用于小球藻异养培养的低磷培养基的制作方法

专利名称：用于小球藻异养培养的低磷培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物工程技术领域微藻培养基，具体是一种小球藻异养 培养的低磷培养基。
背景技术：
小球藻是一种单细胞微藻，含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、维生素 和小球藻生长因子等多种营养及活性成份，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力和 预防心血管疾病等生理功能。小球藻的培养目前以开放式光照自养培养方式为 主，其缺点是占地面积大、受自然条件和季节气候的影响和限制、产量质量难以 维持稳定、生长速度慢、生物量低(在小球藻自养培养中，细胞浓度通常为200 -600 mg细胞干重/1)、易受到异种生物的污染或吞食而造成培养的失败、小球 藻的收获成本较高等。与自养培养方式相比，异养培养方式具有以下优点不受 环境和气候等条件的限制；可保持纯培养，保证产品质量的稳定和均一性；能够 获得较高的细胞浓度和生产效率，降低生产成本；可借鉴和利用比较成熟的工业 发酵技术和生产设备等，因而近年来日益受到国内外学者的关注。
磷是细胞生长所必需的营养元素，与细胞的ATP、核酸以及其它细胞组份的 合成密切相关，因而是培养基中的重要组分。但长时间以来，关于小球藻对磷的 吸收利用，尤其是异养培养条件下小球藻对磷的吸收利用报道很少。
Basal培养基自1958年以来被广泛应用于培养微藻，但研究结果显示，在 绝大多数培养条件下，该培养基中的磷浓度均远高于小球藻生长所需。例如，研 究结果表明，在10 g起始葡萄糖/1浓度下，Basal培养基中的P043—_P浓度为小 球藻异养生长实际需求量的6. 25 - 62. 5倍，造成培养结束后培养基中的磷残留。 较高浓度的磷残留不仅是一种资源浪费，而且可能造成湖泊及其它天然水体的富 营养化。因此，确定培养基中合适的磷浓度范围，不仅可以降低生产成本，而且 可以有效减少排放废水中的磷含量，减轻废水处理压力，利于环境保护。
目前关于小球藻异养培养的培养基研究主要集中在碳和氮方面，而关于小球
藻对磷元素吸收利用的研究则多在自养条件下进行，包括小球藻对废水中磷的去 除、对磷的超量吸收、氮磷比对小球藻生长的影响等。
经对现有技术的文献检索发现，史贤明等在《ProcessBiochemistry》(生 物化学进展，1999; 34: 341-347)上发表的{Production of biomass and lutein by Chlorella protothecoides at various glucose concentrations in heterotrophic cultures (不同葡萄糖浓度下异养培养原壳小球藻生物量和叶黄 素的生产)》 一文，文中提出在异养培养条件下，培养基中不同葡萄糖浓度对小 球藻生物量和叶黄素产量的影响，具体技术内容为葡萄糖浓度在IO， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80和100g/l的摇瓶培养条件下，10和40g/l的发酵罐培养条件 下，其对小球藻生物量和叶黄素产量的影响，并给出了适合的动力学模型。其不 足在于(1)未研究异养培养条件下小球藻对磷的吸收特性，和碳磷比值对小 球藻生长和生物量的影响；(2)按照文中给出的技术方案，Basal培养基中的磷 含量严重过量，培养结束后在培养基中残留较高浓度的磷，造成资源浪费和环境 污染。

发明内容
本发明的目的在于改进现有技术的不足，提供一种用于小球藻异养培养的低 磷培养基，使其用于小球藻异养培养，相对原Basal培养基，在不降低小球藻异 养培养产量水平的前提下，减少了磷用量，可直接降低生产成本、减少污染源。
本发明是通过以下技术方案实现的，在Basal培养基的基础上，依据小球藻 生长消耗的碳磷、碳氮比值，参照Basal培养基，小球藻异养培养的低磷培养基 组份及其浓度含量(mg/l): Glucose H20 5000 - 50000， KH2P04 10 -1000，認03 300 — 7500， MgS04 7H20 1 000 - 12 50， EDTA 500 - 625， H3B03 114. 2 — 142. 75， CaCl2 2H20 111 - 138. 75， FeS04 7H20 49. 8 - 62. 25， ZnS04 7H20 88 . 2 - 110. 25， MnCl2 4H20 1 4. 2 — 17 . 75， Mo03 7. 1 — 8. 875， CuS04 5H20 15. 7 - 19. 625， Co(N03)2 6H20 4. 9 - 6. 125。
根据上述的组份及组份浓度，准确称量培养基各组份，用水溶解定容，调节 pH到6. 1 - 6. 5， 121 。C灭菌20分钟，冷却到30 。C以下，即获得用于小球藻 异养培养的低磷培养基产品。
本发明用自来水，或自来水和啤酒废水按一定比例配合溶解使用。
本发明的基本原理是根据小球藻培养过程中所消耗的碳磷、碳氮比值，按物质摩尔比计算，碳磷比值为206/1 - 2060/1，碳氮比值为20/1 - 51/1，通过 以上方案调整配方组份含量，降低培养基中磷、氮含量，以达到在不降低小球藻 异养培养产量水平的前提下，消除培养结束后培养液中的磷残留，减少污染源和 对环境危害，直接降低生产原料投入，提高生产效益。
与现有技术相比，在小球藻培养中应用本发明提供的低磷培养基，KH2P04的 用量仅为原Basal配方的1.6% -16%，但小球藻培养的接种量、比生长速率、 生物量产量、生物量对葡萄糖转化率、生长趋势、培养时间达到原Basal培养的 相当水平，经济和环保效益显著，体现了小球藻的生态化生产。


图l 5 g起始葡萄糖/1， 2.28 mg起始磷酸根磷/1， 19-1发酵罐中进行的小 球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中□，生物量；△，葡萄糖；X，磷酸根磷。
图2 10 g起始葡萄糖/1， 22.8 mg起始磷酸根磷/1， 19-l发酵罐中进行的 小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中□，生物量；△,葡萄糖；X，磷酸根磷。
图3 40 g起始葡萄糖/1， 22.8 mg起始磷酸根磷/1， 19-1发酵罐中进行的 小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中□，生物量；△，葡萄糖；X，磷酸根磷。
