专利名称：胰腺内分泌和腺泡肿瘤中的微小rna表达异常的制作方法
发明人:Carlo M.Croce和George A.Calin
政府资助
本发明全部或部分由来自国立癌症研究所的项目基金P01CA76259和P01CA81534资助。政府具有本发明的某些权利。
背景技术：
根据癌症在胰腺中发现的位置或根据癌症起源的细胞类型，可以对胰腺癌分类。胰腺癌可以发生在胰腺的头、体或尾部，症状可以随肿瘤在胰腺中的位置而变化。70-80％的胰腺癌发生在胰腺头部。大多数胰腺癌是外分泌类型，超过90％的这些外分泌胰腺癌是腺癌。它们几乎全都是导管腺癌，其中所述癌症发生在衬在胰腺导管内的细胞中。另外，存在更罕见类型的外分泌胰腺癌，例如囊性肿瘤、腺泡细胞癌和肉瘤。囊性肿瘤是在胰腺造成囊肿或填充液体的液囊的肿瘤。肉瘤(一种将胰腺细胞保持在一起的结缔组织的癌)是罕见的，最常见于儿童。
除了外分泌癌以外，胰腺的内分泌癌也会发生。内分泌癌可以参照它们产生的激素来命名，例如，胃泌素瘤(它们产生胃泌素)，胰岛素瘤(它们产生胰岛素)，生长抑素瘤(它们产生生长抑素)，舒血管肠肽瘤(它们产生VIP)和胰高血糖素瘤(它们产生胰高血糖素)。另外，可以发生胰腺淋巴瘤，尽管它们是罕见的。
胰腺内分泌肿瘤(PET)可以偶发地或作为1型多发性内分泌瘤病(MEN1)综合征的一部分而发生(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.ScL 1014:13-27(2004))。根据由于激素分泌过多造成的症状是否存在，这些肿瘤在临床上分为功能性的(F-PET)或无功能的(NF-PET)。F-PET主要由胰岛素瘤代表。在诊断时，在仅10％的胰岛素瘤、但是在高达60％的NF-PET中观察到转移性疾病，且大多数PET-相关的死亡由肝转移造成(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-21(2004))。PET之间的恶性潜力差别巨大，不能在组织学形态的基础上预测。实际上，绝大多数的PET是分化良好的内分泌肿瘤(WDET)，仅在鉴别出侵入或转移时被定义为分化良好的内分泌癌(WDEC)(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-27(2004))。
胰腺腺泡细胞癌(PACC)是一种非常罕见的不同于导管腺癌和PET的肿瘤类型，尽管通过在三分之一病例中神经内分泌标记的表达和混合的腺泡-内分泌癌的存在，观察到与PET的一些重叠(Ohike，N.等人，Virchows Arch.445:231-35(2004))。PACC总是恶性的，生存中值是18个月，这位于胰腺导管腺癌和内分泌肿瘤(分别是6个月和40个月)之间(Holen，K.D.等人，J.Clin.Oncol.20:4673-78(2002))。
关于PET的分子发病机理知之甚少(Kloppel，G.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:13-27(2004))。MEN1基因的灭活是在散发的PET中鉴别出的最常见的遗传事件，而通常参与胰腺腺癌的基因中的突变不常见(Perren，A.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:199-208(2004))。关于PACC的分子异常知之更少(Abraham，S.C.等人，Am.J.Pathol.160:953-62(2002))。关于PACC没有可得到的基因表达谱数据，我们对发生在PET中的基因表达变化的理解仍然是在起始阶段(Hansel，D.E.等人，Clin.Cancer Res.70:6152-58(2004))。
微小RNA是小的(20-24个核苷酸)非编码RNA基因产物，其在许多生物学过程(例如细胞增殖，细胞凋亡和发育定时)中起关键作用。为了实现这些功能，微小RNA会负面调节它们的靶mRNA的稳定性和/或翻译效率(Ambros，V.，Nature 437:350-55(2004))。目前，已知313个独特的成熟的人微小RNA，已经在人类中实验验证了其中的223个(www.microrna.sanger.ac.uk)。近年来的研究表明，特定miRNA的异常表达可涉及人的疾病，例如神经障碍(Ishizuka，A.，等人，GenesDev.16:2497-2508(2002))和癌症。具体地，已在人慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中发现miR-16-1和/或miR-15a的不当表达(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:15524-15529(2002))。已经将微小RNA的异常表达与癌症相联系，基于它们的微小RNA谱，可以区分特定癌症类型的诊断/预后特征(Caldas，C和J.D.Brenton，Nature Med 17:712-14(2005)；Croce，CM.，和G.A.Calin，Cell122:6-7(2005))。功能研究也已经将异常微小RNA表达与致癌作用相联系(Chan，J.A.等人，Cancer Res.65:6029-33(2005)；Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.33:1290-97(2005)；He，L.等人，Nature435:828-33(2005)；和Johnson，S.M.等人，Cell 720:635-47(2005))。
包含所有已知的人微小RNA的微阵列的发展和应用，已允许同时分析样品中的每一种miRNA的表达(Liu，C.G.，等人，Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.101:9740-9744(2004))。这些微小RNA微阵列不仅已用于确认miR-16-1在人CLL细胞中失调，而且还用于产生与明确定义的人CLL的临床病理特征关联的miRNA表达特征谱(Calin，G.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:1175-11760(2004))。
