专利名称：一种块菌多糖的制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程与技术领域，具体涉及一种液体深层发酵生产块菌多糖的方法，适用于将块菌多糖开发成抗癌、增强免疫力的药物进行工业化大规模生产。
背景技术：
块菌在生物分类学上属于子囊菌亚门(Ascomycotina)、块菌目(Tuberales)、块菌科(Tuberaceae)、块菌属(Tuber)。常见的块菌有黑孢块菌(Tuber melanosporum Vittad)、印度块菌(Tuber indicum Cooke)、中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)。目前国际市场上每公斤新鲜黑孢块菌的价格高达1000多美元，其昂贵的价格和黑色、疣状的外形使之被赋予森林中“黑钻石”的美誉。块菌多糖是块菌中的主要生物活性物质，块菌多糖是一种糖蛋白，水溶性好、毒性低、抑制肿瘤作用明显。1994年中国药科大学林涛等指出，块菌多糖有望开发为抗肿瘤免疫疗法的药物。由于野生块菌大多生长在碱性土壤环境，且与橡树、栎树等树种的根系共生，受气候条件的影响产量不稳定，同时受虫害和人工采集损伤程度的不同使其品质较难以控制，众多因素导致了块菌产量供不应求、价格一直居高不下。因此，若采用块菌子实体来生产块菌多糖，因受其原料的限制而无法工业化生产。
考虑到野生块菌的以上众多不利因素，不少学者进行了块菌的半人工模拟栽培研究，希望通过人工化的接种和管理来大规模的商业化生产块菌的子实体。
2003年弓明钦等对黑孢块菌的菌丝体进行纯培养，20天后匀浆制成液体菌剂，接种于灭菌的云南松、马尾松、藜蒴、栓皮栎、高山栎等树种幼苗的根部。接种后的苗木置于垫有塑料薄膜的常规苗床上，自然条件下进行培育。通过电镜观察其在不同的pH条件下对苗木的感染效果，实验发现该方法对供试的四个树种均有较好的感染效果，接种6个月的菌根感染率达90-100％。在接种量为2-4毫升，pH值为6.5-7.0的室内条件下可以形成较好的菌根化苗木，可以进一步进行田间造林试验。
2004年胡炳福等对印度块菌的人工栽培进行了研究。该研究将印度块菌的子囊果清洗、消毒后匀浆成孢子悬液，分别以6-8×104个孢子/毫升和16-18×104个孢子/毫升接种于无菌的马尾松、华山松和麻栎、槲栎芽苗，然后在塑料大棚内的营养基质上进行培育。实验结果显示供试验的7种苗种的根系均能形成菌根，感染率达89.66-100％，同时菌根化的苗木使苗期病害株死亡率降低51.97-100％。
半人工模拟栽培虽然一定程度上能解决野生块菌产量不足的问题，但从接种到收获一般需要7-9年时间，周期长、投资大。栽培的过程中要有专门的管理人员对其进行施肥、灌溉、保护不受野兽的破坏等，工作量大、见效慢，同时受自然环境中的气候等因数影响较大，品质难以保证。
因此，如果采用块菌子实体作为块菌多糖工业化生产的原料，无论是野生还是半人工模拟栽培均不能解决其价格昂贵和产量有限等问题。块菌作为一种高等真菌具有可培养性，能够通过廉价的培养基采用发酵的方法快速简单地获得大量的块菌菌丝体及块菌多糖。同时可以通过代谢调控的手段使其在液体深层发酵过程中有针对性地生物合成块菌多糖，该方法在很大程度给块菌多糖的大规模工业化生产提供了一种新思路，有望进一步挖掘块菌产业的商业价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种块菌多糖的制备方法，该方法切实可行、操作简单、周期短、质量可控、成本低，易规模化生产。
本发明的技术方案以中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)为出发菌株，有关该菌株的内容详见参考文献(陈惠群，刘洪玉。中国块菌主要生理特性初步研究，食用菌学报，1998，5(4)26-30)，采用斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养、和液体深层发酵来生产块菌胞外多糖。
实现本发明的具体步骤如下1、斜面菌种培养斜面菌种培养基配方为麦芽糖30-150克/升、硫酸镁0.1-10克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、琼脂10-30克/升、马铃薯提取液1.0升、pH值5-8。灭菌条件为121℃、20分钟。将中国块菌接种于新鲜配置的斜面培养基中，置于生化培养箱内培养，培养温度15-40℃，培养时间2-20天。
2、一级液体种子培养将步骤1中所培养的斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，一级液体种子培养基配方为麦芽糖30-150克/升、蛋白胨5.0-50克/升、硫酸镁0.1-10克/升、磷酸二氢钾0.1-10克/升、pH值5-8；培养温度15-40℃，摇床转速50-300转/分钟，培养时间2-20天。该培养液即为含有菌种的一级液体种子。
