专利名称：耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种植物基因工程领域的报告基因，具体是一种通过基 因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温P-葡萄糖苷酶基因。 特别是该基因在植物基因转化中作为报告基因的应用。
背景技术：
在转基因中，人们选用标记基因和报告基因，旨在便于转基因材料快速、 便捷的筛选、鉴定。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面需具备以下 几个条件(1)已被克隆和全序列测定；(2)表达产物在受体细胞中不存 在或无相似的内源性表达产物，即无背景；(3)其表达产物能被定量测定。 目前常用的筛选标记基因有抗生素抗性基因，除草剂抗性基因等；报 告基因主要包括(3-葡萄糖苷酸酶基因(g^)、 j3-半乳糖苷酶基因(丄flcZ)、 荧光素酶基因(Xw)、绿色荧光蛋白基因(她)和冠癭碱合成酶基因等。研 究显示gw报告基因具有相对较高的检测灵敏度，而且方法简便、快速和稳 定。G^S基因编码p-D-葡萄糖苷酶((3-Glucuronidase)，该酶催化底物形成 [3-D-葡萄糖苷酸，(3-D-葡萄糖苷酸酶可使底物5-溴-4-氯-3-n引哚-(3-葡萄糖苷 (X-Gluc)转化成稳定的蓝色产物，因此可以通过组织化学染色来检测转基 因细胞、组织或生命体，检测技术十分简便。但是底物5-溴-4-氯-3-喷哚-(3-葡萄糖苷(X-Gluc)十分昂贵，消耗量大，检测成本偏高；而且还存在本底 较为严重，存在一定程度的假阳性等局限。基因代之相对廉价的底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-卩-半乳糖苷(X-Gd)，使大规模转化体筛选成为可能。/"cZ 作为报告基因存在很大的缺陷， 一是许多生物存在内源P-半乳糖苷酶活性， 容易引起假阳性；此外目前常用的大肠杆菌/^Z基因较长(3kb)，且在其 它生物中的表达量较低，影响了其检测的灵敏度。荧光素酶是一种可将化学 能转变为光能的高效生物催化剂，它在Mg^离子的存在下催化D-荧光素产 生氧化脱羧反应，产生氧化荧光素，发出可见光。该酶由于其检测灵敏度相
3对较高，在转基因研究中得到了一定程度的应用。但荧光素酶在生物体内稳 定性差，半衰期短，从而影响了检测结果的准确性；此外荧光素酶的检测依 赖昂贵的荧光检测仪且操作较复杂。她标记基因在转基因中应用的最大优 点是可以进行活体检测而不损坏被检物，如发现绿色荧光，被检物可继续进
行培养，克服了 GUS法损坏被检物的缺陷，虽然她标记基因的应用日趋
广泛，但gfp的检测依赖特殊设备(荧光显微镜)，限制了其推广。 体外定向分子进化是发现和改造生物活性分子的重要方法，提供了一种
高效获得多样性的方法。DNA改组是重要的体外分子进化技术，结合高通 量筛选能够改造许多重要的医药、工业、环境保护等商业酶。近年来，许多 体外分子进化的新策略和新方法层出不穷。推理设计是基于基因和蛋白质信 息进行基因和蛋白质序列的改造，作为基因和蛋白质体外快速改造有其重要 的一面。DNA改组技术的发展和成熟是在上世纪九十年代末期。特别是进 入21世纪以来，体外分子进化技术在新技术和新理论的推动下，又得到了 长足的发展，并在农业、环境污染治理、化学工业、基因治疗、疫苗、蛋白 药物等方面有着广泛的应用。大肠杆菌的(3-葡萄糖苷酸酶基因，是一个使用 广泛的报告基因。由于其具有检测灵敏，酶性质稳定，完善的酶学分析方法 和可见的表型等特点，已经成为研究体外分子进化技术的一个好的模式。由 于报告基因具有容易检测等特点，因此已经在改组方面取得了较大的进展。 1996年，经过3轮的改组和筛选，获得了荧光强度提高40倍的绿色荧光蛋 白(GFP) ; Nam等在2003年通过突变和筛选进一步获得活性提高的GFP 突变体。Fradkov等在2000年通过改组获得了两个GFP类似蛋白质(dsFP593 和drfp583 )，突变体使得荧光向长波长区域移动，其最大的波长区域在 616nm。大肠杆菌来源的(3-半乳糖苷酶也通过改组和位点饱和突变获得了 P-岩藻糖苷酶(f3-fucosidase)活性提高的突变体。大肠杆菌的P-葡萄糖苷酸 酶是一个非常理想的体外定向分子进化体系研究的模式个体。Matsumura等 在1999年就获得了比野生型GUS对戊二醛(Glutaraldehyde)和甲醛 (Formaldehyde)更有耐受性的突变个体。经过四轮的突变，Flores和 Ellington在2002年也获得了耐热性能提高的GUS突变个体，突变个体能够 耐受70。C的温度，而野生型在65。C就完全丧失活性了。使用DNA改组技 术，获得了 (3-半乳糖苷酶增强的卩-葡萄糖苷酸酶突变体。Geddie和Matsumura在2004年还获得了 p-nitrophenyl曙(3-d-Xylopyranoside(pNP-xyl)