对在胰腺癌细胞中差异表达的微小RNA的鉴别，可以辅助指出参与胰腺癌(例如，胰腺内分泌肿瘤，腺泡癌)的特定miRNA。此外，对这些miRNA的假定的靶的鉴定可帮助阐明它们的致病作用。本发明提供了用于胰腺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。
发明概述 本发明部分地基于对与胰腺癌细胞中改变的表达水平有关的特定miRNA的鉴别。
因此，本发明包括诊断受试者是否患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中的方法。根据本发明的方法，将受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着受试者患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中。
在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103，miR-107和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其组合。
在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-155。
在一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103，miR-107，miR-155和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-103，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-107，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-155，与对照样品相比，它在测试样品中被减量调节。在一个具体的实施方案中，所有这3种miR(miR-103，miR-107和miR-155)与对照样品中的相应miR相对比。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺内分泌肿瘤(PET)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在一个具体的实施方案中，诊断的胰腺癌选自:腺泡细胞癌(PACG)和胰岛素瘤。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)，胰腺腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。在另一个实施方案中，所述诊断方法可以用于诊断任意类型的胰腺癌。
在一个实施方案中，本发明是诊断受试者是否患有胰腺腺泡细胞癌(PACC)或处于发生胰腺腺泡细胞癌(PACC)的风险中的方法。在该方法中，将受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着受试者患有PACC或处于发生PACC的风险中。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其组合。
在一个实施方案中，本发明是诊断受试者患有的胰腺癌的类型的方法。在该方法中，将受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示胰腺癌的类型。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰腺内分泌肿瘤(PET)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰腺腺泡细胞癌(PACC)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:分化良好的内分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且所述至少一种miR基因产物是miR-148a。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:胰岛素瘤和无功能的胰腺内分泌肿瘤(NF-PET)。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰岛素瘤，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-204，miR-203，miR-211和其组合。
在一个实施方案中，本发明是确定患胰腺癌的受试者的预后的方法。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中与胰腺癌的不良预后有关的至少一种miR基因产物的水平。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着不良预后。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，测量的至少一种miR基因产物是miR-21。在另一个实施方案中，所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。
在一个实施方案中，本发明是确定受试者的胰腺癌是否是转移性的方法。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着转移。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-21。
