专利名称：卡介苗多糖核酸—dda佐剂的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其是结核亚单位疫苗的免疫佐剂。
背景技术：
结核病是严重危害人类健康的慢性传染病，可以通过飞沫传播，具有较强的传染性。随 着近年HIV的流行和多耐药结核杆菌的散播，药物治疗已经不能有效控制结核感染，易于造 成局部的爆发和高死亡率。在人群中给予结核杆菌疫苗免疫是防治结核感染、控制局部爆发 流行最有效的措施。目前全球广泛使用的唯一的结核病疫苗是BCG。然而，BCG的保护效率在 不同地区差异很大，对人群的保护效率在0-80%之间。尽管它对预防儿童的肺结核有效，但 对成人结核则几乎没有保护效果。在研的新型结核疫苗主要有两大类活的结核杆菌疫苗和 亚单位疫苗。结核亚单位疫苗虽然免疫原性没有活的结核杆菌疫苗强，但其免疫效力不受预 先接触环境分枝杆菌和结核分枝杆菌的影响，可以用于成人强化免疫，是控制结核病爆发的 理想疫苗。亚单位疫苗有三种形式蛋白质疫苗、DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗，其中蛋 白质疫苗相对最为安全，易于被人们接受。
蛋白质多肽需要有效的佐剂辅助才能引起理想的免疫应答。不同的免疫佐剂可以引起 Thl或Th2不同方向的免疫反应。传统的铝佐剂主要引起Th2为主的免疫应答，显然不适合 以细胞免疫为主的抗结核疫苗。因此寻找有效的佐剂以及传递方式是结核亚单位疫苗发展要 解决的主要问题。
阳离子脂质体二甲基三十六烷基铵(DDA)和蛋白水溶液混合可以形成乳化微粒，有助 于抗原的运输和递呈。Andersen发现DDA有较强的细胞免疫诱导活性，能诱.导CD4+T细胞的 增殖。但是，单用DDA做为结核亚单位疫苗佐剂，诱导的免疫反应不够强(低于传统结核疫 苗——卡介苗所诱导的强度)。经热酚法提取的卡介菌多糖核酸具有调节机体免疫水平的作 用，能增强机体的抗感染和抗过敏能力。研究表明结核杆菌的多糖核酸可以分别激活TLR2、 TLR9等巨噬细胞形态识别受体，通过生成释放Thl型细胞因子，增强机体细胞免疫应答，具 有重要的免疫辅助功能。有希望利用DDA与卡介菌多糖核酸联合应用作为结核亚单位疫苗的 免疫佐剂，可以有效运输和递呈抗原，诱导Thl型细胞免疫为主的免疫反应，具有增强蛋白 质疫苗免疫效应的功能。
发明内容
本发明的目的为提供卡介菌多糖核酸——DDA佐剂的制备方法及其作为结核亚单位疫苗 应用的免疫佐剂，所述佐剂可以有效运输和递呈抗原，诱导Thl型细胞免疫为主的免疫反应，具有增强蛋白质疫苗免疫效应的功能。
实现上述发明目的的技术方案如下-卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备方法为
(1) 菌种传代与培养
将保存于2-8'C的卡介苗冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上每传一次为一代，共培育 3-12代；
(2) 菌体收集
收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在3-5'C下离心，弃上清，将沉淀的菌体用蒸馏 水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎2-4h;
(3) 提取
菌液与1. 5-3倍体积45%苯酚醋酸钠混匀，在65 — 70'C水浴中保持30—50min，然后移 入3-5。C的冰浴，将菌液无菌转移至离心管，在3-5。C下离心，弃沉淀，收集上清，重复以上 操作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；
预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析10-15小时，随后 用蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇， 以1 : IO体积比例加入生理盐水，转至离心管中离心，分别以乙醇、乙醚混匀洗涤三次，在 3-5'C下离心，收集沉淀并称重，按lrag/ml重悬于蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中 干燥成粉末状的卡介苗多糖核酸冻干制品；
(4) 配苗
分别将卡介菌多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0. 6mg/ml，融合蛋白A應用PBS稀释 至1 mg/ml， DDA用注射用水配制成2. 5 mg/ml，在70-85。C水浴中加热10min，取卡介菌多 糖核酸溶液40-60 u 1与等量A讓蛋白充分混匀室温放置lmin，加入80-DDA，然后充 分乳化，最后疫苗呈均一的乳油状。
由上述方法制备的卡介苗多糖核酸——DDA佐剂在结核亚单位疫苗中作佐剂应用，具有 明显增强疫苗诱导细胞免疫为主免疫应答的作用。
卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的试验如下
动物免疫特性观察
1、 实验材料
A画蛋白、Ag85B蛋白、DDA、卡介苗多糖核酸；BCG、生理盐水。
2、 实验动物 C57BL/6小鼠。3、 实验动物分组 共3组，每组3只。
实验组1:(阳性对照组)BCG
实验组2:(佐剂对照组)卡介苗多糖核酸+DDA
实验组3:卡介苗多糖核酸+DDA+A画蛋白
4、 免疫方法
用制备好的疫苗(200W)腹股沟皮下免疫动物，小鼠于适应性喂养一周后0、 14、 28d免 疫三次。卡介苗5X1()6CFU腹股沟皮下免疫动物一次作为阳性对照。最后一次免疫后4w检测 免疫反应。
5、 免疫指标测定
(1) 体液免疫
小鼠免疫4w后取血清用ELISA法检测血清抗体表达水平用Ag85B蛋白(5Pg/ml)包 被96孔板(訓W/wel1) 4"C过夜。用PBST溶液300l4/well洗板5次X5min/次。37。C下， 1%牛血清白蛋白(BSA) 20(￥l/well，封闭lh。从1 : 200开始至1 : 6400，加入对倍稀释的 血清样品，37。C放置1 h。洗板后，加入200W/we11的1 : 20000稀释的免抗鼠IgG、 IgG!、 IgG2a， 37。C放置lh。洗板后，加入lOOW/well TMB或OPD显色液，室温避光反应15分钟显 色后，加入50W/well终止液(2N的H2S04)终止反应；在450nm或490nm检测OD值。
(2) 细胞免疫
无菌分离脾脏，应用ELISPOT技术检测脾细胞受到Ag85B蛋白刺激后IFN-y的表 达:ELISPOT板预先用IFN-y抗体包被过夜，无菌摘除脾脏，研磨后经200目尼龙网过滤，经 淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。加5X1()S淋巴细胞入96孔ELISP0T板中，给予Ag85B蛋白 (5Pg/ml)刺激。共同孵育48小时后，按ELISPOT操作说明依次加入检测抗体等试剂，洗板、 显色，计数斑点数。
试验过程
动物血清样本与脾脏淋巴细胞的制备
1、 小鼠眼球取血致死，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。
2、 分离血清血样室温放置半小时，4。C放置过夜。
3、 在超净台中小新剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定。在剪开小鼠的腹腔，用镊子 取出小鼠的脾脏。注意无菌操作。
4、 35mm培养皿中加入4-5ml淋巴细胞分离液。用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞 轻轻研磨小鼠脾脏，使得分离的单个细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。(每研磨一只小鼠脾脏，时间最好控制在5min之内，以防液体挥发密度与渗透压改变。)
5、 把悬有脾细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖一层大约200W的1640
培养基o
*注意1、每研磨完一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿中转入离心管，注意盖严 管盖，切不可敞口放在超净台中。否则液体挥发会影响分离效果。2、在所有小鼠脾脏处理完
后，统一再加1640培养基。如果加早，两层液体相互扩散，造成最终离心后淋巴细胞层下移。
6、 800g离心30分钟(注意离心设置较慢的加速度和减速度)。离心结束后淋巴细胞会 漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集。
7、 吸出淋巴细胞层，再加入1640培养基，250g离心10分钟。倾倒上清液，加入3-5 毫升PBS重悬，细胞计数。
8、 对获得的小鼠血清和淋巴细胞进行ELISA和ELISAPOT检测。 待测免疫指标
1、 体液免疫IgG、 IgGl、 IgG2a (ELISA法检测)
2、 细胞免疫INF-y、 CD4和CD8T细胞(ELISAPOT、流式细胞仪检测) 测定方法
(一)抗体测定(ELISA)
(1) 实验用试剂的准备
1、 包被液0.05M磷酸盐缓冲液PH: 9.6
Na2C03: 0.318 g NaHC03: 0.586 g 加水200ml， 4。C保存。
2、 洗涤、稀释液PBST
3、 显色液TMB
4、 终止液2M H2S04
浓H2S04 ml加入88. 2ml水中。
(2) 实验步骤 第三天
1、 用Ag85 B蛋白、MPT6419。—198、 Mtb8. 4、 PPD包被96孔板(10(￥l/well) 4。C过夜。 第四天
2、 用PBST溶液30(Wwel1洗板5次X5min/次。