活性增强的GUS突变个体。
卩-葡萄糖苷酸酶基因(，W)是最重要和最常用的植物转基因用报告基 因，在美国2001年和2002年统计的田间种植情况中使用比例最高。GUS 染色的程序具有简单、高效、保真度好和成本相对低廉的特点。而且使用大 肠杆菌的GUS的遗传转化植物及其产品通常认为对环境和消费者是安全 的。但是GUS活性广泛的存在于微生物(Microorganisms)、脊椎动物 (Vertebrates)和无脊椎动物(Invertebrates)中，而且在许多的植物中发现 有一些本底的GUS活性，包括假阳性和内源性GUS类似蛋白质等。因此转 基因生物中Gt^报告基因的检测常受目标生物体内源GUS活性的干扰，这 限制了 G^S报告基因的应用范围，降低了 GUS作为报告基因的可靠性；此 外，由于X-Gluc十分昂贵，这也造成GOS报告基因的应用受到一定程度的 限制。而且由于果实、种皮、胚乳及胚中存在明显的内源GUS活性，这使 组织特异调控的研究结果出现偏差；在转基因植物检测过程中，常选择营养 体进行染色，但也难免内源GUS背景，故日常染色过程中，常在染色液中 加入高浓度甲醇的方式来抑制营养阶段组织中的内源GUS活性，即便如此 也较大程度上降低了 GUS检测的灵敏度。微生物中内源GUS活性更加普遍， 使得GC/S基因很难在转基因微生物中应用。目前，转基因植物的商业化往 往需要获得大量的转基因独立转化株，需要进行大规模的组织化学染色；此 外，特殊的组织特异调控研究需对整个转基因植株进行染色，此时染色底物 X-Gluc的高成本显得更加突出。
耐高温的报告基因可免除转基因生物体中内源背景的干扰，增加转基因 检测的可靠性，我们对80余种植物材料进行X-Gluc染色，结果显示80°C 加热5分钟可完全消除植物内源GUS活性；使用耐高温(3-葡萄糖苷酸酶将 明显提高转基因检测的灵敏度，使时空特异、生物或非生物环境诱导的表达 调控研究结果差异更大、数据更准确，并且将大大降低底物的用量，降低检 测成本。
发明内容
发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温P-葡萄糖苷酶基因作为植物遗传转 化中的报告基因。耐高温的报告基因使用将大大拓展3-葡萄糖苷酶基因作 为报告基因的应用范围。
发明通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温P-葡 萄糖苷酶基因作为植物遗传转化中的报告基因。将该耐高温P-葡萄糖苷酶 基因构建入植物表达载体并进行了植物遗传转化。在转基因植株中通过高温 处理植物转化材料，X-Gluc染色。 本发明是这样实施的
1. 耐高温(3-葡萄糖苷酸酶GUS-TR3337的获得
在高通量(3-葡萄糖苷酸酶基因的体外分子进化体系基础上获得了一个 较野生型显著耐受高温的突变体GUS-TR。获得的步骤简要如下首先以 大肠杆菌的卩-葡萄糖苷酸酶为模板进行基因改组突变，再将突变体在大肠杆 菌中进行高温性能的筛选，结果是野生的大肠杆菌的P-葡萄糖苷酸酶不能够 耐受70度的温度处理30分钟，而该突变体的大肠杆菌转化子在硝酸纤维素膜 上能够耐受10(TC的高温达30分钟，而对照不能耐受7(TC的高温(具体获得 过程参照发明专利耐高温P-葡萄糖苷酸酶基因及其获得方法ZL ZL 00 1 19633.2) 。 g^A基因序列测定分析共有15个核苷酸位点发生改变，分别是 导致了12个氨基酸位点发生突变，分别是I149T, N181S， D436E, V446A， A451V， Q493R， T509A, M532T, N550S, G559S, N566S和M5911。进一歩使用 定点突变结合耐高温性状分析，获得了含有六个关键突变位点(Q493R, T509A, M532T, N550S, G559S和N566S)的突变个体GUS-TR3337。
2. 含有耐高温(3-葡萄糖苷酸酶基因g^告3J37植物转化农杆菌转化双元 载体YG8557的构建