在一个实施方案中，本发明是确定受试者的胰腺癌是否具有高增殖指数的方法。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着高增殖指数。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-21。
在一个实施方案中，本发明是确定患胰腺癌的受试者的预后的方法。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中PDCD4的水平。相对于对照样品中PDCD4的水平，测试样品中PDCD4的水平的改变(例如增加、降低)指示着不良预后。在一个实施方案中，测试样品中PDCD4的水平小于对照样品中PDCD4的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。
使用本领域技术人员众所周知的众多技术(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测)，可以测量至少一种miR基因产物的水平。在一个具体的实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平:从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸(例如，包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中。在一个实施方案中，与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号增量调节。在另一个实施方案中，与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号减量调节。在一个具体的实施方案中，所述微阵列包含针对所有已知的人miRNA的实质部分的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述微阵列包含针对一种或多种选自下述的miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
本发明也提供了诊断受试者是否患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中的方法。在该方法中，通过从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，测量与胰腺癌的不良预后有关的至少一种miR基因产物的水平。然后使靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸(例如，包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交，以提供测试样品的杂交谱，将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相对比。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。在一个实施方案中，miR-21信号的变化指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。
本发明也包括治疗受试者胰腺癌的方法，其中受试者癌细胞中的至少一种miR基因产物失调(例如，减量调节，增量调节)。当至少一种分离的miR基因产物在胰腺癌细胞中减量调节时，该方法包括，施用有效量的分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。在一个实施方案中，施用给受试者的至少一种分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合(或一种或多种这些miR的分离的变体或生物活性片段)。当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。在一个实施方案中，用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物会抑制选自下述的miR基因产物:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
在一个有关的实施方案中，治疗受试者的胰腺癌的方法另外包括下述步骤:首先测定受试者胰腺癌细胞中至少一种miR基因产物的量，和对比该miR基因产物的水平与对照细胞中相应的miR基因产物的水平。如果胰腺癌细胞中所述miR基因产物的表达失调(例如，减量调节，增量调节)，该方法另外包括，改变胰腺癌细胞中表达的所述至少一种miR基因产物的量。在一个实施方案中，在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量小于在对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，并将有效量的所述miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段施用给受试者。在另一个实施方案中，在癌细胞中表达的所述miR基因产物的量大于在对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，并将有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因的表达的化合物施用给受试者。合适的miR和抑制miR基因的表达的化合物包括，例如，本文所述的那些。
本发明另外提供了用于治疗胰腺癌的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，所述至少一种miR基因产物对应于在胰腺癌细胞中具有比合适的对照细胞降低的表达水平的miR基因产物(即，减量调节)。在一个特定实施方案中，所述分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
