专利名称：：一种由Vibriosp.JG07-007制备的褐藻胶裂解酶的制作方法
技术领域：
：生物技术
背景技术：
：褐藻胶是褐藻细胞壁和细胞间质的主要组成部分，也是褐藻中含量较高的一种多糖，其分子是由P^D-l,4-甘露糖醛酸(>D-mannuronicacid,简称M)和a-L-l，4-古罗糖醛酸(a-L-guluronicacid，简称G)两种单体组成的嵌段式线性聚合物，其分子中存在三种嵌段均聚甘露糖醛酸(MV均聚古罗糖醛酸(G、和M、G两种单体交替(MG、的嵌段。褐藻胶裂解酶的酶解反应都是在底物的非还原末端生成4"deoxy"erthro4iex-4"enopyranuronosyl基的p消除反应。1992年，Gaseca报道了关于褐藻胶裂解酶的裂解机制，褐藻胶分子中的羧基与酶分子中的阳离子性氨基酸残基结合，C5位的C-H电子对被6位的羧基吸弓|，5位的C-H结合变弱，然后又一个酶分子中的亲核性氨基酸残基与C5位的质子结合，电子向着生成稳定的中间体的方向运动，最终在C4《5间生成双键，所以褐藻胶酶解的产物分子中的非还原末端产生C4，5不饱和双键，在23(K240nm有强吸收。据本发明人通过査阅资料、文献检索所知，迄今为止报道的褐藻胶裂解酶大多是由海洋生物如褐藻、海洋软体动物、革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、病毒分离纯化而来的，陆上生物分离得到的褐藻胶裂解酶全部是来源于细菌。黄杆菌(尸/ovo6flc"te/7'amOTM/ftW鹏)；(J/gj'Hov访rfo叫uoft7is);固氮菌(4zo6acterW恥/aKft-);克里伯氏菌(A/eto'e〃aaeragewe),(X/efoiW/apwe柳o/H'。e);肠杆菌(五wtero6ac欣c/oacaeM-l);别单胞菌C4/tero柳nassp.);芽胞杆菌(5a"7/Msdrc"/fls);(Jgar6actert柳a/g/m'cum)。专利公开了一种Vibriasp.QY101产生的其特征为酶的分子量为39kD的褐藻胶裂解酶。Vibriasp.QY2产生的其特征为酶的分子量为28.5Kd。Vibriasp.QYl产生的其特征为酶的分子量为39kD。
发明内容本发明的目的是提供一种来源于海藻的菌株W6rfo艰JG07-007并利用该菌株制备的褐藻胶裂解酶以及相关的酶学性质。本发明分离纯化出一株来源于海藻的菌株WArio艰JG07"007，其具有产生褐藻胶裂解酶的特性，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCCNO:M207068。本发明的特点是首次分离出产褐藻胶裂解酶W6rfosp.JG07-007菌株。该菌株为不产孢子的弯杆状，革兰氏阴性。不抗酸，没有荚膜，在标准肉汤上生长良好，氧化酶阳性，无色素和黄色，脲酶阳性。0.4"0.7um><1.3-1.5iim,端生单鞭毛。该菌株来源于海藻体表环境，为发酵型糖代谢，3%和7%NaCl胨水中生长良好，且对CM29敏感试验呈阳性等特征，经过boilog鉴定确定其为弧菌属,但是未能给出具体种，暂命名取JG07-007。为此菌株在2216E培养基上26'C培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。该菌株具有會养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。在发酵培养基中培养18h,其发酵液中褐藻胶裂解酶的活力达到最高(32C下测定)。用本发明的菌株作为褐藻胶裂解酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，SDS-PAGE确定该菌株产生的碱性蛋白酶的分子量为34.6kDa(图1)。其分子量不同于己报导的褐藻胶裂解酶(表l)。通过硫酸铵分级沉淀，DEAE—Sepharose阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤技术对柳rfo乎JG07-007菌株产生的褐藻胶裂解酶进行纯化和精制，获得电泳纯度的酶蛋白组分，将纯化出的酶蛋白经过Edman法降解后迸行蛋白质N末端测序，结果如图2，此酶的N端氨基酸序列为AEILATDDAD。此蛋白的N端不同于任何已报道的褐藻胶裂解酶的N端，将此酶与其它的褐藻胶裂解酶的N端进行比较可知此蛋白的N端氨基酸序列不同于任何己报道的褐藻胶裂解酶的N端序列(表2),判定其为一个新酶。图l，纯化的碱性蛋白酶SDS-PAGE电泳结果。左边为纯酶单带，右边为标准蛋白分子量。图2,附WoW.JG07-007产生的褐藻胶裂解酶N末端测序结果图谱。具体实施例方式1.制备酶将W6Wo^.JG07"007菌株用液体2216E培养基活化后，以5%的接种量接入到装有IOOmL发酵培养基(含有0.2%褐藻酸钠的2216￡培养基去除琼胶)的250mL三角瓶中，26匸摇瓶培养20h,培养液4'C下3000rpm将酶发酵液冷冻离心3500r/min、5min，上清液加入硫酸铵使饱和度达到30%，析出的杂蛋白质经高速离心(7，000xg,4°C)去掉，上清液继续加入硫酸铵使饱和度达到80%,析出的蛋白质经高速离心(7，000xg，4°C)回收，作为粗酶用于进一步纯化。2、纯化酶将粗酶液分散，以含有0.05MTris-HCl缓冲液(pH7.5)进行透析，每隔4h更换一次透析外液，用BaCl2检査透析外液是否含有硫酸根，直至无硫酸根检出。将透析好的酶液加样于AKTAexplorechromatography的HitrapDEAE-SepharoseFF柱，洗脱液为含有不同浓度的NaCl(0，0.3,0.6，0.9M)的0.05MTris-HCl(pH7.5)缓冲液进行分步洗脱，在280iirn下检测蛋白峰，DNS法测酶活，收集有活性的蛋白，进行下一步纯化。