图4 50 g起始葡萄糖/1， 228 mg起始磷酸根磷/1， 19_1发酵罐中进行的小 球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中□，生物量；△，葡萄糖；X，磷酸根磷。
图5 10 g起始葡萄糖/1， 4.56 mg起始磷酸根磷/1， 19-l发酵罐中进行的 小球藻异养流加培养试验的曲线示意图。
其中□，生物量；△，葡萄糖；X，磷酸根磷。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。
下列实施例中未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，例如生化实验方 法和技术(高等教育出版社，1997)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l:
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l): Glucose H20 5 0 00， KH2P0410， KN03 300， MgS04 *7H20 1 000， EDTA 500， H3B03114.2， CaCl2 2H20 111， FeS04*7H20 49. 8， ZnS04 '7H20 88. 2， MnCl2 4H20 14. 2， Mo03 7. 1， CuS04 '5仏0 15. 7， Co(N03)2 6H20 4.9。
用于19-1发酵罐小球藻异养分批培养，培养基用自来水溶解配制，装量12 1， 121 'C灭菌20分钟，冷却到3(TC以下。培养条件接种量8% (v/v)， pH 6. 5， 温度28 °C，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50%。
5g起始葡萄糖/1， 2.28mg起始磷酸根磷/1，小球藻生长迅速，最大细胞 浓度为2.6 g/l，说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中P043—-P 基本耗尽(图1)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施低浓度碳的发酵 罐分批培养。
实施例2:
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l): Glucose *H20 10000， KH2P04 100， 跳1250， MgS04 '7H20 1 000， EDTA 500， H3B03114. 2， CaCl2 '2H20 111， FeS04 49. 8， ZnS04 '7H20 88 . 2， MnCl2 4H20 14. 2， Mo03 7. 1， CuS04 '5H20 15. 7， Co (N03) 2 6H20 4.9。
用于19-1发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12 1， 121 。C灭菌20分钟，冷却到30。C以下。培养条件接种量10% (v/v)， pH6. 5， 温度28 °C，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50%。
培养至48小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为5. 5 g/l， 说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中P043—-P基本耗尽(图2), 结果证明应用本发明的培养基，可成功实施中浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例3:
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/1): Glucose *H20 40000， KH2P04 100， KN03 5000， MgS04 '7H20 1000， EDTA 500， H3B03114. 2， CaCl2 '2H20 111， FeS04 '7H20 49. 8， ZnS04 '7^0 88. 2， MnCl2 4H20 14. 2， Mo03 7. 1， CuS04 '5H20 15. 7， Co(N03)2 6H20 4.9。
用于19-1发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12 1， 121 。C灭菌20分钟，冷却到3(TC以下。培养条件接种量腦(v/v)， PH6. 5， 温度28 。C，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50%。
培养至84小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为21 g/1， 说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中P0广-P基本耗尽(图3)， 结果证明应用本发明的培养基，可成功实施高浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例4:
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l): Glucose *H20 50000， KH2P04 1000， KN03 7500， MgS04 7H20 1 2 50， EDTA 625， H3B03 142. 75， CaCl2 2H20 1 38 . 75， FeS04 *7H20 62 . 25， ZnS04 '7H20 110 . 25， MnCl2 '4H20 17. 75， Mo03 8. 875， CuS04 '5貼 19.625， Co(N03)2 6H20 6. 125。
用于19-1发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12 1， 121 。C灭菌20分钟，冷却到30。C以下。培养条件接种量10% (v/v)， pH6. 5， 温度28 °C，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50%。
