专利名称：Knsl4的转移相关基因功能和预测乳腺癌患者预后的标志物用途及其应用方法
技术领域：
本项目属于已知基因的新功能、新用途和应用方法的发明。具体讲是发现了已知基因KNSL4的转移相关基因功能，并可作为乳腺癌患者预后预测的基因标志；发明了基于KNSL4基因mRNA表达量预测乳腺癌患者预后的方法。
背景技术：
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，在欧美国家发病率高达10％，而低发的亚洲国家近年来发病人数和死亡人数呈显著的上升趋势，我国大城市中乳腺癌发病率已居女性恶性肿瘤的首位，成为妇女健康的重大威胁。乳腺癌是全身性疾病，肿瘤细胞的淋巴道和血道播散导致的全身转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的关键所在。乳腺癌转移相关基因的发现将为转移机制的研究提供线索，为转移的早期诊断提供分子标志，为患者的预后评估提供客观指征，为抗转移治疗提供基因靶点。
目前，关于驱动蛋白样DNA结合蛋白基因(kinesin-like DNA bindingprotein，KNSL4，kinesin-like 4，KIF22，Accession No.NM_007317)及其蛋白产物Kid的研究报道都是关于分子结构和基于分子结构的生物学功能的研究，已知该基因编码的Kid蛋白与微管结合驱动染色体的运动，在细胞有丝分裂中起关键作用。但KNSL4基因的改变对于细胞生物学行为的影响、与组织病理学改变的关系、基因表达量检测方法和应用的研究还是空白。
发明内容
为了筛选乳腺癌转移相关基因，采用Differential display RT-PCR(DDRT-PCR)方法，通过比较淋巴结转移阳性乳腺癌患者的原发癌和配对的淋巴结转移癌组织基因表达的差异和实时定量RT-PCR方法验证，发现了KNSL4的转移相关基因的新功能。
建立了定量RT-PCR检测KNSL4 mRNA表达量的方法；经大样本量的临床病例检测，发现KNSL4 mRNA水平与乳腺癌的多种临床病理因素及转移预后相关，与患者无转移生存期呈负相关(P＜0.05)，因此，KNSL4mRNA可作为乳腺癌患者预后预测的分子标志物；确定了基于KNSL4mRNA表达量可以区分预后好和预后差的患者群的临界值，高于临界值的患者判断判断为预后好，低于临界值的患者为预后差。
主要发明如下
驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的转移相关基因功能。
KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的标志物用途，基于KNSL4基因表达水平可以预测乳腺癌患者的预后，KNSL4表达水平高的患者预后好，表达水平低的患者预后差。
基于KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的检测及应用方法，a.提取肿瘤患者原发癌组织标本的细胞总RNA；以RNA为模板逆转录合成cDNA；以cDNA为模板，用KNSL4基因和管家基因的特异性引物和荧光标记探针进行实时定量PCR扩增，计算KNSL4基因mRNA的相对表达量为2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT为实时定量PCR时荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数)；b.根据乳腺癌患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KNSL4 mRNA表达量，确定预后判断的临界值。KNSL4 mRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。
所述的检测方法，以原发癌组织中KNSL4 mRNA表达量为1.40×10-3作为对肿瘤患者预后判断的临界值，高于该临界值的患者则判断为预后好，低于该临界值则判断为预后差。
所述的检测方法，KNSL4基因实时定量RT-PCR的引物和探针序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特异性荧光标记探针序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
所述的检测方法，其荧光报告基团还可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等荧光染料。
附图是KNSL4 mRNA表达与患者生存期分析图。
具体实施例方式
一、病例资料及标本取材1.病例资料108例乳腺原发癌组织均为2002年1月至2003年10月天津医科大学附属肿瘤医院乳腺科收治的乳腺癌患者手术切除标本，组织学分型及临床分期根据《中国常见恶性肿瘤诊治规范》第八分册(乳腺癌)。年龄为29-73岁，中位年龄51岁；浸润性非特殊型癌101例(单纯癌60例、浸润性导管癌24例、髓样癌12例、腺癌5例)和浸润性特殊型癌7例(乳头状癌3例、粘液癌癌2例、大汗腺癌2例)；临床分期I期16例，II期63，III期25例，IV期4例；组织学分级I级12例、II级73例、III级23例；淋巴结转移阴性52例，阳性56例；ER、PR采用免疫组化检测，阳性细胞数达30％以上为阳性，ER阴性36例，阳性68例，PR阴性55例，阳性病例49例，4例ER、PR免疫组化资料缺失；双乳癌3例；平均随访43个月，11例有远处转移，45例无远处转移，62例无随访结果。
