专利名称：检测K-ras基因突变的PNA、探针、引物及方法
技术领域：
本发明涉及K-ms基因突变的检测，尤其涉及一种检测K-ras基因突 变的PNA、探针、引物及方法。
背景技术：
K-ras基因(GenBank:NCJ)00012)突变在胰腺癌的发生发展中起重 要作用。已报道，在胰腺癌组织、胰液或粪便、血液中可检测出K-ras 基因第12、 13或61密石马子点突变(Takahashi， et al. Gastrointestinal Endo 2005.61:76—9; Luigi L， et al. Oncogene 2002.21:4301—6; Tada M， et al. Cancer Res 1993. 53: 2472—4; Lu XH， et al. Natl Med J China 2001. 81: 1050 - 3; N van Heek， et al. J. Clin. Pathol. 2005. 58:1315-1320)。
研究表明，检测体细胞DNA中K-ras基因突变与否可作为胰腺癌早 期诊断的一种方法。但在一些实验中发现慢性胰腺炎及胆道结石等良性疾 病中也存在K-ras基因突变，单纯定性分析，特异性较差，定量分析能更 好反映突变程度，以便于良恶性鉴别。目前普遍应用的K-:ras基因突变检 测方法为限制性片断长度多态性分析法(RFLP法)和扩增受阻突变体系 法(ARMS法)。
RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下 缺点
4(1 )步骤烦琐，需要2天时间才能完成鉴定；
(2) 只能作定性研究，即只能明确是否存在K-ras基因突变，若要 求定量，则需用其他方法进行进一步检测；
(3) 存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。 ARMS法的原理是根据3'端错配原则，在进行扩增反应时，若3'
端碱基对形成错配，链延伸反应就会因3' ， 5' 二磷酸二酯键形成的障 碍而受阻，因此，只有模板链是特定的等位基因时，才会检测出特异的扩 增产物。在ARMS的反应体系中，引物上标记2个不同荧光素，或加入荧 光探针等方法都是以实时荧光PCR为基础的基因分型方法。 ARMS法的步骤包括
(1) 设计针对K-ras基因某一种突变类型的特异性引物或探针；
(2) 对己知突变量的标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；
(3) 对未知样本进行实时定量PCR检测，根据上述标准曲线，得出未 知标本突变量。
但是，该方法的缺点是
(1) 每种特异性引物或探针只能针对某一种基因突变类型进行鉴定， 而K-ras基因在第12、 13密码子的突变类型可有十余种，需要逐一检测；
(2) 可能出现由于单一碱基错配造成的假阳性。
肽核酸(P印tide Nucleic Acid， PNA)是一种DNA类似物，其骨架 由2-氨乙基甘氨酸取代了 DNA的磷酸二酯糖，其较之传统DNA探针具有 不少优点1. PNA十分稳定，正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相 应的DNA/DNA，同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物，亦不会被其他酶所降解；2.对于错配的PNA/DNA，哪怕只有一个碱基的错配， 也会造成其融解温度下降9一1(TC左右。目前，肽核酸已在多个领域得到 应用(张兵波等，《高分子通报》2006， 9:62-68; Egholm M， et al. Nature, 1993, 365:566 568)。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种检测K-ras基因突变的 PNA，只需设计一种针对野生型的PNA，进行一次PCR反应，即可区分野 生型与突变型，其通过与实时定量PCR相结合，可实时定量检测K-ras 基因突变量。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种检测K-ms基因突变的探针。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种检测K-ras基因突变的引物。
本发明要解决的技术问题之四是提供一种检测K-ras基因突变的方法。
本发明要解决的技术问题之五是提供一种检测K-ras基因突变的试 剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现 在本发明的一个方面，提供了一种检测K-ras基因突变的PNA，该
PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进
行杂交。
较佳地，所述PNA包含SEQ ID NO: 1或其互补序列的至少12个连续碱基。
更佳地，所述PNA的序列为
Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-COOH。
在本发明的另一方面，提供了一种检测K-ms基因突变的探针，所 述探针与野生型K-ras基因靶序列杂交，该探针序列包含SEQ ID NO: 2 或其互补序列的至少15个连续核苷酸。
较佳地，所述探针为SEQ ID NO: 2所示寡核苷酸序列。 在本发明的另一方面，提供了一种检测K-ras基因突变的引物，所 述引物用于扩增K-ras基因靶序列，包括以下引物对
(1) 第一引物序列含有SEQ ID NO: 3的至少15个连续核苷酸，第 二引物序列含有SEQ ID NO: 4的至少15个连续核苷酸；
(2) 第一引物序列含有SEQ ID NO: 5的至少15个连续核苷酸，第 二引物序列含有SEQ ID NO: 6的至少15个连续核苷酸。
较佳地，所述引物对包括SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6。
在本发明的另一方面，提供了一种检测K-ras基因突变的方法，包 括以下步骤
(1) 用上述PNA、探针、以及引物，对已知突变量的质粒标准品进行 实时定量PCR检测，得出标准曲线；
(2) 提取核酸样本；
(3) 用上述PNA、探针、以及引物，以步骤(2)提取的核酸为模板， 进行实时定量PCR检测；(4)根据步骤(1)所得的标准曲线，得出样本核酸的K-ras基因突变量。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测K-ras基因突变的试剂盒， 包括包括上述PNA、探针和引物。。
在本发明中，术语"探针"是指能识别特异核苷酸序列的带标记的 一段单链DNA或RNA分子，它只与被检测的特定核苷酸序列结合。探针位 置尽可能地靠近上游引物。为保证结合特异性，探针的合适长度一般在 15 45个核苷酸之间。
在本发明中，术语"引物"是指一种寡核苷酸，可以是天然的也可 以是合成的，它可以作为在一定条件下诱发DNA合成的起始点，在上述条 件下可以诱发合成与核酸链互补的引物扩增产物，即在四种不同的三磷酸 脱氧核糖核苷及一种聚合试剂(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在下，在一 种合适的缓冲液中并在合适的温度下进行上述合成。优选的引物是单股寡 脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用途，但一般在 15 25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模 板形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充 分互补，以与模板杂交并引发DNA合成。
由于采用上述技术方案，本发明的检测K-:ras基因突变的PNA、探针、 引物及方法，将PNA与实时定量PCR相结合，应用于K-ras基因检测，由 于PNA能同时覆盖K-ras基因第一外显子中第12、 13密码子的6个碱基， 任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温度发生明显改变，因此只 需设计一种针对野生型的PNA，进行一次PCR反应，即可将K-ras基因在第12、 13密码子的十余种突变型与野生型区分开。本发明方法操作简便、 敏感性高、特异性高，可实时定量检测K-ras基因突变量，并可应用于胰 腺癌等疾病的早期辅助诊断。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。 图1是本发明实施例1的质粒测序结果图； 图2是本发明实施例1的标准品扩增曲线图3是本发明实施例1的标准曲线图4是本发明实施例1的定量方法示意图。
具体实施例方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明采用联合肽核酸(PNA)的实时定量PCR法检测K-ras基因点 突变。所述K-ms基因可以是从粪便、组织、组织液、细胞珠及血液中提 取的DNA中的基因。因为PNA同时覆盖了 K-ms基因第一外显子中第12、 13密码子的6个碱基，任一突变均可导致PNA/DNA的错配，使得融解温 度发生明显改变，故只需设计一种针对野生型K-ras基因的PNA，进行一 次PCR反应，即可区分野生型与突变型。