耐高温GUS基因g船-7和大肠杆菌野生型GUS基因wf的农杆菌 转化双元载体pYG8557和pYG8555是在双元载体pYF7716基础上构建而成 的。上海市农业科学院生物技术研究构建的双元载体pYF7716是在载体 pCAMBIA-1304基础上构建完成。双元载体pYF7716具有的特点有用双 CAMV 35S启动子和Nos-ter终止子控制目标基因的表达，CAMV 35S+TMV Omega leader sequence和CAMV 35S PolyA控制内含子《w抗性基因的表达， 作为转基因植物的筛选标记基因。构建耐高温GUS基因gM-^ 337和大肠杆菌GUS基因g^-vi^的农杆菌转化双元载体pYG8557和pYG8555时，在/Z/"d III 和B^EII双酶切位点间替换插入一段430bp的v/^基因，用以去除载体上带内 含子的gw基因单元。
从含gws々3W7的表达载体(pYPX251-gus-tr3337)的质粒经Sa附HI 和Sac I双酶切后，DNA回收试剂盒回收1800bp左右的g船-^5W7基因片 段。将此片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元 载体pYG8557。同样从含gws-W的表达载体(pYPX251-g船-的质粒经 5aw HI和Sac I双酶切后，DNA回收试剂盒回收1800bp左右的gws-基因 片段。将此片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双 元载体pYG8555 (图1)。
3. 植物遗传转化
通过农杆菌蘸花法(具体参考文献Zhang X, Henriques R, Lin SS， et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nat Protoc, 2006, 1: 641-646.)对含有构建的gM-"3337质粒 pYG8557和含有对照gw-wf质粒pYG8555的农杆菌进行拟南芥转化。将获得 的当代种子于含有卡那霉素的1/2MS培养基中筛选，获得独立抗性植株。将 抗性植株种植中由蛭石、黑土、珍珠岩按9: 3: 0.5的比例拌匀的基质中，在幼苗 生长过程中，进行GUS检测，获得GUS染色呈现蓝色的阳性植株，获得了转 基因YG8557和YG8555拟南芥植株。
4. 含有耐高温p-葡萄糖苷酸酶基因转基因拟南芥高温处理后染色 将获得了转基因YG8557和YG8555拟南芥植株(耐高温GUS基因
g船々3W7和对照基因w/)进行高温处理后X-Gluc染色的实验(参照文 献Jefferson, RA, Kavanaugh TA Bevan MW. GUS fusions: P-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker for higher plants. EMBO J， 1987, 6: 3卯1-3907)。在同一个转基因植株上取下一片叶片进行分割成9块，分别放 置于PTC-200型PCR仪上进行不同温度和时间的处理，高温处理完成后， 室温冷却后加入X-Gluc染色液(X-Gluc购买于美国Clontech公司)，进行 染色过夜，采用75%乙醇脱色后拍照(参照文献Jefferson, RA, Kavanaugh TA Bevan MW. GUS fusions: (3-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker for higher plants. EMBO J, 1987, 6: 3卯1-3907)。5.耐高温卩-葡萄糖苷酸酶基因应用于多种转基因植物研究
耐高温|3-葡萄糖苷酸酶基因可以作为报告基因还可应用于拟南芥、水
稻、烟草、番茄、油菜、青菜、玉米、苹果、甘蓝或麦类植物及酵母和大肠
杆菌等微生物多种物种的转基因研究中。
本发明的有益效果
本发明公开的一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得 的耐高温l3-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中作为报告基因的应用，可免 除转基因生物体中内源背景的干扰，增加转基因检测的可靠性，使用耐高温 卩-葡萄糖苷酸酶还将明显提高转基因检测的灵敏度，使时空特异、生物或非 生物环境诱导的表达调控研究结果差异更大、数据更准确，并且将大大降低 底物的用量，降低检测成本。
图lgM-^5J37和g^-H^基因的植物表达载体构建示意图2琼脂糖凝胶电泳检测含耐高温g^-^3W7基因的表达载体；
