血清白蛋白与干扰素的融合蛋白的制作方法

专利名称：血清白蛋白与干扰素的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白，特别是血清白蛋白与干扰素的融合蛋白。
背景技术：
血清白蛋白是血浆的重要成份，也是许多内源因子和外源药物的载体，正常情况 下不易透过肾小球。人血清白蛋白(序列l)是一种585个氨基酸残基组成的蛋白质 (A. Dugaiczyk et al.,PNAS,1982 79:71-75)，其分子量约为66.5KD，血浆半衰期长达2 周以上。
人血清白蛋白(HSA)在细胞中是以一种含18个氨基酸残基的信号肽和6个前肽的 原肽形式合成的，信号肽和前肽在转运和分泌过程被切除。人血清白蛋白已成功地 在多种宿主中表达(EP330451和EP361991)。
干扰素(IFN)分为I型和II型，人I型干扰素主要包括，IFNa和IFNP，两者共 用一种受体一IFNa/p受体，II型干扰素主要为IFNY。 IFNci分为多种亚型，如IFN a2a、 IFNa2b、 IFNalb等，有人根据这些亚型的特点设计了共有干扰素IFN a con (consensus interferon)。各型干扰素的氨基酸序列在孙卫民等编著的《细胞因 子研究方法学》(人民卫生出版社，1999， p541-576)和吴梧桐等编著的《基因工程药 物一基础与临床》(人民卫生出版社，1992， pl54-164)有详细叙述。天然的IFN a 由白细胞产生，由165至166个氨基酸组成，有2对二硫键，(C1-C98,C29-C138或 C1-C99，C29-C139)，天然的IFN 0由成纤维细胞产生，由166个氨基酸组成，有l对 二硫键，(C31-C141)，天然的IFNy由127至143个氨基酸组成，没有二硫键。I型干 扰素(包括IFNci和IFNP)的生物活性基本相同，主要包括抗病毒、抗细胞增殖和 免疫调节作用，临床上可用于治疗病毒性肝炎(包括乙型肝炎、丙型肝炎等)、肿瘤、 多发性硬化症等，II型干扰素抗细胞增殖和免疫调节作用较强，抗病毒能力较弱。临 床上可用于治疗类风湿关节炎、慢性肉芽肿等疾病，现在用于治疗的rMFN主要是由 大肠杆菌表达的。
由于IFN分子量较小，易被肾小球滤过，因而临床应用时，血浆半衰期较短，一 般需要大剂量频繁用药，如每周2-3次，而IFN治疗肝炎、肿瘤、多发性硬化症、类 风湿等疾病时，治疗周期常常长达数月甚至数年，这种长期大剂量频繁用药不仅增加
了病人的痛苦和治疗费用，而且易产生毒副反应。

发明内容
本发明的目的是提供一种集血清白蛋白与干扰素的特性为一体的血清白蛋白与 干扰素融合蛋白。
本发明的血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85%序列同 源的第一区和与人干扰素至少85%序列同源的第二区。
其中优选的是包括与人血清白蛋白至少95%序列同源的第一区和与人干^^素至 少95%序列同源的第二区。
最优选的是包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人干扰素氨 基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨 基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
在本发明的融合蛋白中，可以是与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的 N-末端，与人干扰素同源的第二区位于融合蛋白的C-末端；也可以是与人干扰素同源 的第二区位于融合蛋白的N-末端，与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C-末端，但前一种情况的基因在酵母中的表达较高。
为了使融合蛋白两部分间有较大的间隔，使干扰素部分最大可能地与干扰素受体 结合，所述与人血清白蛋白同源的第一区与人干扰素同源的第二区之间设有连接肽， 所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]n， n为1-10的整数；其中，优选的是n为l誦3
的整数。
本发明的干扰素可以是IFNa 、 IFNP ，也可以是IFNY，当干扰素是IFNa时，
可以是IFNa2a， IFNalb, IFNa 2b或共有干扰素IFN a con。
本发明的另一个目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。 包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人干扰素氨基酸残基序
列相同的第二区的融合蛋白的DNA序列。其中第一区与人血清白蛋白氨基酸残基序
列相同，第二区与人千扰素氨基酸残基序列相同，中间设有GlyGlyGlyGlySer连接肽
的融合蛋白。
本发明的又一个目的是提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。
本发明的重组表达载体包括pHIL-D2HSAIFN质粒、PD3HSAIFN0质粒、 PD3HSAIFN2质粒、pPIC9IFN-HSA质粒等。
本发明的再一个目的是提供表达本发明融合蛋白编码基因的宿主。 本发明的宿主可以是被重组表达载体或重组表达载体的一部分转化，含有本发明 融合蛋白编码基因的细菌、酵母、动物细胞或植物细胞；其中优选的是酵母，更优选