3、二级液体种子培养将步骤2中所培养的一级液体种子转接入摇瓶中进行二级液体种子培养，一级液体种子培养基的配方与二级液体种子培养基的配方相同；培养条件为接种量按体积比计为10％、培养温度15-40℃、摇床转速50-300转/分钟、培养时间2-10天。该培养液即为含有菌种的二级液体种子。
4、液体深层发酵将步骤3中所培养的二级液体种子转接摇瓶进行液体深层发酵，发酵培养基配方为麦芽糖30-150克/升、蛋白胨5.0-50克/升、硫酸镁1.0-10克/升、磷酸二氢钾1.0-10克/升、pH值5-9。发酵条件接种量按体积比计为10％、培养温度15-40℃、摇床转速50-300转/分钟、发酵时间2-20天。
5、块菌胞外多糖的测定将步骤4中所获得的含有菌丝体的发酵液离心(5000转/分钟、30分钟)，取其上清液用于块菌胞外多糖的测定。采用乙醇沉淀法来获得液体深层发酵所获得的块菌胞外多糖，发酵上清液加入四倍体积的无水乙醇，混匀后静置过夜，13000转/分钟离心4-6分钟后取沉淀，用等量的80％乙醇清洗后在13000转/分钟下离心4-6分钟就可以得到纯度较高的胞外多糖，其浓度用浓硫酸-苯酚法来测定。详细步骤见参考文献，M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugarsand related substances，Anal.Chem.1956，(28)350-356.
本发明结束发酵的标准是块菌多糖的产量达到最高值，一般此时发酵液开始变得粘稠发黄，镜检发现菌丝出现衰老现象。
本发明的有益效果本发明的技术方案适用于大规模的液体深层发酵生产块菌多糖，避免了从块菌子实体中提取多糖过程中原料有限而导致价格昂贵等不利因素，同时块菌多糖作为一种具有抑制肿瘤作用的生物活性物质，目前还没有相关的产品上市，因此具有广阔的发展空间。如目前欧美市场上每千克新鲜的黑孢块菌的价格高达1000美元，云南产新鲜的中国块菌的市场价亦达到400元/公斤。昂贵价格直接影响着以块菌子实体为原料进行块菌多糖的生产；应用块菌液体深层发酵的方法仅需利用常见的碳源、氮源和无机盐类物质就能比较容易地获得大量的块菌胞外多糖。
早在1994年中国药科大学的林涛等就研究了块菌多糖的应用效果，通过实验证明了块菌多糖具有抗肿瘤等活性(胡慧娟，李佩珍，林涛等。块菌多糖对小鼠肿瘤及免疫系统的影响。中国药科大学学报，1994；25(5)289-292)。实验通过连续10天给药接种有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，发现25mg/kg、50mg/kg的块菌多糖能明显的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生长。同时通过连续给药发现块菌多糖对小鼠脾脏的重量、外周血中的白细胞数及T淋巴细胞百分率具有明显的增加作用，促进了T淋巴细胞转化，提高了小鼠血清中IgG水平。
与从块菌子实体中提取块菌多糖相比，利用块菌发酵法生产块菌多糖具有成本低、周期短、操作简单、易培养、质量可控、可以有效的防止重金属含量超标和农药残留等优势。同时，通过生物工程原理可以进行发酵过程的自动化控制，实现块菌发酵的连续化高效生产，在节省劳动力的同时也为工业化需求提供充足的原料保证。利用微生物代谢工程的原理，亦可以有针对性地对块菌菌丝体的生长进行代谢调控，使代谢流朝着有利于块菌多糖生成的方向进行。
综上所述，国内外至今尚没有通过液体深层发酵法生产块菌多糖的研究报道，因此，尽快开发研究出一种廉价易行的块菌多糖生产的新工艺无疑具有广阔的开发前景。
具体实施例方式
实施例1采用的菌种中国块菌(Tuber sinense Tao et Liu)。
A斜面菌种培养本实施例中所采用的斜面菌种培养基配方为麦芽糖50克/升、硫酸镁5克/升、磷酸二氢钾5克/升、琼脂15克/升、马铃薯提取液1.0升、pH值为5或6或7或8。灭菌条件为121℃、20分钟。培养温度为15或18或22或27或30或34或37或40℃，培养时间为2或4或8或10或12或15或17或20天。
B一级液体种子培养本实施例中一级液体种子、二级液体种子培养基的配方均为麦芽糖70克/升、蛋白胨25克/升、硫酸镁5克/升、磷酸二氢钾5克/升、pH值与A步骤相同。将斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中即可进行一级液体种子培养。培养温度与A步骤相同，摇床转速为200转/分钟，培养时间与A步骤相同，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体。