2.标本取材组织标本取材分为两部分，用于mRNA表达检测的新鲜标本经液氮速冻后保存于-80℃冰箱，用于组织病理学诊断和免疫组织化学检测的标本经福尔马林固定和石蜡包埋，制备4μm组织切片。
二、Real-time RT-PCR方法检测KNSL4的mRNA表达1.细胞总RNA的提取采用Trizol一步法快速提取组织细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。
2.cDNA的合成20μl SuperScript II(invitrogen公司)反应体系。其中包括5μg totalRNA，0.5μg Oligo(dT)，10nmol dNTP mix，65℃变性5分钟，冰浴后加入First-Strand Buffer，0.2μmol DTT和40U RNA酶抑制剂，42℃温育2分钟后加入SuperScriptII 200U，42℃反应50分钟。反应完成后70℃，15分钟终止反应。
3.实时定量PCR检测KNSL4的mRNA表达KNSL4引物采用oligo6.0和primer5.0引物设计软件设计并进行最大优化，GAPDH引物参考文献。引物和探针序列及片段长度见表1。实时定量PCR反应采用Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG试剂盒(Invitrogen公司)。20μl反应体系中包括由40ng total RNA反转录所得的cDNA，10μl Platinum Quantitative PCR SuperMix-UDG，10μM的上下游引物和TaqMan探针各0.4μl。PCR反应条件为50℃温育2分钟，95℃预变性2分钟；95℃30秒，62℃1分钟，45个循环。实时定量PCR过程中荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数为CT值，计算各个样本KNSL4的CT值与管家基因GAPDH的CT值的差值ΔCT，2-□CT即为各个样本中KNLS4相对于同一样本中GAPDH的表达量。FAM(6-carboxy-fluorescein)为荧光报告基团，TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine)为荧光淬灭基团。荧光报告基团还可为SYBR GreenI、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等荧光染料。
三、统计学处理统计学分析采用SPSS10.0软件。两组之间比较采用Student’st检验，多组间比较采用单因素方差分析，Kaplan-Meier法用于患者的生存期分析。
四、结果1.KNSL4 mRNA表达与临床因素的关系乳腺原发癌中KNSL4的mRNA表达随着肿瘤的进展总体呈下调趋势，临床分期III-IV期组KNSL4的mRNA表达低于I-II期组(t＝3.842，p＜0.001)，差异有显著性，平均相对表达量下调50.0％；KNSL4的mRNA表达在ER和PR的阴性和阳性组之间比较，阴性组均低于阳性组，但差异无显著性(t＝-1.245，p＝0.216；t＝-1.871，p＝0.065)；在不同年龄组、病理类型和组织学分级之间差异均无显著性(p＞0.05)。检测上述病例中76例c-erbB-2的蛋白表达，27例c-erbB-2的蛋白表达阳性，阳性率为35.5％。乳腺原发癌中KNSL4 mRNA表达在c-erbB-2阳性组低于阴性组(t＝3.215，p＜0.01)，相对表达量下调52.3％。见表2。
2.KNSL4 mRNA表达与淋巴结转移的关系乳腺原发癌中KNSL4的mRNA表达在淋巴结阳性数1-3个组高于阴性组1.5倍(p＜0.05)，还高于8个以上组2.6倍，差异有显著性(p＜0.05)。将转移淋巴结分为0-3个组和大于3个组，淋巴结转移大于3个组KNSL4的mRNA表达低于0-3个组，差异有显著性(p＜0.01)，平均相对表达量下调37.5％。见表3。
3.KNSL4 mRNA表达与患者生存期的关系根据乳腺癌患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KNSL4mRNA的相对表达量，将1.40×10-3作为预后分组的临界值，有远处转移的病例KNSL4 mRNA的表达量小于1.40×10-3，与无远处转移病例比较差异有显著性(p＜0.01)。见表4，图1。KNSL4 mRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。
五、结论1.KNSL4表达水平与乳腺癌转移和预后相关，具有转移相关基因功能。
2.KNSL4 mRNA表达可以作为乳腺癌预后预测的基因标志。
3.建立了实时定量RT-PCR检测KNSL4 mRNA相对表达量的方法，确定了用于乳腺癌预后判断的临界值。
六、补充说明1.用于乳腺癌预后判断的KNSL4 mRNA相对表达量的临界值可能由于今后应用样本量的增加达到更优化。
2.实时定量PCR的荧光标记也可为非特异的SYBR green I等荧光染料双链DNA内插式非特异性标记。