的是毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。
本发明将白蛋白分子，或其至少85%序列同源的类似物与干扰素，或其至少85% 序列同源的类似物融合，所形成的融合蛋白既保留了与干扰素受体结合的活性，同时 与干扰素相比，其血浆半衰期又得到了延长。本发明的融合蛋白既可以保留激活干扰 素受体的活性，作为该受体的激动剂，制造成干扰素类药物，也可以仅保留与该受体 结合的活性，作为该受体的抑制剂，制造成用于治疗某些与干扰素或其受体过量表达 有关疾病的药物。
人血清白蛋白天然存在多态性，本发明融合蛋白中的人血清白蛋白部分也包括这 些多态型。
编码HSA的多聚核苷酸和编码MFN的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如 PCR (Saiki等Science. 239:487-491， 1988)、 RT-PCR方法、人工合成的方法和构建筛 选cDNA文库的方法等获得，用作PCR模板和用于构建cDNA文库的mRNA或cDNA 可以来源于任何含有相应mRNA或cDNA的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA 文库(购自Clontech Laboratories Inc. USA)获得。也可以用人工合成的方法获得，人工 合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。编码IFNa(包括IFN a lb、 IFNa 2b、 IFNa 2a等)的多聚核苷酸可以用RT-PCR的方法从用新城鸡瘟病毒 诱导的人外周血白细胞的RNA制品中获得，编码IFNa con的多聚核苷酸可以用人工 合成的方法获得，编码IFNe的多聚核苷酸可以用RT-PCR的方法从用干扰素、聚肌 胞、放线菌酮和放线菌素诱导的人成纤维细胞、羊膜细胞、皮肤癌细胞的RNA制品 中获得。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其 它多聚核苷酸连接等。编码HSA和编码hIFN的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读 框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR的方法，在编码序 列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码HSA和编码hIFN 的多聚核苷酸的粘性末端用DNA连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果 需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有 限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到 各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见J.萨姆布鲁克等(J.萨姆布鲁克等，《分 子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995.)的叙述。
许多表达载体和其对应的宿主可以从公司购得，如酵母表达载体PHIL-D2 ，
pPIC9， pHIL-S, (Invitrogen Corp. San Diego. California. USA),动物细胞表达载体 pSVK3、 pMSG (Amersham Pharmacia Biotech Inc.US A)等。优选的方法是将编码本 发明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表达载体pHIL-D2 ， pPIC9等，这些质粒 为酵母整合型质粒，带有His4选择性标记。醇氧化酶操纵子(AOX1) 5'序列和3'序 列，用于方便编码基因整合至酵母染色体，和控制编码基因的表达。这些质粒及对应 的宿主菌等可以从Invitrogen Co卬.San Diego. California. USA构得，优选的启动子为 AOXl。
表达融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳动物细胞、细菌、动物、植物等。融合蛋 白或多肽可以存在于宿主细胞内，也可以是从宿主中分泌出来，优选的，是从宿主中 分泌出来。分泌所用的信号肽，优选的是天然的人血清白蛋白的信号肽，或酵母MF ci信号肽，或这两种信号肽的类似物。更优选的用天然的人血清白蛋白的信号肽，用 该信号肽时融合蛋白表达水平较高。融合蛋白或多肽也可以不用信号肽，而在酵母中 以胞内可溶形式表达。编码融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色体，或以游离质粒 形式存在。
转化所需核酸至宿主细胞中去可用通常的方法，如电穿孔，制备感受态的原生
质球等。成功转化的细胞，即含有本发明DNA构建体的细胞，可通过人们熟知的技 术加以鉴定，如细胞经收集并裂解，提取DNA，然后PCR方法鉴定。或者，细胞培 养上清中或细胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗IFN的抗体检测。