在另一个实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抑制miR表达的化合物和药学上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对在胰腺癌细胞中的表达大于对照细胞(即，增量调节)的miR基因产物是特异性的。在某些实施方案中，所述抑制miR表达的化合物对一种或多种选自下述的miR基因产物是特异性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
本发明也包括鉴定抗胰腺癌剂的方法，其包括，给细胞提供测试试剂，并测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，细胞中所述miR基因产物的水平的增加，指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。在一个具体的实施方案中，与胰腺癌细胞中降低的表达水平有关的所述至少一种miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
在其它实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，所述细胞中与胰腺癌中增加的表达水平有关的miR基因产物的水平的降低，指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。在一个具体的实施方案中，与胰腺癌细胞中增加的表达水平有关的所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
附图简述 本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。含有彩色附图的本专利或专利申请公开的拷贝将在提出请求并支付必要的费用后由官方提供。
图1A描述了12个正常胰腺(正常)和44个胰腺肿瘤的miRNA表达非监督分级聚类图，所述胰腺肿瘤包括22个分化良好的胰腺内分泌肿瘤(WDET)，18个分化良好的胰腺内分泌癌(WDEC)和4个胰腺腺泡细胞癌(ACC)(在顶部列出)。WDET样品包括11个胰岛素瘤(INS)和1个无功能的PET(NF)；WDEC样品包括1个INS和17个NF-PET。应用中值抛光算法，并选择具有更高四分位数间距的前200个探针(其含有成熟的微小RNA序列)，使用由此得到的重复点的累计值进行分析。值得注意地，PACC样品落入一个独特的簇中，该簇是包括所有PET的更宽簇的一部分，尽管胰岛素瘤和NF-PET之间没有特征性谱。如所示的，共同的微小RNA表达模式将胰腺内分泌和腺泡肿瘤与正常胰腺区分开。
图1B描述了与正常组织相比发现在PET中增量调节的特定微小RNA(增量调节的微小RNA以红色显示)。
图1C描述了与正常组织相比发现在PET中增量调节的特定微小RNA(增量调节的微小RNA以红色显示)。
图1D描述了与无功能的PET相比在胰岛素瘤中增量调节的2种微小RNA(增量调节的微小RNA以蓝色显示)。
图1E描述了与正常组织相比发现在PET中减量调节的特定微小RNA(减量调节的微小RNA以绿色显示)。
图2A描述的方框和细线图显示了miR-103和miR-155的表达水平，它们通过对12个正常胰腺(正常)和44个胰腺肿瘤的微阵列分析来测量，所述胰腺肿瘤包括22个分化良好的胰腺内分泌肿瘤(WDET)，18个分化良好的胰腺内分泌癌(WDEC)和4个胰腺腺泡细胞癌(ACC)。用粗线突出中值强度。如所示的，miR-103的过表达和miR-155的表达缺失对于胰腺胰岛和腺泡肿瘤是特殊的。
图2B描述了RNA印迹分析，它与图2A所示的微阵列表达数据平行。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图3A描述的方框和细线图显示了miR-204的表达水平，它通过对12个正常胰腺(正常)、12个胰岛素瘤、28个无功能的胰腺内分泌肿瘤(NF-PET)和4个胰腺腺泡细胞癌(ACC)的微阵列分析来测量。用粗线突出中值强度。
图3B的图显示了通过免疫组织化学(IHC)评价的miR-204表达和胰岛素染色之间的强关联性。
图3C描述了RNA印迹分析，它证实了微阵列表达数据，并表明miR-204过表达是胰岛素瘤特异性的。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图4A描述的方框和细线图显示了有(转移+)或没有(转移-)肝转移的胰腺内分泌肿瘤之间miR-21的不同表达水平，这通过微阵列分析来测量。如所示的，miR-21的表达与肝转移的存在强烈相关。
图4B描述的方框和细线图显示了，如通过Ki67免疫组织化学测量的增殖指数>2％(高)或≤2％(低)的肿瘤之间miR-21的不同表达水平，这通过微阵列分析来测量。如所示的，miR-21的表达与肿瘤增殖指数强烈相关。
图4C描述了RNA印迹分析，它证实了微阵列表达数据。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图5的图显示了正常胰腺(*)、转移性(▲)和非转移性(Δ)PET中miR-21和PDCD4 mRNA的表达。稳健的局部加权的回归函数已经用于拟合数据点之间的线。如所示的，miR-21的表达和它的推定mRNA靶PDCD4之间存在负相关。