C二级液体种子培养本实施例中二级液体种子的培养基配方和一级液体种子培养基的配方相同，培养温度与A步骤相同，摇床转速为200转/分钟，培养时间为2或4或6或8或10天，接种量按体积比计为10％，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体。
D液体深层发酵本实施例中液体深层发酵培养基的配方为麦芽糖80克/升、蛋白胨30克/升、硫酸镁5克/升、磷酸二氢钾6克/升、pH值与A步骤相同。发酵温度与A步骤相同，摇床转速为200转/分钟，培养时间与A步骤相同。接种量按体积比计为10％，装液量为每250毫升摇瓶装50毫升液体。
E、块菌胞外多糖的测定胞外多糖的测定主要参考文献M.Dubois，K.A.Gilles，J.K.Hamilton，et al.Colorimetric method for determination of sugars and relatedsubstances，Anal.Chem.1956，(28)350-356。具体实施步骤如下将含有菌丝体的发酵液离心(5000转/分钟、30分钟)，将发酵液离心后获得的上清液用于块菌胞外多糖的测定，采用乙醇沉淀法测定液体深层发酵所获得的块菌胞外多糖取200微升离心后的上清液加入800微升的无水乙醇，混匀后静置过夜，13000转/分钟离心5分钟后取沉淀，用1毫升80％乙醇清洗后在13000转/分钟下离心5分钟就可以得到纯度较高的胞外多糖。浓度用浓硫酸-苯酚法来测定，向得到的胞外多糖中加入1摩尔/升的氢氧化钠1毫升，60℃保温1小时，冷却后取500微升补水至1毫升；加入5％苯酚1毫升，混匀后加入浓硫酸5毫升，25℃保温25分钟后于488nm下比色。用分析纯的葡萄糖以同样的方法制作标准曲线，最后通过回归方程计算出块菌胞外多糖产量达到1.60克/升。
实施例2-9斜面菌种培养基中麦芽糖的浓度分别为30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.23克/升、1.60克/升、1.95克/升、1.78克/升、1.65克/升、1.56克/升、1.06克/升、0.81克/升。
实施例10-17斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，斜面菌种培养基中硫酸镁的浓度分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.21克/升、0.26克/升、0.56克/升、1.54克/升、2.01克/升、1.85克/升、1.06克/升、0.93克/升。
实施例18-25斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，斜面菌种培养基中磷酸二氢钾分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.21克/升、0.53克/升、0.88克/升、1.23克/升、2.01克/升、1.94克/升、1.06克/升、0.75克/升。
实施例26-33斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，一级液体种子培养基中麦芽糖的浓度分别为30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.85克/升、1.10克/升、1.15克/升、1.95克/升、1.60克/升、1.40克/升、1.21克/升、0.85克/升。
实施例34-41斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，一级液体种子培养基中蛋白胨的浓度分别为5.0克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、50克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.28克/升、0.62克/升、0.74克/升、1.23克/升、1.95克/升、1.60克/升、1.23克/升、0.75克/升。
实施例42-49斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，一级液体种子培养基中硫酸镁的浓度分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.29克/升、0.35克/升、0.93克/升、1.35克/升、1.95克/升、1.42克/升、1.18克/升、1.01克/升。
实施例50-57斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，一级液体种子培养基中磷酸二氢钾的浓度分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.25克/升、0.60克/升、1.18克/升、1.25克/升、1.95克/升、1.27克/升、1.13克/升、0.80克/升。