可以通过培养含有本发明DNA构建体的宿主，如重组酵母、重组哺乳动物细胞、 重组细菌、转基因动植物等，生产本发明的融合蛋白。具体的培养方法，可以用摇瓶 或生物反应器等，生产时优选的为生物反应器。培养基应能提供菌体(或细胞)生长 和产物表达所需的物质，应包含氮源、碳源、pH缓冲成分等，培养基配方一般应根 据不同培养对象，通过试验获得。培养可分两个阶段，第一阶段主要用于菌体(或细 胞)的生长，第二阶段主要用于合成产物。
可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离、纯 化融合蛋白。如盐析、沉淀、超滤、液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层 析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水、反相等层析技术。
本发明中的融合蛋白可以有各种衍生物，这些衍生物可以是但不局限于其不同形 式的盐、修饰产物等。如在多肽的氨基、羧基、羟基、巯基上再进行修饰。所用修饰 剂可以但不局限于聚乙二醇，葡聚糖等。
本发明中的融合蛋白及其衍生物可单独使用，优选的为与一个或多个药学上可接 受的载体一起组成药物制剂。药物载体一般应与融合蛋白相容且不能对受体自身有 害，典型的载体为水、盐水、糖类、醇类或氨基酸，它们需无菌且无致热原。药物制 剂可以单位剂量的形式存在，并可通过任何本领域已知的方法制备。这些方法包括将
融合蛋白与具有一种或多种辅助成分混合的步骤。优选的药物制剂包括含水的液体制 剂和含水量低于10%或不含水的冻干制剂。这些制剂可以含有缓冲剂，盐类，小分子 糖类等，使药物的渗透性与受体血液中的渗透性相等或相似。药物制剂可存在于单元 剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓶，西林瓶或小管中。冻干制剂是将液体制剂冷 冻干燥制备的，使用前加入无菌、无热原的液态载体，如注射用水。
优选的单元剂量包括有融合蛋白的日用剂量或单元日用剂量或其适当的亚分。
本发明中的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物可以通过任何已知的方法，包括 注射(如皮下或肌肉)、静脉输注、透皮、吸入、口服等方法给药。优选的方法为静 脉输注或注射给药。治疗包括在一段时间内使用单一剂量或复合剂量。
本发明的融合蛋白及其衍生物或其药物组合物，作为干扰素类药物可用于治疗可 用干扰素或其类似物治疗的疾病，如病毒性肝炎(包括乙型、丙型肝炎等)、肿瘤(包 括白血病、 一些实体瘤等)、多发性硬化症、类风湿等。作为干扰素抑制剂可用于治 疗与干扰素或其受体过量表达有关的疾病，如变态反应等。
使用剂量可通过融合蛋白相对于IFN的效价计算出，同时考虑融合蛋白相对于天 然IFN延长的半衰期。典型用量为1X103—1 X106 U/kg。在由全长HSA和全长IFN 融合蛋白中，按照摩尔数相当即意味着使用较大重量的融合蛋白，但使用频率可降低， 如一周一次或更少。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。


图1为pHIL-D2HSAIFN质粒的构建，
图2为pD3HSAIFN0质粒的构建
图3为pD3HSAIFN2质粒的构建
图4为pPIC9IFN-HSA质粒构建
图5为纯化的融合蛋白的SDS-PAGE分析
图6为融合蛋白的抗病毒活性
图7为融合蛋白酶联免疫分析
图8为HSA/IFN和rhIFN在小鼠血浆中的代谢，
其中l:HSA/IFNa2b 2: HSA/IFN卩3:IFNa2b 4: IFN卩
具体实施例方式
实施例l: HSAcDNA的克隆
用PCR方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc. USA)获得带有 信号肽和前肽编码序列的HSAcDNA，所用的引物HSA1和HSA2用寡聚核苷酸合成 仪合成，其中引物HSA2除包括HSA基因的3，末端序列外，还在其3，末端后加入了 编码GlyGlyGlyGlySer接头肽的序列。
HSA1: 5， GCTTCGAAACCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCT3， HSA2: 5， TAGGATCCACCACCACCAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC3， PCR条件为100|al反应体系中，加入lpl人肝胎cDNA文库，20^imol/L的HSA1 和HSA2引物各3nl， 2mmol/L的dNTP, 10(il ， 10X反应缓冲液lOpl， TaqplusIDNA 聚合酶5U。用Perk-Elmer公司的9600PCR仪，PCR条件为94。C变性1分钟，52°C 退火1分钟，72'C延伸3分钟，35个循环后，再72'C延伸10分钟。通过凝胶电泳分 析反应物显出一预期大小(1.8KD)的条带，PCR产物电泳纯化，用DNA片段回收 试剂盒回收纯化约1.8KD的目标带(实验中的TaqplusI DNA聚合酶、内切酶、连接 酶、试剂盒等购自上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术 有限公司)。取纯化的HSA cDNA 6^1 ，加入1 ^ pGEM-T载化，8pl 2X缓冲液，1 |il T4DNA连接酶(pGEM-T载体、缓冲液和酶为Promega Corp.USA产品)，15'C反应 过夜，转化JM109感受态细胞(细胞购自北京博大泰克生物基因技术有限公司〉。转 化菌辅于含x-gal和IPTG和氨苄青霉素(50jig/ml)的LB琼脂平皿上，37。C培养过 夜。挑取白色菌落，接种至3ml含氨苄青霉素(50pg/ni1)的LB培养基，37匸培养过 夜，用常规方法抽提质粒，用PstI酶切，(在载体上和HSAcDNA上各有PstI酶切位 点)，电泳分析鉴定阳性克隆。从pGEM-T载体的多克隆位点两端分别测序，并合成 两个测序引物