图6A描述的RNA印迹分析显示了所有测试的胰腺胰岛素瘤和无功能的内分泌肿瘤(NF-PET)中miR-26b和miR-107的过表达。这些结果验证了对于过表达的微小RNA的微阵列数据。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图6B描述的RNA印迹分析显示了所有测试的胰腺胰岛素瘤和无功能的内分泌肿瘤(NF-PET)中miR-23a和miR-342的过表达。这些结果验证了对于过表达的微小RNA的微阵列数据。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图6C描述的RNA印迹分析显示了8个分化良好的内分泌肿瘤(WDET)中的4个、所有4个分化良好的内分泌癌(WDEC)和1个腺泡细胞癌(ACC)中的miR-192过表达。这些结果验证了对于过表达的微小RNA的微阵列数据。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图7A描述的RNA印迹分析表明，miR-375是胰腺-特异性的miR。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。
图7B描述的RNA印迹分析表明，miR-375的表达是胰腺内分泌和腺泡肿瘤的特征，无论存在(胰岛素瘤)或不存在(NF-PET)临床上明显的胰岛素分泌过多。NF-PET，无功能的胰腺内分泌肿瘤。5SrRNA(5S-RNA)用作加样对照。如所示的，miR-375表达在胰腺胰岛和腺泡肿瘤中是共有的。
图7C描述的RNA印迹分析表明，miR-375的表达是胰腺内分泌和腺泡肿瘤的特征，无论存在(胰岛素瘤)或不存在(NF-PET和ACC)临床上明显的胰岛素分泌过多。NF-PET，无功能的胰腺内分泌肿瘤；ACC，胰腺腺泡细胞癌。5S rRNA(5S-RNA)用作加样对照。如所示的，miR-375表达在胰腺胰岛和腺泡肿瘤中是共有的。
发明详述 本发明部分地基于胰腺癌细胞中相对于正常对照细胞具有改变的表达的特定miRNA的鉴别，并基于这些微小RNA与特定诊断、预后和治疗特征的关联。如本文所述的: i)微小RNA表达的共同谱会区分胰腺肿瘤类型和正常胰腺，从而暗示特定微小RNA在胰腺肿瘤发生中的参与； ii)伴随miR-155表达缺失的miR-103和miR-107的表达，会区别胰腺肿瘤和正常胰腺； iii)至少10种微小RNA会区分内分泌肿瘤和腺泡肿瘤，并暗示在内分泌分化和/或内分泌肿瘤发生中的特定微小RNA； iv)miR-204主要在胰岛素瘤中表达，并与胰岛素的免疫组织化学表达相关联；和 v)miR-21的过表达与高Ki67增殖指数和肝转移的存在强烈相关。
这些结果暗示，微小RNA表达的改变与内分泌和腺泡致瘤性转化和恶性进展相关。因此，特定微小RNA的表达，以及这样的微小RNA表达的改变，可以用于本文所述的诊断、预后和治疗方法中。
如本文中互换使用的，＂miR基因产物＂＂微小RNA＂＂miR＂或＂miRNA＂是指来自miR基因的未加工的或加工过的RNA转录物。由于miR基因产物不翻译成蛋白，术语＂miR基因产物＂不包括蛋白。未加工的miR基因转录物也称作＂miR前体＂，通常包含长度为约70-100个核苷酸的RNA转录物。miR前体可以用RNA酶(例如，Dicer，Argonaut，RNA酶III(例如，大肠杆菌RNA酶III))消化加工成有活性的19-25个核苷酸的RNA分子。该有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也称作＂加工过的＂miR基因产物或＂成熟的＂miRNA。
所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子可以通过天然加工途径(例如，使用完整细胞或细胞裂解物)或通过合成加工途径(例如，使用分离的加工酶，例如分离的Dicer，Argonaut，或RNA酶III)从miR前体得到。应当理解，所述有活性的19-25个核苷酸的RNA分子也可以通过生物或化学合成直接生成，不必从miR前体加工。当在本文中用名称提及微小RNA时，该名称对应着前体和成熟形式两者，除非另有说明。
本发明包括诊断受试者是否患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中的方法，其包括测量受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平，和对比测试样品中所述miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平。如本文使用的，＂受试者＂可以是患有胰腺癌或被怀疑患有胰腺癌的任意哺乳动物。在一个优选的实施方案中，所述受试者是患有胰腺癌或被怀疑患有胰腺癌的人。
胰腺癌可以是任意形式的胰腺癌，例如，不同组织学的胰腺癌(例如，外分泌肿瘤，内分泌肿瘤，癌，淋巴瘤)。在一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺内分泌肿瘤(PET)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在一个具体的实施方案中，诊断的胰腺癌选自:腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)，胰腺腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。此外，如本文所述的，胰腺癌可以伴随特定预后(例如，低生存率，快速进展)。
表1a和1b描述了特定的前体和成熟人微小RNA的核苷酸序列。
表1a-人微小RNA前体序列。
*前体序列中加下划线的序列对应着成熟的加工过的miR转录物(参见表1b)。有些前体序列具有2个加下划线的序列，它们表示源自相同前体的2种不同的成熟miR。所有序列都是人的。
表1b-人成熟微小RNA序列。