3、 37。C下，1%牛血清白蛋白(BSA) 200W/well，封闭lh。4、 从l : 100开始至1 : 12800，加入对倍稀释的血清样品，37。C放置1 h。
5、 洗板后，分别加入200W/wel1的1 : 20000稀释的IgG、 IgGl和IgG2a， 37。C放置lh。
6、 洗板后，加入100W/wellTMB或OPD显色液，室温避光反应15分钟显色后，加入 5014/well终止液(2N的H2S04)终止反应；在450nm或490nm检测0D值。
(二) INF- Y的测定 (1)实验用试剂的准备
1. RPMI-1640培养基，使用前过滤除菌。
2. 阳性对照用含ConA 5ug/ml的RPMI-1640培养基，过滤除菌。
3. PBS-1: PBS高压灭菌，PH值为7.4左右。
4. 无菌PBS含0. 05% Tween-20 (PBST)。
5. 无菌蒸馏水。
6. 30%、 70%乙醇。 第一天
(1) 预处理板在无菌条件下用70%的乙醇100ul/well，润湿PVDF膜。
(2) 包被板
1. 无菌去离子水加入包被抗体瓶中，混合15秒，室温放置5分钟。
2. 取出50ul，加入5ml的无菌PBS，混匀。其余分装，50ul/瓶，-20°C保存。。
3. 加入包被抗体50ul /well,盖上板盖，4°C过夜。 第二天-
(3) 准备板
1. 取出ELISPOT板，弃掉液体，用无菌PBST洗涤5次。(在超净工作台内进行)
2. 加入200ul/we11无菌的封闭液，37。C 1小时(将10X封闭液2ml混入18mlPBS-I中)。
3. 弃掉液体，不用洗板。 '
4. 加入100ul已准备好的细胞。(初次进行试验，应作刺激物浓度梯度、和/或细胞计 数梯度预试验)。37°C 、 5% C02温箱孵育48h。
※细胞准备见前。
第四天
5)检测
1.加入500ul的无菌去离子水到冻干的生物素标记的抗体瓶中，室温放置5分钟。取出 100 ul加入到10ml的稀释液中，混匀。(其余的抗体，可以分装-2(TC保存)2. 取出ELISP0T板，去除培养细胞。加入冰冻去离子水200ul/孔，将板放置在冰上10 分钟，PBST洗板10次。
3. 加入生物素标记的检测抗体，100ul/孔，4°C过夜。 第五天-
4. PBST洗板5次。加入500ul的无菌去离子水到酶标记物瓶(GABA)中，室温放置5分 钟。取出100ul加入到5ml的稀释液中，混匀。(其余的酶标记物，可以分装-20"C保存)
5. 加入50ul/孔的酶标记的抗生物素抗体，37°C l小时。
6. 洗板5次。(最后一次可以用PBS，避免Tween20对显色剂的影响)。
7. 取出显色剂I和显色剂II, 4。C暗处混合。
8. 加入100ul/孔新鲜配制的显色剂，放置暗处，室温孵育25分钟。
9. 去除显色液，使用去离子水清洗ELISPOT板正反两面。
10. 室温干燥ELISPOT板，使用自动酶联斑点图像分析仪进行分析。 本方法制备的卡介苗多糖核酸的多糖含量、核酸含量、残留蛋白质含量均符合标准，紫
外扫描可见样品在206nm及260nm处均有特异性吸收峰(图1)。杂菌检査阴性，异常毒性实 验阴性。
用该佐剂与结核杆菌融合蛋白AMM配苗免疫小鼠，可以引起较BCG强的体液免疫，所诱 导的血清Ag85B抗体水平有显著的增高。这说明重组AMM亚单位疫苗可以诱导较BCG更高的 体液免疫水平(图2、 3、 4)。细胞免疫反应表明重组AMM亚单位疫苗组和BCG组相比所诱导 的脾细胞IFN- y表达水平有显著的增高，这说明重组A醒亚单位疫苗可以诱导较BCG高的细 胞免疫水平(图5)。
本发明用DDA与卡介菌多糖核酸联合应用作为结核亚单位疫苗的免疫佐剂，可以有效运 输和递呈抗原，诱导.Thl型细胞免疫为主的免疫反应，具有增强蛋白质疫苗免疫效应的功能。
用本方法制备的卡介苗多糖核酸多糖含量、核酸含量、残留蛋白质含量均符合标准，杂 菌检查、异常毒性试验未见异常。
用该佐剂与结核杆菌融合蛋白A顧配苗免疫小鼠，小鼠血清中抗Ag-85B特异性抗体 IgG(H+L)、 IgGl和IgG2a水平明显高于佐剂组和BCG组；应用酶联免疫斑点法(ELISPOT) 检测脾细胞生成INF- y的水平，亚单位疫苗组小鼠脾脏分泌INF— y的淋巴细胞数目明显较 其他两组高。结果表明DDA与卡介菌多糖核酸作为结核亚单位疫苗的免疫佐剂，可以有效运 输和递呈抗原，诱导Tgl型细胞免疫为主的免疫反应。结论卡介菌多糖核酸——DDA可以 作为结构亚单位等疫苗的佐剂，具有明显增强疫苗诱导细胞免疫为主免疫应答的作用。
本发明具有以下有益效果1、 明显增强了疫苗诱导细胞免疫为主的免疫应答作用。
2、 适当增强了疫苗诱导的体液免疫反应。
图1为本发明卡介苗多糖核酸紫外线光谱扫描结果图2为本发明诱导重组的A薩亚单位疫苗组和BCG组中血清Ag85B的特异性抗体IgG(H+L) 水平比较图中每组数据为3只小鼠平均值