HSA3: 5'GCCAGAAGACATCCTTAC3' HSA4: 5'AGTTGGAGTAGACACTTG3，
从两端中部接着测序，完成HSAcDNA全长测序。获得了含有序列正确的HSA cDNA的克隆，JM109 (pGEMT-HSA)，这里克隆的HSAcDNA含有其天然的信号肽 和前肽部分的编码序列，以便于在表达时，直接利用其信号肽和前肽用于作为分泌信 号，同时在HSA cDNA的c末端添加了接头肽GlyGlyGlyGlySer的编码序列。
实施例2: IFNa的cDNA克隆
取正常人外周血加分离淋巴细胞分层液，分离人白细胞，用含5 %胎牛血清的DMEM 培养基培养，加新城鸡瘟病毒后37'C培养1小时，离心弃上清，重新加入培养基，37'C， 5%0)2培养18小时。用RNA提取试剂盒分离总RNA，用通用RT-PCR试剂盒(这 两个试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，具体操作按说明书进行)获 得逆转录的cDNA，通过PCR方法获得IFNa的cDNA。所用的引物随所需克隆的IFNa 亚型的不同略有不同，如克隆IFNa2b、 IFNa2a,其引物可用
工FNa2b-l: 5，-一 ATGGATCC TGT GAT CTC CCT CAA ACC CAC AG—-3，
IFN a 2b-2: 5，--- ATGAATTC TTA TTC CTT ACT CCT TM TCT TTC TTG---3，
克隆IFNa lb,其引物可用
工FNa lb-1: 5，-一 ATGGATCC TGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AG -—3,
IFN a lb-2: 5，--- ATGMTTC TTA TTC CTT CCT CCT TAA TCT TTC TTG ---3'
PCR方法为
lOOpl反应体系中加入1^1逆转录产物，20^raol/L的IFNa2b-1、 IFNa2b -2 (或IFNalb-1、 I.FNalb -2)引物各3|il , 2mmol/L的dNTP， 10^1 ， 10X反应缓 冲液lOjal， pfuDNA聚合酶5U， ( dNTP、反应缓冲液、pfu DNA聚合酶均为上海生物 工程技术服务有限公司产品)。用Perk-Elmer公司的9600 PCR仪，PCR条件为94°C 变性1分钟，52。C退火30秒，72'C延伸1.5分钟，循环35次。通过凝胶电泳分析反 应物显出一预期大小(约0.5kb)的条带，PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化 回收。用BamH I和EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶 解的pUC19质粒上(实验中的pfu酶、内切酶、连接酶、pUC19质粒、试剂盒等购自 上海生工生物工程技术服务有限公司和北京博大泰克生物基因技术有限公司)，转化 大肠杆菌JM109,每种PCR产物挑选若千克隆，纯化质粒，BamHI—EcoRI区DNA测序， 挑选其编码的氨基酸序列分别含有IFNoclb、 IFNa2b、 IFNa2a序列的克隆，分别命名 为pUC-IFNcdb、 pUC-IFNot2b、 pUC-IFNcc2a等。其它亚型的IFNa的cD隐可用相似的 方法克隆，共有千扰素的基因可用人工合成的方法获得。 实施例3: IFNP的cDNA克隆
人羊膜细胞(Wish细胞，中国科学院细胞库提供)用含10%小牛血清的1640培 养基培养至细胞铺满瓶底，弃培养基，加含100U/ml IFN，和10%小牛血清的1640 培养基继续培养16小时，弃培养基。加入含50iig/ml聚肌胞苷酸，和10ug/ml放线 菌酮的1640培养基继续培养4小时，再加放线菌素D 1 y g/ml，培养5小时。弃上清， 用胰酶消化后，收集细胞，用RNA提取试剂盒分离总RNA，用通用RT-PCR试剂盒(这 两个试剂盒均购自北京博大泰克生物基因技术有限公司，具体操作按说明书进行)获 得逆转录的cDNA，通过PCR的方法获得IFN P的cDNA，其引物可用
IFN 3 -l: 5 'ATGGATCC ATG AGC TAC AAC TTG CTT GGA3' IFN 5 -2: 5 ，ATGAATTC TTA GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG TC3' PCR和克隆方法同实施例2，获得的克隆BamHI—EcoRI区DNA测序，挑选其 编码的氨基酸序列与IFNe序列的克隆，命名为pUC-IFNp。