实施例1对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测
1.主要试剂来源1.1 设计PNA
PNA是针对野生型K-ms基因第12、 13密码子设计的PNA，包含SEQ ID NO: 1或其互补序列的至少12个连续碱基，该PNA优选序列为 Ac-ACGCCACCAGCTC-Lysine-COOH (SEQIDNO: 1)，由韩国panagene公司 合成。
1.2 设计Tagman MGB探针
Tagman MGB探针与野生型K-ras基因耙序列杂交，该探针序列包含 SEQ ID NO: 2或其互补序列的至少15个连续核苷酸。所述探针优选为SEQ ID NO: 2所示寡核苷酸序列，即F層一AGCTCCAACTACCACAAG-MGB (SEQ ID NO: 2)，其两端分别以报告基团FAM及淬灭基团MGB标记，该探针由上海 基康工程技术服务有限公司合成。
1.3 PCR引物
本发明用于扩增K-ras基因靶序列的引物，包括以下引物对 上游引物Fl: 5' -TACTGGTGGAGTATTTGATA-3' (SEQIDNO: 3);
下游引物Rl: 5' -GAACTTTACTTTTCCTTGGGAGT-3' (SEQIDNO: 4);
上游弓1物F2: 5' -ATAGTGTATTMCCTTATGTGTGAC-3' (SEQ ID NO: 5);
下游引物R2: 5' -TTAGCTGTATCGTCMGGCACTCT-3' (SEQIDNO: 6)。 上述PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
1.4 TA克隆试剂盒
TA克隆试剂盒(Target Clone)购买于TOYOBO公司。 1.5质粒抽提试剂盒 质粒抽提试剂盒购买于TIANGEN公司。1.6 Taqman realtime PCR Master Mix购买于T0Y0B0公司。
2. 细胞株DNA抽提
选取胰腺癌细胞株Panc-l、 BxPC-3、 CFPAC及SW1990 (细胞株来自 本实验室)，用酚提取法常规抽提细胞株DNA，并使用DNA纯化试剂盒 (Tiangen公司)进行纯化。
使用Gene公司NanoDrop ND1000型核酸微量测量仪测定所抽提DNA 浓度(0D260/0D28(X. 0 2. 0)。经检测，DNA浓度分别为Panc-1, 517ng/ ul; BxPC-3， 337ng/ul; CFPAC, 425ng/ul; SW1990, 425ng/ul。
3. PCR反应
3. 1 PCR反应液配制
PCR反应体系包括10 X Ex Taq缓冲液2 P 1 ， dNTP混合液200 u M， 引物F1 (SEQIDNO: 3)、 Rl (SEQIDNO: 4)各O. 5线DNA模板100ng， Taq酶1U用无菌双蒸水定容至20 u 1 。
3. 2 PCR反应
所用仪器为德国E卯endorf公司5331型Thermal Cycler PCR仪。 PCR反应条件:94。C预变性5min， 94。C变性30s， 52。C退火40s， 72。C延 伸40s，共35个循环，72。C延伸10min。
3.3电泳
2. 0%琼脂糖凝胶电泳确定产物正确性。
4. PCR产物表达 4. 1表达菌株构建
将PCR产物通过T载体连接至E.coli DH5a (该大肠杆菌由本实验
ii室培养所得)构建质粒。
4. 1. l通过以下公式求得Xul以上的PCR产物X二 5 0Y + Z(Ykb: PCR产物的大小、Zng/ul: PCR产物浓度)。按以下组成配制T载体连接 液包括灭菌蒸馏水2ul、 2X连接缓冲液5lil、 pTA2载体(50ng/ul) lul、 T4DNA连接酶lul、 PCR产物liil，共10ul。将反应液于室温 (15 25°C)进行30分钟反应。
4. 1. 2制备感受态细胞，并加入上述连接液，用氯化钙方法转化大 肠杆菌，并进行X-gal和IPTG筛选(具体方法见《分子克隆实验指南》 第三版上册第96-99、 103页)。
4. 2质粒提取
挑取筛选所得的白色菌落，加入5ml预先加入氨苄青霉素(100mg/ml) 的LB培养基中，37"C振摇12 16小时。用Tiangen普通质粒小提试剂盒 (离心柱型)提取质粒。
4. 3质粒测序
质粒测序由invitrogen公司承接。
测序结果:BxPC-3为野生型K-ras基因(第12、 13密码子为GGTGGC)， Panc-l、 CFPAC及SW1990为突变株，第12、 13密码子分别突变为GJTGGC、 GITGGC、 GGTG厶C (见图1)。