将DEAE-SepharoseFF部分纯化后的活性蛋白加样于Superdex75柱，洗脱液为含有0.2MNaCl的0.05MTris-HCl(pH7.5)缓冲液，在280mn下检测蛋台峰，DNS法测酶活后收集有活性的蛋白，进行下一步纯化。在280nm下检测蛋白峰，DNS法测酶活后收集有活性的蛋白。3、酶分子量測定用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)技术确定褐藻胶裂解酶的分子。具体方法是将样品加入2倍浓度的SampleBuffer中，在沸水浴中加热5min变性，取出冷却后进行电泳。固定后，用考马斯亮蓝R250进行染色。标准蛋白是Myosin:205kD4肌球蛋白；b"Galaktosidase:116kDa^-半乳糖苷酶；PhosphorylaseB:97，4kD4磷酸化酶B;Rinderserumalbumin(BSA):66kDa^牛血清白蛋白；Ovalbumin:45kD4卵清蛋白；Carbonhydrase:29kDa碳酸酐酶。电泳后，测定各样品从开始电泳的位置起移动的距离，将它们相对全长的比例和各标准蛋白质分子量的对数以最小二乘法做曲线，计算此酶的分子量此酶在SDS-PAGE上显示的分子量为34.6kDa(见图1)。4、酶蛋白的N端測序依据Edman降解法原理，即蛋白质的自由ct一氨基与PITC(异硫氰酸苯酯)偶联后，与之相邻的第二残基的肽键大为消弱，在无水酸TFA(三氟乙酸)的作用下发生特异性的断裂，暴露出第二残基的a—氨基，再与PITC反应，循环往复地进行偶联降解地反应。循环次数受Edman反应产率的限制。按照常规条件进行SDS-PAGE，将电泳完毕的凝胶按照海绵，滤纸，PVDF膜，凝胶，滤纸，海绵的次序将电印迹夹层装好，并放入小型电转槽中，在50V(100-170mA)于室温下进行电印迹转移，转移时间为2小时。取出PVDF膜并用去离子水略为漂洗，用甲醇浸泡数秒钟，用丽春红(PonceauS)染色。蛋白质N末端测序是采用Edman降解法，N端前10位氨基酸残基的序列由AppliedBiosystems公司的PROCISE蛋白质测序仪测定，此酶的N端氨基酸序列为Ala-Glu-Ie-Leu-Ala-Thr-Asp^As，Ala-Asp(丙氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸)简写为:AEILATDDAD。结果见图2。表l不同文献报道的褐藻胶裂合酶分子量范围来源分子量参考文献(kDa)柳,to取JG07-00734.6110Stevens&Levin^1977.32Sawabeetal.，1992.Haloninas39Kraiwattanapongetal"1999b.Mari加bacteriumA丁CC433367(AlgA)29Brownetal.，1991.MarinebacteriumATCC43336738Brownetal"1991.sp.(ATCC433367)30Malissardetal.,1995.尸5^wrfo/noworf(marine)50Davidsonetal"1976.尸5:eMJ0/w0wassp,(marine)94Muramatsu&Sogi，1990.32尸sew6towowosa/g/wnwa(strainX017)28Boyenetal"1990a;Chavagnatet24al"1996.附打osp.(marinebacterium)4042Takeshitaetal.，1993，1995.,o啦ATCC1774947Kitamikadoetal.，1990，1992;Tsengetal.,1992bc.57Kitamikadoetal.，1990，1992;Tsengetal"1992a.MarinebacteriumA3100Doubet&Q咖tr加o,1982,1984.Marinebacterium35Doubet&Q咖trano，1982，1984.表2不同来源褐,裂合酶N端序列<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一株弧菌Vibriosp.JG07-007，其保藏号为CCTCCM207068。2、一种使用权利要求1所述的菌株制备的褐藻胶裂和酶。3、如权利要求2所述的褐藻胶裂和酶，其特征是该酶的分子量为34.6kD。4、如权利要求2所述的褐藻胶裂和酶，其特征是该此酶的N端氨基酸序列为-丙氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-丙氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(Ala>Glu-Ile-Leu-Ala-Thr-Asp-Asp-Ala-Asp)。全文摘要本发明的目的是提供一种来源于海藻的菌株VibriospJG07-007并利用该菌株制备的褐藻胶裂解酶以及相关的酶学性质。该菌种具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。在发酵培养基中培养18h，其发酵液中碱性蛋白酶的活力即达到960U/mL(30℃下测定)。SDS-PAGE确定该菌株产生的碱性蛋白酶的分子量为34.6kDa(图1)。通过硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤技术对Vibriosp.JG07-007菌株产生的褐藻胶裂合酶进行纯化和精制，获得电泳纯度的酶蛋白组分，将纯化出的酶蛋白经过Edman法降解后进行蛋白质N末端测序，此酶的N端氨基酸序列为AEILATDDAD。文档编号C12N9/00GK101319197SQ20071011232公开日2008年12月10日申请日期2007年6月5日优先权日2007年6月5日发明者江晓路申请人:中国海洋大学