实施例4:连接肽为GlyGlyGlyGlySer时本发明融合蛋白的表达 如图1所示，为了将HSA与IFN以融合蛋白形式从毕赤酵母分泌表达，选择 pHIL-D2质粒作为载体(Invitrogen Corp. USA)。在该载体AOX启动子下游NspV与 EcoRI位点间插入HSA/IFN基因，因pHIL-D2载体上有两个NspV位点，为了方便操 作，首先pHIL-D2载体用Clal/Sal酶切成3段，回收4kb片段，自身连接后命名为pD3 载体。pD3载体用NspV/EcoRI切，回收线性化载体，将实施例2、 3构建的pUC19-IFN a lb、 pUC19-IFN a 2b、 pUC19-IFN a 2a和pUC19-IFN e分别用BamHI/EcoRI切，回 收约0.5kb的含IFN的cDNA的片段，将实施例1构建的pGEMT -HSA用 NspV/BamHI切，回收约1.8kb的含HSA cDNA的片段，将线性化pD3载体与含HSA cDNA和各含IFN cDNA的片段分别用T4连接酶催化连接，转化大肠杆菌JM109， 挑选阳性克隆，用NspV/EcoRI和NspV/ BamHI酶切鉴定，获得阳性克隆大肠杆菌 JM109 (pD3HSAIFNa lb)、大肠杆菌JM109 (pD3HSAIFN a 2b)、大肠杆菌JM109 (pD3HSA IFNa2a)和大肠杆菌JM109 (pD3HSA IFNP )。上述克隆分别培养扩增 后，纯化质粒，用Clal/Scal切，电泳回收线性化的约6.3kb片段，pHIL-D2空载体用 Clal/Scal切,回收约4.2kb的片段。将pHIL-D2的4.2kb片段分别与上述含HSA和各 种IFN基因的6.3kb片段用T4连接酶催化连接，连接产物转化大肠杆菌JM109后， 辅于含氨苄青霉素(50ug/ml)的LB琼脂平皿，挑选阳性克隆，抽提质粒，酶切鉴定， 获得克隆大肠杆菌JM109(pHIL-D2HSAIFN a lb)，大肠杆菌JM109(pHIL-D2HSAIFN a 2b)、大肠杆菌JM109 (pHIL-D2HSAIFN a 2a)和大肠杆菌JM109 (pHIL-D2HSAIFN 3 )。这些质粒的构建过程如图1所示(其中IFN表示IFNa lb、 IFNa 2b、 IFNP等 各型和各亚型干扰素)。这些克隆分别培养扩增后，各纯化质粒约10pg,用NotI醇切。 线性化后分别转化毕赤酵母GS115 (酵母表达试剂盒由Invitrogen Corp. USA提供)， 转化后的GS115，分别辅于含山梨醇的RDB琼脂1.5%琼脂，lmol/L山梨醇，1%葡 萄糖，4X10^/。生物素，1.34%无氨基酸酵母氮源(YNB， DifcoCorp.) ,0.005%氨基 酸混合液(谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸各0.005%)平皿，37°。培 养1-2周，挑取His+克隆。接种至装有25m旧MGY培养基(100mmol/L磷酸钾，pH6.0， 4Xl(T"/。生物素，1.34%无氨基酸酵母氮源，1%甘油)300ml三角瓶，250转/分钟30 。C培养48小时，加甲醇0.5。/。/24h，诱导培养4天，离心取上清，过滤除菌。用细胞 病变抑制法测定培养上清中干扰素的活性(方法见《中国生物制品规程》2000版，中
国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6， p373-375)。人羊膜细胞(Wish 细胞)培养于含10。/。小牛血清的MEM培养基中、每周传代2次(用前用胰酶消化， 用含10%小牛血清的MEM培养基配成，2.5-3.5Xl()S个细胞/ml)。接种于96孔细胞 培养板中，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培养4-6小时。在另一 96孔细胞培养板中，每 孔加入150 y 1测定培养液(含7%小牛血清的MEM培养基)，样品作2倍梯度稀释， 每孔100yl样品稀释液转移至加有细胞的培养板中，37°C， 5%0)2培养18-24小时,弃 上清，加入用含3 %小牛血清的MEM培养基稀释至100TCID5Q的VSV病毒(水泡口 炎病毒)，每孔100 lU， 37°C， 5°化02培养24小时，弃上清，每孔加入50 lU染色液(50mg 结晶紫溶于20%乙醇)，室温放置30分钟，流水小心冲去染色液，吸干残留水分，每 孔加入100ul脱色液(0.1%乙酸、50%乙醇)，室温放置5分钟，测定其在570nm的 吸光度值。在同一稀释度，吸光度高的克隆即是高表达克隆。得到的产物经SDS-PAGE 分析，分子量正确，酶联免疫分析证明其具有血清白蛋白和干扰素的特性，活性分析 证明具有干扰素抗病毒的活性。
实施例5: IFN/HSA融合蛋白的表达
用实施例2制备的人外周血白细胞cDNA，通过PCR方法获得IFN ct的cDNA。 所用的引物随所需克隆的IFNa的亚型的不同略有不同，如克隆IFNa2b, IFNa2a， 其引物可用
IFN a 2b陽3: 5，ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA TGT GAT CTC CCT CAA ACC CAC AG3，
IFNa 2b-4: 5，ATGGATCCACC ACC GCC TTC C TT ACT CCT TAA TCT TTC TTG3，
克隆IFNdlb,其引物可用
IFN a lb-3: 5， ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA TGT GAT CTC CCT GAG ACC CAC AG 3"
IFN cc lb -4: 5， AT—GGATCCACC ACC GCC TTC CTT CCT CCT TAA TCT TTC TTG3
