构与所述供亚硝酸机构进行控制，以使提供给所述培养槽的氨和亚硝酸的比率在1∶0.5～2.0的范围。
12.根据权利要求9～11中任意一项所述的厌氧性氨氧化细菌的培养装置，其中，具备对提供给所述培养槽的基质浓度进行测定的第1测定机构，和对从所述培养槽排出的液体中所残存的基质浓度进行测定的第2测定机构；所述控制机构根据所述第1测定机构的测定结果和所述第2测定机构的测定结果的差，求得基质消耗速度y，当将所述基质的消耗速度设为y、所述基质的消耗常数设为k、将进入对数增殖期后的培养天数设为T、培养运转开始时的基质浓度设为a时，用求得的基质消耗速度y和式子基质消耗速度y＝a×exp(K×T)计算出基质的消耗常数k，根据已算出的消耗常数k，设定所述供给常数K。
全文摘要
本发明提供一种厌氧性氨氧化细菌的培养装置(10)，其是以亚硝酸和氨为基质在培养槽(12)中培养进行厌氧脱氮的新型厌氧性氨氧化细菌，具备以规定浓度向培养槽(12)中供给氨的供氨机构14，和以规定浓度向培养槽(12)中供给亚硝酸的供亚硝酸机构16，和对基质的供给速度Y进行控制的控制装置(22)。由此，本发明可以在以氨和亚硝酸为基质的厌氧性氨氧化细菌的培养中，在没有浪费的情况下提供基质并生成菌体浓度高的种污泥，或者在短期内进行运转的调试。
文档编号C12N15/31GK1834231SQ20061006783
公开日2006年9月20日 申请日期2006年3月14日 优先权日2005年3月14日
发明者井坂和一, 角野立夫, 常田聪 申请人:日立工程设备建设株式会社