图3为本发明诱导重组的AMM亚单位疫苗组和BCG组中血清Ag85B的特异性抗体IgGl 水平的比较图中每组数据为3只小鼠平均值
图4为本发明诱导重组的AMM亚单位疫苗组和BCG组中血清Ag85B的特异性抗体IgG2a 水平的比较图中每组数据为3只小鼠平均值
图5为免疫小鼠脾细胞分泌IFN- Y水平小鼠免疫4周脾脏淋巴细胞(5X105)受Ag85B (5Pg/ml)蛋白刺激分泌表达IFN-Y细 胞数，每组数据为3只小鼠平均值
具体实施例方式
卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备方法为 实施例1
(1) 菌种传代与培养
将保存于2"的冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上每传一次为一代，共培育3代；
(2) 菌体收集
收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在5t:下，以6000r/min离心30min，弃上清， 将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎4h;
(3) 提取
菌液与3倍体积45%苯酚醋酸钠混匀，在7(TC水浴中保持50rain，然后移入4'C的冰浴， 将菌液无菌转移至离心管，在5'C下6000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清，重复以上操 作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；
预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析15小时，随后用 蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇， 以1 : 10体积比例加入生理盐水，转至离心管中6000r/min离心15min，分别以乙醇、乙醚混匀洗涤三次，在5。C下，以12000r/min离心30min，收集沉淀并称重，按lrag/ml重悬于 蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的精制品； (4)配苗
分别将卡介菌多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0. 6mg/ml，融合蛋白AMM用PBS稀释 至lmg/ml， DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml，在85'C水浴中加热10min，取卡介菌多糖核 酸溶液50 y 1与等量A顧蛋白充分混匀室温放置lmin，加入10(H4 DDA然后充分乳化，最后 疫苗呈均一的乳油状。
实施例2
(1) 菌种传代与培养
将保存于8t:的卡介菌冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上每传一次为一代，共培育4
代；
(2) 菌体收集
收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在3。C下，以6000r/min离心30min，弃上清， 将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎2h;
(3) 提取
菌液与1. 5倍体积45%苯酚醋酸钠混匀，在65t:水浴中保持40min，然后移入4'C的冰 浴，将菌液无菌转移至离心管，在3'C下6000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清，重复以 上操作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；
预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析10小时，随后用 蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇， 以1 : IO体积比例加入生理盐水，转至离心管中6000r/min离心15min，分别以乙醇、乙醚 混匀洗涤三次，在3。C下，以12000r/min离心30min，收集沉淀并称重，按lmg/ml重悬于 蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的精制品； U)配苗
分别将卡介菌多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0. 6mg/ml，融合蛋白A丽用PBS稀释 至lmg/ml， DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml，在70。C水浴中加热10min，取卡介菌多糖核 酸溶液40 u 1与等量A画蛋白充分混匀室温放置lmin,加入DDA然后充分乳化，最后 疫苗呈均一的乳油状。