其它亚型的IFNa的cDNA可用相似的方法克隆，共有干扰素的基因可用人工合 成的方法获得。
用实施例3逆转录获得的cDNA为模板，通过PCR方法获得IFN 0的cDNA。 其引物可用
IFN P -3: 5，-- ATGTCGAC CTCGAG AAA AGA ATG AGC TAC AAC TTG CTT GGA3，
,3 -4: 5，—- ATGGATCCACC ACC GCC GTT TCG GAG GTA ACC TGT AAG
TC3'
引物用寡聚核苷酸合成仪合成。PCR方法同实施例1 ， PCR扩增后，在cDNA 的5'-端引入一个Sal I位点和一个Xho I位点，同时在Xho I位点下游引人了 KEX2 酶切位点，用以切除表达的融合蛋白的信号肽，3'-端引入BamHI位点。PCR产物电
泳纯化后，克隆到用SalI/Bamffl酶解的pUC19 (北京博大泰克生物基因技术有限公 司)质粒上，形成pUC-IFNa2b2、 pUC-IFNalb2、 pUC-IFNP2等。DNA测序结果 表明这些克隆分别含有编码IFN a 2b、 IFNa lb和IFNP的序列，只是在其5'-端加入 了SalI位点、Xhol位点、KEX2酶切位点，和3'—端去除了终止密码子，加入了编 码柔性接头的寡聚核苷酸，及BamHI位点。
用PCR的方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc. USA)获得 HSAcDNA，所用的引物HSA5和HSA6用寡聚核苷酸合成仪合成 HSA5: 5 ，一 TAGGATCC GAT GCA CAC AAG AGT GAG GTT—3' HSA6: 5，一 ATGAATTC TTAAAGGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC—3 ， PCR方法同实施例1 ， PCR产物电泳纯化后，克隆到用BamHI/EcoRI酶解的pUC19 (北京博大泰克生物基因技术有限公司)质粒上，形成pUCHSA2。 DNA测序结果表 明此克隆序列和HSA成熟肽的编码序列相同，只是在其5'-端加入了 BamHI位点， 和3'—端终止密码子后加入EcoRI位点。
选择pPIC9质粒作为酵母表达载体(Invitrogen Corp. USA)。在该载体AOX启动 子下游Xhol与EcoRI位点间插入IFN/HSA基因。将上面构建的pUC-IFNa 2b2、 pUC-IFN ct lb2、pUC-IFN P 2等质粒用XhoI/BamHI切，分别回收0.5kb的含IFN cDNA 的片段；将pUCHSA2用BamHI/EcoR I切，回收约1.8kb的含HSA cDNA的片段； 将pPIC9质粒用XhoI/EcoRI酶切，回收线性化片段,将各种IFN eDNA分别与含HSA cDNA的片段和线性化的pPIC9载体用T4DNA连接酶催化连接，转化大肠杆菌JM109， 挑选阳性克隆，分别用XhoI/BamHI和BamH工/EcoK I酶切鉴定，获得阳性克隆大肠杆 菌J1109 (pPIC9 IFNa2b HSA)、大肠杆菌J1109 (pPIC9 IFNa lb HSA)、大肠杆菌 JM109 (pPIC9 IFNPHSA)。各克隆扩增后，纯化质粒，用BglII酶切线性化后，转化 毕赤酵母GS115 (Invitrogen Corp. USA公司酵母表达试剂盒提供的方法)，转化后 的GS115，辅于含山梨醇的RDB琼脂平皿(配方同实施例3)， 37"C培养l-2周，挑取 His+克隆。摇瓶培养和表达菌株筛选方法同实施例3，工程酵母的培养、产物纯化、 IFN活性测定、HSA抗原性测定方法同实施例7 。结果表明表达的IFN/HSA融合蛋白 有刺激IFN活性和HSA的抗原性。
实施例6:不同接头HSA/IFN融合蛋白的表达
将实施例4中构建的质粒pD3HSAIFN a lb、 pD3HSAIFN a 2b、 pD3HSAIFN a 2a、 pD3HSAIFN0等分别用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，用绿豆芽核酸酶处理，切 除突出末端，T4D息连结酶平端连接，转化大肠杆菌JM109菌，挑选阳性克隆，酶切 鉴定，获得带有在HSAcDNA末端缺失CTT (亮氨酸)后与各IFN cDNA直接融合基因的质
粒pD3HSAIFN a lb0、 pD3HSAIFN a 2b0、 pD3HSAIFN a 2a0、 pD3HSAIF駒等
同样，在HSA和IFN可以加入多种柔性接头，如[Gly Gly Gly Gly Ser]n， n可以 是I-IO。
如用[Gly Gly Gly Gly Ser]2作为接头时，可用合成寡聚核苷酸 L2a:5， CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTG 3， L2b:5， GATCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCAAGG 3， 如用[Gly Gly Gly Gly SerL作为接头时，可用合成寡聚核苷酸 L3a:5， CCTTGGTGGTGGCGGTTCCGGCGGTGGTGGCTCCGGTGGCGGCG 3， L3b: 5， GATCCGCCGCCACCGGAGCCACCACCGCCGGAACCGCCACCACCMGG3， 将实施例4中构建的质粒pD3HSAIFNa lb、 pD3HSAIFNa 2b、 pD3HSAIFN0 ，分别 用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L2a与L2b退火后与回收的大片 段连接，转化大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定，获得带有在HSAcDNA末端与 各IFN cDNA间插入编码[Gly Gly Gly Gly Ser]2柔性接头的寡聚核苷酸的质粒 pD3HSAIFNa lb2、 pD3HSAIFNa 2b2、 pD3HSAIFNa 2a2、 pD3HSAIFNP 2等(其步骤如图 2所示)。