实施例58-66斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，二级液体种子培养基中麦芽糖的浓度分别为30克/升、50克/升、60克/升、70克/升、90克/升、110克/升、130克/升、150克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.56克/升、2.23克/升、2.03克/升、1.95克/升、1.51克/升、1.35克/升、1.10克/升、0.88克/升。
实施例67-74斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，二级液体种子培养基中麦芽糖的浓度50克/升。二级液体种子培养基中蛋白胨的浓度分别为5克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、50克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.56克/升、1.66克/升、1.95克/升、2.08克/升、2.26克/升、2.01克/升、1.56克/升、1.10克/升。
实施例75-82斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，二级液体种子培养基中麦芽糖的浓度50克/升。二级液体种子培养基中硫酸镁的浓度分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为0.27克/升、0.43克/升、1.05克/升、1.38克/升、2.21克/升、1.45克/升、1.09克/升、1.02克/升。
实施例83-90斜面菌种培养基中麦芽糖为60克/升，二级液体种子培养基中麦芽糖的浓度50克/升。二级液体种子培养基中磷酸二氢钾的浓度分别为0.1克/升、0.5克/升、1克/升、2克/升、5克/升、7克/升、9克/升、10克/升，其它培养条件与实施例1相同。分析测试结果，块菌胞外多糖的产量分别为1.30克/升、1.56克/升、1.78克/升、2.26克/升、2.30克/升、2.25克/升、1.98克/升、0.95克/升。
权利要求
1.一种块菌多糖的制备方法，它包括下列步骤A、斜面菌种培养斜面菌种培养基克/升为麦芽糖30-150、硫酸镁0.1-10、磷酸二氢钾0.1-10、琼脂10-30、马铃薯提取液1.0升、pH值为5-8，灭菌条件为121℃、20分钟，将中国块菌接入新鲜配置的斜面培养基中，置于生化培养箱内培养，培养温度15-40℃，培养时间2-20天；B、一级液体种子培养将步骤A中培养的斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养，一级液体种子培养基克/升为麦芽糖30-150、蛋白胨5-50、硫酸镁0.1-10、磷酸二氢钾0.1-10、pH值与A步相同；培养温度与A步相同、摇床转速50-300rpm、培养时间与A步相同；该培养液即为含有菌种的一级液体种子；C、二级液体种子培养将步骤B中培养的一级液体种子转接入摇瓶中进行二级液体种子培养，一级液体种子培养基的配方与二级液体种子培养基的配方相同；培养条件为接种量按体积比为10％、温度与A步相同、摇床转速与B步相同、培养时间2-10天；该培养液即为含有菌种的二级液体种子；D、液体深层发酵将步骤C中培养的二级液体种子转接摇瓶进行液体深层发酵，发酵培养基配方与B步相同，pH值为5-9，发酵条件接种量与C步相同、温度与A步相同、摇床转速与B步相同、发酵时间与B步相同；E、块菌胞外多糖的测定将步骤D中所获得的含有菌丝体的发酵液离心/5000rpm、30分钟，取其上清液用于块菌胞外多糖的测定，采用乙醇沉淀法测定液体深层发酵所获得的块菌胞外多糖，发酵上清液加入四倍体积的无水乙醇，混匀后静置过夜，13000rpm离心4-6分钟后取沉淀，用等量的80％乙醇清洗后在13000rpm下离心4-6分钟得到胞外多糖。
全文摘要
本发明公开了一种块菌多糖的制备方法，其步骤首先是将中国块菌菌种接入新鲜的斜面菌种培养基中进行斜面菌种培养；其次是将斜面菌种转接入装有一级液体种子培养基的摇瓶中进行一级液体种子培养；第三是将一级液体种子转接摇瓶中进行二级液体种子的扩大培养；第四是将二级液体种子转接摇瓶进行液体深层发酵；第五是块菌胞外多糖的测定。本发明过程结束时发酵液中的胞外多糖产量可达2.30克/升，制备的块菌多糖具有抑制肿瘤的活性。本发明操作简单，成本低，有利于进一步工业化放大及推广应用。
文档编号C12R1/645GK1986827SQ20061016650
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者汤亚杰, 李冬生, 孔国平 申请人:湖北工业大学