培养至95小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为26 g/l， 说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中P043—-P基本耗尽(图4)， 结果证明应用本发明的培养基，可成功实施高浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例5:
小球藻流加培养的前期低磷培养基配方(mg/1): Glucose *H20 1 00 00， KH2P04 20， KN03 1000， MgS04.7H20 1 000， EDTA 500， H3B03 114.2， CaCl2 2H20 111， FeS04 7H20 49 . 8， ZnS04 7H20 88 . 2， MnCl2 4H20 14. 2， Mo03 7. 1， CuS04 5H20 15.7， Co(N03)2 6H20 4. 9。
用于19-1发酵罐小球藻流加培养的前期，培养基用自来水溶解配制，装量 12 1， 121 。C灭菌20分钟，冷却到30。C以下。培养条件接种量10% (v/v)， pH6.5，温度28 °C，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大 于50%。
补料培养液配方(mg/1): Glucose H20 4 1 70 00， KH2P04 834 (P043—-P 190)， ,3 52125， MgS04 7H20 41700， EDTA 20850， H3B03 4762. 14， CaCl2 2H20 4628. 7， FeS04 7H20 2 0 76 . 66， ZnS04 7H20 3 6 7 7 . 94， MnCl2 4H20 5 92. 14， Mo03 296. 07， CuS04 5H20 654. 69， Co(N03)2 6H20 2 04. 33。用自来水溶解配制，12FC灭菌20 分钟，冷却到30。C以下待用。
补料方案为0 - 31.5 h， 0 l/24h， 31.5 - 55.5 h， 0.29 l/24h， 55.5 -79. 5 h， 1. 13 l/24h; 79. 5 - 127. 5 h， 1. 54 l/24h。
培养结束后小球藻最大细胞浓度达到70 g/l左右，说明培养基中的磷浓度 能满足其生长所需，且培养基中PO/—-P基本耗尽(图5)，结果证明应用本发明 的培养基，可成功实施小球藻高浓度流加培养。
实施例6:
某啤酒公司一段工序废水CODcr: 5020 mg/1 BOD5: 1976 mg/1 NO/—-N: 18 mg/1 PO,-P: 10 mg/l。
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/1): Glucose'H20 1 00 00， KH2P04 20， 認03 300， MgS04'7H20 1 000， EDTA500, H3B03114.2， CaCl2 2H20 111， FeS04'7H20 49. 8， ZnS04 '7H20 88 . 2， MnCl2 4H20 14. 2， Mo03 7. 1 ， CuS04别20 15. 7， Co (N03) 2银O 4.9。
培养基用啤酒废水溶解，用250 ml锥形瓶，装量100ml，初始pH为6. 1， 121 。C灭菌20分钟，冷却到30 。C以下。培养条件接种量8% (v/v)， 28 °C, 180 rpm，无光培养。
用啤酒废水代替自来水进行小球藻的异养培养，能得到相同的培养产量，且 最终排放废水中的BOD、氮、磷都有很大程度(80%以上)的降低。结果证明应 用本发明的培养基，利用啤酒废水部分代替自来水进行小球藻异养培养是可行 的。
在上述培养基配方中，用本发明低磷培养基进行小球藻异养培养，相对原 Basal培养基，在不降低小球藻异养培养产量水平的前提下，减少了磷用量，提 高了经济效益。
权利要求
1.一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征在于，组份及其浓度含量mg/lGlucose·H2O 5000-50000，KH2PO4 10-1000，KNO3 300-7500，MgSO4·7H2O1000-1250，EDTA 500-625，H3BO3 114.2-142.75，CaCl2·2H2O 111-138.75，FeSO4·7H2O 49.8-62.25，ZnSO4·7H2O 88.2-110.25，MnCl2·4H2O 14.2-17.75，MoO3 7.1-8.875，CuSO4·5H2O 15.7-19.625，Co(NO3)2·6H2O 4.9-6.125。
2. 根据权利要求1所述的用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征是，所 述的培养基，按物质摩尔比计算，碳磷比为206/1 - 2060/1，碳氮比为20/1 -51/1。
3. 根据权利要求1所述的用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征是，所 述培养基用自来水，或自来水和啤酒废水配合溶解。
全文摘要
本发明涉及一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，属生物技术领域。本发明组份及其浓度含量(mg/l)Glucose·H₂O 5000-50000，KH₂PO₄ 10-1000，KNO₃ 300-7500，MgSO₄·7H₂O 1000-1250，EDTA 500-625，H₃BO₃ 114.2-142.75，CaCl₂·2H₂O 111-138.75，FeSO₄·7H₂O 49.8-62.25，ZnSO₄·7H₂O 88.2-110.25，MnCl₂·4H₂O 14.2-17.75，MoO₃ 7.1-8.875，CuSO₄·5H₂O 15.7-19.625，Co(NO₃)₂·6H₂O 4.9-6.125。在小球藻培养中应用本发明提供的低磷培养基，KH₂PO₄的用量仅为原Basal配方的1.6％-16％，但小球藻培养的接种量、比生长速率、生物量产量、生物量对葡萄糖转化率、生长趋势、培养时间达到原Basal培养的相当水平。
文档编号C12N1/12GK101173215SQ20071004768
公开日2008年5月7日 申请日期2007年11月1日 优先权日2007年11月1日
发明者史贤明, 吴正云, 施春雷, 曲春波 申请人:上海交通大学