图3琼脂糖凝胶电泳检测含对照g^-W基因的表达载体；
图4经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子；
图5转gz^U3J7和gw-wf基因的拟南芥To植株在卡那霉素平板上的 筛选；
图6转gw5U33 7和g^-w基因的拟南芥TO Km抗性植株部分出现白 化苗；
图7To植株上收获的L种子；
图8转gw々"37和g船-w基因的拟南芥T,植株GUS染色鉴定； 图9转基因拟南芥YG8555中野生型GUS的耐高温性能； 图IO转基因拟南芥YG8557中耐高温GUS的耐高温性能(株系-l); 图11转基因拟南芥YG8557中耐高温GUS的耐高温性能(株系-2)。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一歩阐述，但不限制本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括
81. 植物材料
野生型拟南芥"ra^W印s" Aa"a腦)生态型Co/ww6/a种子由上海市 农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。
2. 细菌菌株和质粒
大肠杆菌DH5a、农杆菌菌株AG211及pBluescriptII SK等质粒由上海 市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存；带有耐高温改组突 变的基因的植物双元载体pYG8557和和带有野生型gw基因的 植物双元载体pYG8555由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程 研究室构建。
3. 化学试剂和酶制剂
Silwet L-77购自Sigma公司(St Louis, MO, USA);大肠杆菌DH5a 由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体 pMD18-T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、 lOxPCR buffer 和 DNA marker 购自宝生物工程大连有限公司。X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-卩-D-glucuronic acid) 禾口载体 pBI121 (含有' g^-W基因)购买于美国Clontech公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化 学公司和上海国药化学试剂购买。
4. 培养基
农杆菌转化渗透液为5%的蔗糖和0.05%的Silwet L-77。大肠杆菌生 长和转化的2YT， SOB-Mg等培养基和农杆菌生长和转化的LB、 YEB培养 基见《分子克隆实验指南》。
下述实施例中常规的基因操作方法参照分子克隆文献Sambrook J, Frets E F， Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
实施例1:农杆菌转化双元载体pYG8557和pYG8555的构建 (一)试验方法
耐高温GUS基因gws々3337和大肠杆菌野生型GUS基因g^-W的农杆 菌转化双元载体pYG8557和pYG8555是在双元载体pYF7716基础上构建而 成的。上海市农业科学院生物技术研究构建的双元载体pYF7716是在载体 pCAMBIA-1304基础上构建完成。双元载体pYF7716具有的特点有用双CAMV 35S启动子和Nos-ter终止子控制目标基因的表达，CAMV 35S+TMV Omega leader sequence和CAMV 35S PolyA控制内含子Kw抗性基因的表达， 作为转基因植物的筛选标记基因。构建耐高温GUS基因g^UJ37和大肠 杆菌GUS基因gM-W的农杆菌转化双元载体pYG8557和pYG8555时，在 历"d III和SWEII双酶切位点间替换插入一段430bp的Wz6基因，用以去除 载体上带内含子的gw基因单元。 1