同样将实施例4中构建的质粒pD3HSAIFN ct lb、 pD3HSAIFN a 2b、 pD3HSAIFN a 2a、 pD3HSAIFNP，分别用BamH I/Stu I双酶切，回收大片段，寡聚核苷酸L3a与L3b 退火后与回收的大片段连接，转化大肠杆菌大肠杆菌JM109，挑取阳性克隆，酶切鉴定， 获得带有在HSAcDNA末端与IFN cDNA间插入编码[Gly Gly Gly Gly Ser]3柔性接头 的寡聚核苷酸的质粒pD3HSAIFN a lb3、 pD3HSAIFN a 2b3、 pD3HSAIFN a 2a3、 pD3HSAIFN 0 3等。可用相似的方法改造实施例5构建的pPIC9 IFNa lb HSA、pPIC9 IFNa 2b HSA 、 pPIC9 IFNPHSA等质粒，以在IFN与HSA间插入不同的接头。
将以上构建的质粒，如pD3HSAIFNa lbO、 pD3HSAIFN a 2b0、 pD3HSAIFN a 2a0、 pD3HSAIFN3 0 pD3HSAIFNa lb2、 pD3HSAIFN a 2b2、 pD3HSAIFN a 2a2、 pD3HSAIFN3 2、 pD3HSAIFNa lb3、 pD3HSAIFNa 2b3、 pD3HSAIFN a 2a3、 pD3HSAIFNP 3等分别用与实施 例4相同的方法构建对应的质粒pHIL-D2HSAIFNct lbO、 pHIL-D2HSAIFN a 2b0、 pHIL-D2HSAIFN a 2a0、 pHIL-D2HSAIFN P 0、 pHIL-D2HSAIFN a lb2、 pHIL-D2HSAIFN a 2b2、 pHIL-D2HSAIFNa 2a2、 pHIL-D2HSAIFN 0 2、 pHIL-D2HSAIFN a lb3、 pHIL-D2HSAIFN a2a3、 pHIL-D2HSAIFN a 2b3、 pHIL-D2HSAIFN P 3,转化毕赤酵母GS115，获得分别表 达HSA末端缺失亮氨酸后与各IFN直接融合的HSAIFNa lbO、 HSAIFNa 2b0、 HSAIFN a 2aO、 HSAIFN e 0等融合蛋白、HSA与IFN间插入[Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser]柔性接头的HSAIFNa lb2、 HSAIFNa 2b2、 HSAIFNa 2a2、 HSAIFN3 2等融合
蛋白及HSA与IFN插入[Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser]柔性接头的融合蛋白HSAIFNa lb3、 HSAIFN。2b3、 HSAIFNa2a3、 HSAIFNP3等。 实施例7:工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化
以实施例5构建的表达HSA/IFN a 2b融合蛋白的工程酵母发酵和融合蛋白的纯化 为例，其它工程酵母的发酵和融合蛋白的纯化可用相同或相似的方法。
工程酵母接种lOOmlYPD培养基(酵母抽提物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖 10g/L)，摇床30'C， 280转/分钟培养24h。接种至装有2. 5L基础培养基的5L发酵 罐(B.Braun Corp. Germany),其中基础培养基的配制方法为浓磷酸3.5ml/L， CaSa,.2H20 0. 15g/L， K2S04 2. 4g/L， MgS04. 7H20 1, 95g/L， KOH 0. 65g/L， 121。C高压 灭菌30分钟，再加入30ml/L甘油(单独12rC高压灭菌30分钟)，lml/L PTM(配方 为CuS04. 5H20 6. Og/L, CoCl2. 6H20， MnS04. H20 3. Og/L,跳O. 02g/L， FeSO" 7H20 65. Og/L NaMo04. 2H20 0. 2g/L, ZnS04. 7H20 20. Og/L, KI 0. lg/L,浓H2S04 5ml/L， 121。C高压灭菌 30分钟)，0. 5ml/L0. 02%生物素(过滤除菌)。接种前用氨水将培养基pH调至5. 8。 发酵过程控制温度为30°C，溶氧始终大于20%饱和度，pH值不高于6.0，培养至甘油 耗尽后，开始流加甘油(50%甘油，加12ml/LPTM， 2ml/L0.02%生物素)，继续培养， 至密度0仏。。值约为150时，开始补加甲醇(分析纯甲醇，加12ml/LPTM， 2ml/L。. 02% 生物素)诱导。诱导培养60小时。取50ml培养液离心取上清，加入硫酸铵至20X饱 和度，混匀后4。