3.还可以采用绝对定量PCR扩增、分子杂交等方法检测KNSL4基因的mRNA表达量，及免疫化学方法检测KNSL4基因的蛋白表达量，用于乳腺癌患者预后预测。
4.采用不同的检测方法其预后判断的阈值不同。
表1 Real-time RT-PCR引物和Tagman探针序列及扩增片断长度
表2 KNSL4的mRNA表达与临床各因素的关系分组例数t/F P
年龄≤48 48 2.02±1.62＞48 60 1.76±2.09 0.703 ＞0.05病理类型单纯癌60 1.78±1.72浸润性导管癌 25 1.90±1.44髓样癌12 2.20±3.09 0.282 ＞0.05腺癌 51.50±0.86其他 62.40±2.99临床分期I-II 79 2.16±2.09III-IV29 1.10±0.77 3.842 ＜0.001组织学分级I 12 1.63±1.22II73 2.03±2.01 0.751 ＞0.05III 23 1.52±1.76ER阳性 68 2.09±2.12阴性 36 1.60±1.40 -1.245 ＞0.05PR阳性 49 2.29±2.24阴性 55 1.59±1.51 -1.871 ＞0.05c-erbB-2蛋白阴性 49 2.24±2.33阳性 27 1.09±0.69 3.215 ＜0.01
表3 KNSL4 mRNA表达与转移和预后的关系例数
t/F P
淋巴结转移个数(1)0 52 1.85±1.641-322 2.83±2.933.292＜0.05*4-714 1.63±1.20＞＝8 20 1.09±0.82淋巴结转移个数(2)0-374 2.14±2.132.727＜0.01＞329 1.10±0.77远处转移无远处转移组 64 2.00±1.96远处转移组 19 1.46±1.93 1.0340.304
*淋巴结阳性数1-3个组KNSL4的mRNA表达高于阴性组和大于8个组(p＜0.05)表4以KNSL4 mRNA量对表达1.40×10-3为临界值对患者预后分组
权利要求
1.驱动蛋白样DNA结合蛋白(kinesin-like DNA binding protein，Kid，KIF22，Accession No.NP_015556)基因(kinesin-like 4，KNSL4，AccessionNo.NM_007317)的转移相关基因功能。
2.KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的标志物用途，其特征在于基于KNSL4基因表达水平可以预测乳腺癌患者的预后，KNSL4表达水平高的患者预后好，表达水平低的患者预后差。
3.基于KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的检测及应用方法，其特征在于a.提取肿瘤患者原发癌组织标本的细胞总RNA；以RNA为模板逆转录合成cDNA；以cDNA为模板，用KNSL4基因和管家基因的特异性引物和荧光标记探针进行实时定量PCR扩增，计算KNSL4基因mRNA的相对表达量为2-ΔCt，其中，ΔCt＝CtKNSL4-CtGAPDH(CT为实时定量PCR时荧光信号达到设定阈值时所经过的循环数)；b.根据乳腺癌患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KNSL4 mRNA表达量，确定预后判断的临界值，KNSL4 mRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于以原发癌组织中KNSL4 mRNA表达量为1.40×10-3作为对肿瘤患者预后判断的临界值，高于该临界值的患者则判断为预后好，低于该临界值则判断为预后差。
5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于KNSL4基因实时定量RT-PCR的引物和探针序列是上游引物5’-CAAGGAGGGAGTGGAATG-3’；下游引物5’-GGAGGTGGACGACGAGTAG-3’；特异性荧光标记探针序列5’(FAM)-GCGGCGATCTCAGGAGCTGGTCGCT-3’(TAMRA)。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于荧光报告基团还可以是SYBR Green I、VIC、TETJOE、NED、TAMRA、Cy3、Cy5、ROX、Texas Red等荧光染料。
全文摘要
本发明公开了①驱动蛋白样DNA结合蛋白基因KNSL4具有转移相关基因的功能；②KNSL4基因表达水平预测乳腺癌患者预后的标志物用途；③基于KNSL4mRNA表达量用于乳腺癌患者预后判断的应用方法建立了实时定量RT－PCR检测KNSL4的mRNA表达水平的方法，根据患者复发转移阳性病例和复发转移阴性病例的KNSL4基因mRNA表达水平确定判断患者预后的临界值，KNSL4mRNA表达量高于临界值的患者预后好，而低于临界值的患者预后差。
文档编号C12N15/11GK101089198SQ20071011163
公开日2007年12月19日 申请日期2007年6月1日 优先权日2006年6月4日 公开号200710111637.8
发明者冯玉梅, 李晓青, 万艳芳 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院