从含gwsU337的表达载体(pYPX251-gus-tr3337)的质粒经Saw HI 和5V c I双酶切后，DNA回收试剂盒回收1800bp左右的gwU_537基因片 段。将此片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双元 载体pYG8557。同样从含w"-W的表达载体(pYPX251_gw-wO的质粒经 5aw HI和Sac I双酶切后，DNA回收试剂盒回收1800bp左右的gw-W基因 片段。将此片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定和测序后得到正确的双 元载体pYG8555 (图1)。 (二)试验结果
采用琼脂糖凝胶电泳检测构建好的含耐高温基因的表达载 体(pYPX251-gus-tr3337)，显示酶切条带正确，为lOkb左右的载体和1.8kb 的耐高温g船々"37基因(图2);
采用琼脂糖凝胶电泳检测构建好的含对照gws-w基因的表达载体 (pYPX251-gus-wt)，显示酶切条带正确，为10kb左右的载体和L8kb的 对照g^-w/基因(图3)。
实施例2:电击法转化农杆菌
(一) 试验方法
1) 制备农杆菌AG211感受态，方法参照MicroPulserTMElectroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD公司)。
2) 取50fiL AG211感受态细胞，加入lpL DNA (质粒pYG8555和 pYG8557)，转入0.2cm电击杯转化(400Q， 2.5KV, 25|if)。加入lml含 有lX甘露醇的LB培养基恢复培养2h(28t:， 250转/分钟)。分别取10pL、 lOOpL涂LB平板(利福平50吗/ml，庆大霉素50吗/ml，氯霉素100jig/ml)。
(二) 试验结果
经过2天培养，在LB平板上长出农杆菌单克隆。实施例3:拟南芥转化
(一) 试验方法
1. 农杆菌的准备
1) 挑取农杆菌单菌接种于5mlLB液体培养基(利福平50吗/ml，氯霉 素100吗/m11)中，28°C， 250转/分钟培养20h。
2) 取lml菌液转接入20-30ml LB液体培养基(利福平50pg/ml 1，氯 霉素100(ig/ml)中，28°C， 250转/分钟培养约12h，测OD600-1.5。
3) 8000转/分钟，4°C， 10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透 液(5%蔗糖，0.05% SilwetL-77)并稀释至OD600-0.8。
2. 拟南芥蘸花法转化
1) 将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约10s后取出，全部转化 完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置 22。C避光培养，24h去掉保鲜膜直立培养。
2) 初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次， 这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。
3) 生长约两个月后，收集种子，4"C冰箱贮存待用。
(二) 试验结果
经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子(图4) 实施例4:拟南芥种子的筛选
(一)试验方法
1) 称25 — 30mg种子放入1.5ml离心管。
2) lml75X乙醇消毒lmin(不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。
3) 加入lml过滤后的漂白粉(5%)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消 毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。
4) 无菌水洗涤3—4次。
5) 将种子均匀的播撒到1/2MS平板(Km50昭/ml)上，Parafilm膜封 口， 4。C冰箱放置两天，22°C， 16h光照培养6天。
6) 将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出 阳性植株(TQ)培养至开花结实，收集T。植株上所结T,种子。(二)试验结果
将获得的T。代种子于含有卡那霉素的1/2MS培养基中筛选，分别获得 独立抗性植株(图5)。
将抗性植株种植中由蛭石、黑土、珍珠岩按9: 3: 0.5的比例拌匀的基质中， 发现有部分的在培养皿中筛选的抗性植株出现白化现象，分析原因可能是卡 那霉素对植株的毒害有一个积累过程，在幼苗的生长过程中显现出来(图6)。