C放置过夜，离心取沉淀，用3ml25mmol/LTris-HC1 (pH7.0)溶解， 用Supdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech UK) 01.6X100cm柱层析分离，流 动相为25mmol/LTris-HC1 (pH7.0) , 150mmol/LNaCl，流速为lml/L，紫外检测，收集 第一峰(保留时间为70-85分钟)，即为纯化的融合蛋白，分子量为85KD(如图5所示， 如图5所示，其中，l是分子量标准，自上而下分别为94， 67， 43， 30KD; 2是纯化 的HSAIFNa2b)。纯化样品用细胞病变抑制法测定IFN活性(方法见《中国生物制品 规程》2000版，中国生物制品标准化委员会编，化学工业出版社2000.6， p373-375)。 Wish细胞(人羊膜细胞)培养于含10y。小牛血清的MEM培养基中、每周传代2次(用 前用胰酶消化，用含10%小牛血清的MEM培养基配成。2.5-3.5X105个细胞/ml)。接 种于96孔细胞培养板中，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培养4-6小时。在另一 96孔细 胞培养板中，每孔加入150ul测定培养液(含7。/。小牛血清的MEM培养基)，样品作2 倍梯度稀释，每孔100y l样品稀释液转移至加有细胞的培养板中，37'C， 5%0)2培养 18-24小时，弃上清，加入用含3 %小牛血清的MEM培养基稀释至100TCID5。的水泡口炎 病毒(VSV病毒)，每孔100ul， 37°C， 5%0)2培养24小时，弃上清，每孔加入50ul 染色液(50mg结晶紫溶于20%乙醇)，室温放置30分钟，流水小心冲去染色液，吸干残留水分，每孔加入100lil脱色液(0. 1%乙酸、50%乙醇)，室温放置5分钟，测定 其在570mn的吸光度值，如图6所示，横轴为2倍梯度稀释的孔数，纵轴是吸光度值， 结果显示样品明显具有干扰素活性。
用样品包被酶联板，分别用兔抗人血清白蛋白抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标 记的羊抗兔IgG作为二抗，检测样品，如图7所示，横轴为2倍梯度稀释的孔数，纵 轴是吸光度值，从图中可以看出，样品具有HSA的抗原性。
取相同活性剂量的HSA/IFNa2b、 HSA/IFN P融合蛋白禾口 rhlFNa2b、 rhIFNP ， 小鼠尾静脉给药，不同时间取血清测定其中的IFN活性。如图8所示，融合蛋白在小 鼠血浆中的代谢速度明显比rhIFN慢。注射后10分钟，两者在血浆中的IFN活性相 差不大，而8小时后，rhlFNa2b和rhIFNP的活性下降了近十倍，而融合蛋白的活 性只略微降低了； 48小时后，注射融合蛋白的小鼠仍能测到IFN的活性。
权利要求
1、一种融合蛋白，所述融合蛋白具有血清白蛋白和干扰素的特性，它包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人干扰素氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物，所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。
2、 根据权利要求l的融合蛋白，其中，所述第一区位于融合蛋白的N-末端，所 述第二区位于融合蛋白的C-末端；或者，所述第二区位于融合蛋白的N-末端，所述 第一区位于融合蛋白的C-末端。
3、 根据权利要求2的融合蛋白，其中，所述第一区与第二区之间设有连接肽， 所述连接肽的通式是[GlyGlyGlyGly Ser]n， n为1-10的整数。
4、 根据权利要求3的融合蛋白，其中，n为l-3的整数。
5、 根据权利要求l一4任意一项的融合蛋白，其中，所述第二区为IFNa、 IFN P或IFN Y 。
6、 根据权利要求5的融合蛋白，其中，所述IFNa为IFNa2a、 IFNalb、 IFN a 2b或IFNa con。
7、 编码权利要求1一6任意一项的融合蛋白的DNA序列。
8、 含有权利要求7所述DNA序列的细胞，其为细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。
9、 根据权利要求8的细胞，其中，所述酵母为毕赤酵母。
10、 根据权利要求9的细胞，其中，所述毕赤酵母为毕赤酵母GSU5。
全文摘要
本发明公开了一种血清白蛋白与干扰素的融合蛋白，编码融合蛋白的DNA序列，携带该DNA序列的细菌、酵母、动物细胞、植物细胞；本发明的融合蛋白包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人干扰素至少85％序列同源的第二区，该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入；本发明融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是[GlyGlyGlyGlySer]_n，n为1-10的整数；本发明的融合蛋白既有人干扰素的特性，半衰期又得到了延长，在药学领域将会得到广泛应用。
文档编号C12N15/63GK101200503SQ20071011146
公开日2008年6月18日 申请日期2001年8月10日 优先权日2001年8月10日
发明者军 吴, 唱韵红, 新 巩, 马清钧 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所