可以在从受试者得到的生物样品的细胞中测量至少一种miR基因产物的水平。例如，通过常规活组织检查技术，可以从被怀疑患有胰腺癌的受试者取出组织样品。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，通过标准技术可以分离白细胞，用于DNA提取。血液或组织样品优选地在开始放疗、化疗或其它治疗性处理之前从受试者得到。对应的对照组织或血液样品或对照参照样品，可以从该受试者未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体、或从与受试者样品中大多数细胞相对应的培养细胞得到。然后与来自受试者的样品一起，加工处理对照组织或血液样品，从而可以将来自受试者样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应miR基因产物水平相对比。或者，可以与测试样品分开地(例如，在不同时间)得到并加工参照样品，并可将来自测试样品的细胞中从给定miR基因产生的miR基因产物的水平与来自参照样品的相应miR基因产物水平相对比。
在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被＂增量调节＂)。如本文使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中miR基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，miR基因产物的表达被＂增量调节＂。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平(即，miR基因产物的表达被＂减量调节＂)。如本文使用的，当从来自受试者的细胞或组织样品中的基因产生的miR基因产物的量小于从对照细胞或组织样品中相同基因产生的量时，miR基因的表达被＂减量调节＂。相对于一种或多种RNA表达标准，可以测定对照和正常样品中的相对miR基因表达。所述标准可包含，例如，零miR基因表达水平，标准细胞系中的miR基因表达水平，受试者的未受影响的组织中的miR基因表达水平，或以前对正常人对照群体得到的miR基因表达的平均水平。
与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，从受试者得到的样品中miR基因产物的水平的改变(即，增加或降低)，指示着在受试者中存在胰腺癌。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。本文描述了在胰腺癌中具有比正常胰腺组织更高的表达水平的miR基因产物(参见，例如，实施例)。在一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-103，miR-107和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其组合。
在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。本文描述了在胰腺癌中具有比正常胰腺组织更低的表达水平的miR基因产物(参见，例如，实施例)。在一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-155。
在一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物选自miR-103，miR-107，miR-155和其组合。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-103，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-107，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节。在另一个实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-155，与对照样品相比，它在测试样品中被减量调节。在一个具体的实施方案中，所有这3种miR(miR-103，miR-107和miR-155)与对照样品中的相应miR相对比。如本文所述和例示的，miR-103和miR-107的表达，与miR-155表达的缺失相结合，会将胰腺肿瘤与正常胰腺区分开。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺内分泌肿瘤(PET)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌是胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺外分泌肿瘤(例如，腺癌)。在一个具体的实施方案中，诊断的胰腺癌选自:腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。在另一个实施方案中，诊断的胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)，胰腺腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。在另一个实施方案中，所述诊断方法可以用于诊断任意类型的胰腺癌。
在一个实施方案中，本发明是诊断受试者是否患有胰腺腺泡细胞癌(PACC)或处于发生该癌的风险中的方法。在该方法中，将受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着受试者患有PACC或处于发生PACC的风险中。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，增量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，减量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其组合。