实施例3 (1)菌种传代与培养
将保存于5'C的卡介菌冻千菌种取出复溶，在苏通培养基上每传一次为一代，共培育12代；
(2) 菌体收集
收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在4。C下，以6000r/min离心30rain，弃上清， 将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎3h;
(3) 提取
菌液与2倍体积45%苯酚醋酸钠混匀，在68'C水浴中保持30min，然后移入4'C的冰浴， 将菌液无菌转移至离心管，在4。C下6000r/min离心30min，弃沉淀，收集上清，重复以上操 作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；
预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析12小时，随后用 蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇， 以1 : IO体积比例加入生理盐水，转至离心管中6000r/min离心15min，分别以乙醇、乙醚 混匀洗涤三次，在4。C下，以12000r/min离心30rain，收集沉淀并称重，按lmg/ml重悬于 蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的精制品；
(4) 配苗
分别将卡介菌多糖核酸冻干制^用生理盐水溶解至0. 6mg/ml，融合蛋白A匪用PBS稀释 至lmg/ml， DDA用注射用水配制成2.5 mg/ml，在80。C水浴中加热10min，取卡介菌多糖核 酸溶液60u 1与等量A醒蛋白充分混匀室温放置lmin，加入8(￥1 DDA然后充分乳化，最后 疫苗呈均一的乳油状。
上述各实施例制备的卡介苗多糖核酸——DDA佐剂在结核亚单位疫苗中作佐剂应用。
权利要求
1、卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备及其应用，其特征为卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备方法为(1)菌种传代与培养将保存于2-8℃的卡介苗冻干菌种取出复溶，在苏通培养基上共培育3-12代；(2)菌体收集收集培养基表面的菌膜，注入离心管。在3-5℃离心，弃上清，将沉淀的菌体用蒸馏水配成混悬液，用比浊法确定菌液浓度，细菌在冰浴中破碎2-4h；(3)提取菌液与1. 5-3倍体积45％苯酚醋酸钠混匀，在65—70℃水浴中保持30—50min，然后移入3-5℃的冰浴，将菌液无菌转移至离心管，在3-5℃下离心，弃沉淀，收集上清，重复以上操作直至水相与酚相交界面无蛋白沉淀；预处理透析袋，将上清液装于透析袋中，在大体积的烧杯中流水透析10-15小时，随后用蒸馏水透析72小时，将透析袋中的液体全部转移至烧杯中，加入两倍体积的冰冷无水乙醇，以1∶10体积比例加入生理盐水，转至离心管中离心，分别以乙醇、乙醚混匀洗涤三次，在3-5℃下离心，收集沉淀并称重，按1mg/ml重悬于蒸馏水，分装入安瓿中，放冷冻干燥器中干燥成粉末状的卡介苗多糖核酸冻干制品。(4)配苗分别将卡介苗多糖核酸冻干制品用生理盐水溶解至0.6mg/ml，融合蛋白AMM用PBS稀释至1mg/ml；DDA用注射用水配制成2.5mg/ml，在70-85℃水浴中加热10min，取卡介苗多糖核酸溶液40-60μl与等量AMM蛋白充分混匀室温放置1min，加入80-120μl DDA然后充分乳化，最后疫苗呈均一的乳油状。
2、 根据权利要求1所述的卡介苗多糖核酸——DM佐剂的制备及其应用，其特征为在结 核亚单位疫苗中作佐剂应用。
全文摘要
本发明为卡介苗多糖核酸——DDA佐剂的制备及其应用，涉及生物工程，尤其是结核亚单位疫苗的免疫佐剂，目前唯一使用的结核病疫苗是BCG，但是BCG在不同地区、不同人群中的保护效率差异很大，以细胞免疫为主的结核亚单位疫苗要解决的主要问题是寻找有效的佐剂以及传递方式。本发明将卡介苗多糖核酸和二甲基三十六烷基铵即DDA联合制备新型佐剂，经过卡介苗菌种传代与培养、菌体收集、热酚法提取卡介苗多糖核酸，并将其与DDA联合应用作为融合蛋白AMM的佐剂构建结核亚单位疫苗，经小鼠免疫实验结果表明，本发明能有效运输和递呈抗原，诱导Thl型细胞免疫为主的免疫反应，具有增强蛋白疫苗免疫效应的有益效果。
文档编号C12P19/34GK101417128SQ20071016344
公开日2009年4月29日 申请日期2007年10月25日 优先权日2007年10月25日
发明者于红娟, 付林峰, 宋楠楠, 王洪海, 王秉翔, 祝秉东, 裴明玉, 郄亚卿, 彧 雒, 韩少波, 马维民 申请人:兰州大学