5. 实时定量PCR 5.1标准品配制
根据测序结果，选取突变型细胞株Panc-l为标准品模板。 模板拷贝数换算拷贝数二质量/分子量X6. 02X 1023质粒分子量计算丽=(A碱基数X312) + (C碱基数X288) + (G 碱基数X328) + (T碱基数X303) —61"碱基数X324. 5;或是使用软 件DNAMAN计算。
本实验中合成的质粒为3457bp， WM&2131. 19Kda，因此lng质粒拷 贝数约为3X108。
将模板倍比稀释为107、 106、 105、 104、 103拷贝，作为标准品模板。 5.2 TaqMan MGB探针实时定量实验
选用针对K-ras基因耙序列的特异性Taqman MGB探针(SEQ ID NO: 2)，两端分别以报告基团F細及淬灭基团MGB标记。同样地，实验中PNA 能将野生型基因完全抑制，因此仪器所检测的荧光量可反应突变基因的拷 贝量。本发明由于不受引物二聚体影响，特异性高，定量也更准确。
5. 2. 1反应体系及反应条件
仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。
反应体系包括2 XTaqman realtime PCR Master Mix,引物F2 (SEQ ID NO: 5)、 R2 (SEQ ID NO: 6)各0.4yM， PNA (SEQ ID NO: 1) 3.75 UM， MGB探针(SEQ ID NO: 2) 0.3uM， DNA标准品模板为107、 106、 105、 104、 103拷贝，用无菌双蒸水定容至25ul。设定纯水为阴性对照(NTC)。
PCR反应条件95。C预变性60s，之后95。C变性15s， 70。CPNA结合 10s， 6(TC退火60s，共40个循环。
检测结果如图2所示，图2为标准品扩增曲线，在该图中，上升的 五条曲线自左向右依次分别代表稀释倍比为107、 106、 105、 104、 103拷贝 的标准品模板。图2中，横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。5.2.2标准曲线绘制
根据步骤5. 2中检测的荧光强度和图2的检测结果，绘制标准曲线 (见图3)。在图3中，横轴指拷贝数的对数值，纵轴指Ct值，标准曲线 的斜率为-6.4，截距(Interc印t)为56. 02， R2为0.998。 5. 2. 3定量方法
选用同一系列倍比稀释的质粒标准品(Pancl)，分成两组， 一组标 准品反应体系中不加PNA，另一组加入PNA(终浓度为3. 75u M)。同时， 待检模板也同样分为两组。反应结束后，利用两组标准品分别制作标准曲 线，分别进行待检样本的定量。其中，对于未加入PNA的反应，野生型与 突变型均扩增，结果计算出的模板量为野生型基因与突变型基因的总拷贝 数；而加入PNA的反应，因为野生型基因受到抑制而无扩增，结果所得的 模板量即为样本中所含的突变型基因的拷贝数(见图4)。
实施例2临床样品(以血液和粪便样品为例)中K-ras基因突变的
检测
1. 收集临床胰腺癌、慢性胰腺炎患者及正常人的粪便及血液，抽提
DNA。
2. 血液DNA抽提方法①抗凝全血0. 5 12ml;②加入500 700ul TT缓冲液，剧烈振荡后，低温离心机以每分钟12000转离心5分钟；③ 收集沉淀，重复2， 3步骤，直至沉淀为无色；④加入200ulPCR裂解液A; ⑤37。C水浴过夜；⑥抽取PCR裂解物(约200ul)，加入200ul酚氯仿， 充分混匀后，以每分钟12000转离心20分钟；⑦取上清，加入200ul氯 仿充分混匀，12000转/分离心10分钟；⑧取上清，加入100ul乙酸铵及2倍体积无水乙醇(约700ul)充分混匀，静置1分钟后，12000转/分离 心10分钟；⑨弃上清加入lml 70%乙醇洗涤，12000转/分离心5分钟； ⑩弃上清，自然风干，用100ulTE液溶解沉淀，分装于—80。C保存。
3. 粪便DNA抽提方法采用Qiagen公司的QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒进行。
4. DNA浓度测定方法同实施例1的步骤2。
5.按照实施例1的5. 2. 1，对标本进行K-ras基因的PNA钳制定量PCR 法检测。
6.结果分析根据标准曲线，得出胰腺癌K-ras基因突变拷贝数及 突变型与野生型的比例。序列表
〈110>上海长海医院
〈120〉检测K-ras基因突变的PNA、探针、引物及方法
〈130〉 NP-07-11849
〈160〉 6
〈170〉 Patentln version 3. 3
〈210> 1
〈211〉 13