在一个实施方案中，本发明是诊断受试者患有的胰腺癌的类型的方法。在该方法中，将受试者测试样品中的至少一种miR基因产物的水平与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比较。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示胰腺癌的类型。
在一个具体的实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰腺内分泌肿瘤(PET)，且增量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰腺腺泡细胞癌(PACC)，且减量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，iniR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。如本文所述的，特定miR基因产物的表达可以区分PET和PACC(参见，例如，实施例)。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:分化良好的内分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且增量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其组合。在另一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且减量调节的所述至少一种miR基因产物是miR-148a。如本文所述的，特定miR基因产物的表达可以区分WDEC和PACC(参见，例如，实施例)。
在一个实施方案中，诊断的胰腺癌的类型选自:胰岛素瘤和无功能的胰腺内分泌肿瘤(NF-PET)。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌的类型是胰岛素瘤，增量调节的所述至少一种miR基因产物选自:miR-204，miR-203，miR-211和其组合。如本文所述的，特定miR基因产物的表达可以区分WDEC和PACC(参见，例如，实施例)。
本发明也提供了确定患胰腺癌的受试者的预后的方法。在该方法中，测量来自受试者的测试样品中的至少一种miR基因产物的水平，其与胰腺癌中的特定预后(例如，良好的或积极的预后，差的或不良的预后)有关。与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述miR基因产物的水平的改变(例如，增加，减少)，指示着受试者患有具有特定预后的胰腺癌。在一个实施方案中，所述miR基因产物与不良(即，差)预后有关。不良预后的实例包括、但不限于，低生存率和快速疾病进展。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，测量的增量调节的至少一种miR基因产物是miR-21。在另一个实施方案中，所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。如本文所述的，特定miR基因产物的表达，其与胰腺癌的不良预后有关，可以预测受试者胰腺癌的严重性(参见，例如，实施例)。在某些实施方案中，如下测量所述至少一种miR基因产物的水平:从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。
在一个实施方案中，本发明是测定受试者的胰腺癌是否是转移性的方法。如本文所述的，大多数PET-有关的死亡由肝转移造成。因而，对转移性胰腺癌的鉴别，可以辅助确定适宜的治疗选择。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着转移。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，增量调节的所述至少一种miR基因产物是miR-21。
在一个实施方案中，本发明是确定受试者的胰腺癌是否具有高增殖指数的方法。如已知的，具有高增殖指数的胰腺癌具有不良预后，因此，对具有高增殖指数的胰腺癌的鉴别，也可以辅助确定适宜的治疗选择。在该方法中，测定受试者测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平。与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变(例如增加、降低)指示着高增殖指数。在一个实施方案中，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，增量调节的所述至少一种miR基因产物是miR-21。
对特定miR基因产物(例如，与对照样品相比，表现出增量调节或减量调节的表达的那些miR基因产物)的靶物的鉴别，可以辅助阐明微小RNA的作用机理。如本文所例示的，鉴别出了选择的微小RNA(即miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21)的特定推定靶物。分析揭示了胰腺癌样品中特定微小RNA的许多增量调节的(28个靶基因)和减量调节的(7个靶基因)靶基因。如表10所述，在胰腺癌样品中鉴别出了miR-103/miR-107的28个增量调节的靶基因和7个减量调节的靶基因(实施例和表10)。另外，在胰腺癌样品中鉴别出了miR-103/miR-107的2个增量调节的靶基因和2个减量调节的靶基因，以及miR-21的1个增量调节的靶基因和1个减量调节的靶基因(实施例和表10)。因而，在一个实施方案中，特定微小RNA的靶基因(例如，在表10中列出的那些)的表达，可以用于诊断癌症(例如，胰腺癌)。本领域技术人员使用已知的方法和/或本文所述的测量微小RNA的表达水平的方法(例如，定量或半-定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测，微阵列分析)，不经不适当的实验，可以测量任意的这些靶基因的表达水平。在一个实施方案中，测量的靶基因是程序性细胞死亡4(PDCD4)。