收集To植株上所结T,种子(图7)。
实施例5:拟南芥转基因Km抗性阳性植株的GUS染色
(一) 试验方法
参照Jefferson的方法，将待测拟南芥样品与X-Gluc染色反应液(50mM NaH2P04， pH7.0; 0.5mM K4[Fe(CN)6]， 0.1% Triton X-IOO， 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc)于设定温度下保温过夜后，用75%乙醇脱色观察。
(二) 试验结果
在幼苗生长过程中，进行GUS检测，发现所筛出的卡那霉素抗性植株 中并不都是GUS阳性植株。从抗性植株通过GUS检测后分别获得GUS染 色阳性植株4株(图8)。
实施例6:改组定向进化的耐高温GUS基因在拟南芥中的功能分析 (一)试验方法
为了分析耐高温改组GUS基因g^U337在植物中的耐高温表型。将 获得了转基因YG8557拟南芥植株(耐高温GUS基因g船々3W7)和YG8555 拟南芥植株(野生型GUS基因gw-wf)进行了高温处理后X-Gluc染色的实 验。
1) 在同一个转基因植株上取下一片叶片进行分割成9块；
2) 分别放置于500ul的dorf管中；
3) 加入60ul的无菌重蒸水，将小块叶片浸入无菌重蒸水中；
4) 将含有叶片的dorf管放置于PTC-200型PCR仪上进行不同温度 (60°C， 70°C， 80°C， 80°C，)和时间(5分钟 30分钟)的处理，为了防
止水分蒸发，使用PCR仪的盖加热功能；
5) 高温处理完成后，室温冷却后吸除dorf管中的水；6) 加入15ul的X-Gluc染色液；
7) 放置于55'C和37"C培养箱中进行染色过夜；
8) 采用75%乙醇脱色后拍照。
(二)试验结果
结果发现，YG8555 (野生型GUS基因g^-W)转基因拟南芥未经高温 处理显色良好，呈现蓝色。而经过6(TC处理5分钟时略微显蓝色，且非常 微弱，随着处理温度的升高和处理时间的延长，转基因植株均不能显蓝色， 说明其中的野生型(3-葡萄糖苷酸酶(GUS-WT)已经失活(图9)。
而转基因拟南芥植株YG8557 (耐高温改组GUS基因g^-W"7)未经 高温处理显色良好，呈现蓝色。经过6(TC处理20分钟、30分钟；7(TC处理 IO分钟、20分钟、30分钟；8(TC处理10分钟、20分钟均很好地显蓝色。 甚至8(TC处理30分钟仍能够较明显地显示蓝色，说明经过体外定向分子进 化技术改组突变的耐高温(3-葡萄糖苷酸酶(GUS-TR3337)在植物中依然能 够保持耐高温性能(图IO和11)。
耐高温P-葡萄糖苷酸酶基因可以作为报告基因应用于拟南芥、水稻、烟 草、番茄、油菜、青菜、玉米、苹果、甘蓝或麦类植物及酵母和大肠杆菌等 微生物多种物种的转基因研究中，试验结果显示可以作为报告基因使用。
权利要求
1. 一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合具有耐高温β-葡萄糖苷酶基因的用途，将该耐高温β-葡萄糖苷酶基因构建入植物表达载体，再进行植物遗传转化中应用。
2. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于该耐高温P-葡萄糖苷酶基因在 植物遗传转化中作为报告基因应用。
3. 根据权利要求1所述的用途，其特征在于该基因作为报告基因应用于拟 南芥、水稻、烟草、番茄、油菜、青菜、玉米、苹果、甘蓝或麦类植物 及酵母和大肠杆菌等微生物中。
全文摘要
本发明涉及一种通过基因体外定向分子进化和定点突变相结合获得的耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物基因转化中作为报告基因的应用，属于植物基因工程领域。本发明公开了该耐高温β-葡萄糖苷酶基因在植物遗传转化中使用方法和效果。耐高温的β-葡萄糖苷酶基因可免除转基因生物体中内源背景的干扰，增加转基因检测的可靠性，使用耐高温β-葡萄糖苷酸酶还将明显提高转基因检测的灵敏度，使时空特异、生物或非生物环境诱导的表达调控研究结果差异更大、数据更准确，并且将大大降低底物的用量，降低检测成本。
文档编号C12N15/56GK101418306SQ200710047380
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月24日 优先权日2007年10月24日
发明者付晓燕, 姚泉洪, 彭日荷, 贤 李, 熊爱生, 田永生, 永 薛, 伟 赵, 峰 高 申请人:上海市农业科学院