<212> 腿 〈213〉人工序列
〈400> 1
acgccaccag etc 13
〈210〉 2
〈211〉 18
〈212〉 薩 〈213>人工序列
〈400> 2
agctccaact accacaag 18
〈210〉 3
〈211> 20
〈212> ■ 〈213>人工序列〈220〉
〈221> misc一feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
〈400〉 3
tactggtgga gtatttgata 20
〈210〉 4
〈211> 23
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220>
<221> misc一feature
〈222〉 (1)..(23)
〈223〉 引物
〈400〉 4
gaactttact tttccttggg agt 23
〈210〉 5
<211> 25
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc一feature
<222> (1)..(25)〈223> 引物
<400〉 5
atagtgtatt aaccttatgt gtgac 25
〈210〉 6
〈211〉 24
<212〉 歸 <213>人工序列
〈220〉
<221〉 misc_feature
〈222> (1)..(24)
〈223> 引物
〈400〉 6
ttagctgtat cgtcaaggca ctct 2权利要求
1. 一种检测K-ras基因突变的PNA，其特征在于，该PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交。
2. 如权利要求1所述的PNA，其特征在于，该PNA包含SEQ ID N0: 1或其互补序列的至少12个连续碱基。
3. 如权利要求1所述的PNA，其特征在于，该PNA的序列为 Ac-ACGCCACCAGCTC-Lys i ne-C00H 。
4. 一种检测K-ras基因突变的探针，其特征在于，所述探针与野生 型K-ras基因靶序列杂交，该探针序列包含SEQ ID NO: 2或其互补序列 的至少15个连续核苷酸。
5. 如权利要求4所述的探针，其特征在于，所述探针为SEQ ID N0: 2所示寡核苷酸序列。
6. —种检测K-ras基因突变的引物，其特征在于，所述引物用于扩 增K-ras基因靶序列，包括以下引物对(1) 第一引物序列含有SEQ ID NO: 3的至少15个连续核苷酸，第 二引物序列含有SEQ ID NO: 4的至少15个连续核苷酸；(2) 第一引物序列含有SEQ ID NO: 5的至少15个连续核苷酸，第 二引物序列含有SEQ ID NO: 6的至少15个连续核苷酸。
7. 如权利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物对包括SEQ ID NO: 3、 SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 6。
8. —种检测K-ras基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)用权利要求1所述的PNA、权利要求4所述的探针、以及权利要求6所述的引物，对已知突变量的质粒标准品进行实时定量PCR检测，得出标准曲线；(2) 提取核酸样本；(3) 用权利要求1所述的PNA、权利要求4所述的探针、以及权利要 求6所述的引物，以步骤(2)提取的核酸为模板，进行实时定量PCR检测；(4) 根据步骤(1)所得的标准曲线，得出样本核酸的K-ras基因突变
9. 一种检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要 求1所述的PNA、权利要求4所述的探针和权利要求6所述的引物。
全文摘要
本发明公开了检测K-ras基因突变的PNA、探针和引物，以及运用该PNA、探针和引物对K-ras基因突变进行实时定量检测的方法。所述PNA与野生型K-ras基因第一外显子中第12密码子和/或第13密码子进行杂交，该PNA通过与实时定量PCR相结合，可实时定量检测K-ras基因突变量。本发明方法操作简便、敏感性高、特异性高，并可应用于胰腺癌等疾病的早期辅助诊断。
文档编号C12Q1/68GK101423866SQ200710047640
公开日2009年5月6日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者李兆申, 杜奕奇, 寒 林, 军 高, 龚燕芳 申请人:上海长海医院