在一个实施方案中，本发明是确定患胰腺癌的受试者的预后的方法。在该方法中，测量来自受试者的测试样品(例如，胰腺癌样品)中的PDCD4的水平。与对照样品中PDCD4的水平相比，测试样品中PDCD4的水平的改变(例如，增加，减少)指示着不良预后。在一个实施方案中，测试样品中PDCD4的水平小于对照样品中PDCD4的水平。在另一个实施方案中，所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。
使用本领域技术人员众所周知的众多技术(例如，定量或半定量RT-PCR，RNA印迹分析，溶液杂交检测)，可以测量所述至少一种miR基因产物的水平。在一个具体的实施方案中，如下测量至少一种miR基因产物的水平:从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸(例如，包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交，以提供测试样品的杂交谱，并对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中。在一个实施方案中，至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号增量调节。在另一个实施方案中，至少一种miRNA的信号相对于从对照样品产生的信号减量调节。在一个具体的实施方案中，所述微阵列包含针对所有已知的人miRNA的实质部分的miRNA-特异性探针寡核苷酸。在另一个实施方案中，所述微阵列包含针对一种或多种选自下述的miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
可以从由已知的miRNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备微阵列。微阵列可包含对于每种miRNA的两种不同的寡核苷酸探针，一种包含活性的成熟序列，另一种对于该miRNA的前体是特异性的。微阵列还可以包含对照，例如一个或多个与人直系同源物相异仅少数碱基的小鼠序列，该序列可用作杂交严格性条件的对照。还可将来自两个物种的tRNA和其它RNA(例如，rRNA，mRNA)印在微芯片上，为特异性杂交提供内部的、相对稳定的阳性对照。还可在微芯片上包含非特异性杂交的一个或多个合适的对照。为此，基于与任何已知的miRNA不存在任何同源性来选择序列。
可使用本领域内已知的技术制造微阵列。例如，在位置C6上对合适长度例如40个核苷酸的探针寡核苷酸进行5’-胺修饰，然后使用可商购获得的微阵列系统例如GeneMachine OmniGridTM 100Microarrayer和Amersham CodeLinkTM活化载玻片进行印制。通过用标记的引物逆转录靶RNA来制备相应于靶RNA的标记的cDNA寡物。在第一链合成后，使RNA/DNA杂交体变性以降解RNA模板。然后将所制备的标记的靶cDNA在杂交条件下与微阵列芯片杂交，所述条件是例如在25℃下在6X SSPE/30％甲酰胺中进行18小时，然后在37℃下在0.75XTNT中洗涤40分钟。杂交在阵列上在固定的探针DNA识别样品中的互补靶cDNA的位置上发生。标记的靶cDNA标记了阵列上发生结合的确切位置，从而允许自动检测和定量。输出由一列杂交事件组成，其显示了特定cDNA序列的相对丰度，从而显示患者样品中相应的互补miR的相对丰度。根据一个实施方案，标记的cDNA寡物是从生物素标记的引物制备的生物素标记的cDNA。然后通过使用例如链霉抗生物素-Alexa647缀合物直接检测含生物素的转录物来处理微阵列和使用常规的扫描方法扫描微阵列。阵列上各点的图像强度与患者样品中相应的miR的丰度成比例。
阵列的使用对于miRNA表达检测具有几个有利方面。第一，可在一个时间点在相同的样品中鉴定数百个基因的整体表达。第二，通过对寡核苷酸探针的仔细设计，可鉴定成熟和前体分子的表达。第三，与RNA印迹分析相比，芯片需要少量的RNA，并且使用2.5μg的总RNA可提供可重复的结果。相对有限数量的miRNA(每个物种数百个)允许构建几个物种的共同微阵列，对于各物种具有不同的寡核苷酸探针。该工具允许对多种不同条件下各已知miR的跨物种表达进行分析。
除了用于特定miR的定量表达水平测定外，包含相应于相当大部分的miRNome(优选整个miRNome)的miRNA特异性探针寡核苷酸的微芯片可用于确定miR基因表达谱，从而进行miR表达模式的分析。不同的miR特征谱可与已建立的疾病标记或直接与疾病状态相关联。
根据本文描述的表达谱确定分析法，定量逆转录来自获自怀疑患有癌症(例如，胰腺癌)的受试者的样品的总RNA，以提供一组与样品中的RNA互补的标记的靶寡脱氧核苷酸。然后使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，从而提供样品的杂交谱。结果是展示样品中miRNA的表达模式的样品的杂交谱。杂交谱包含来自样品的靶寡脱氧核苷酸与微阵列中的miRNA特异性探针寡核苷酸结合产生的信号。该谱可记录为结合的存在或不存在(信号相对于零信号)。更优选，记录的谱包括来自各杂交的信号的强度。将谱与从正常例如非癌性的对照样品产生的杂交谱进行比较。信号的改变指示着受试者中存在癌症或发生癌症的倾向。
用于测量miR基因表达的其它技术也在本领域技术人员的技能范围之内，并且包括用于测量RNA转录和降解的速率的各种技术。
本发明也提供了诊断受试者是否患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中的方法。在该方法中，通过从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸，测量与胰腺癌的不良预后有关的至少一种miR基因产物的水平。然后将所述靶寡脱氧核苷酸与一种或多种miRNA-特异性探针寡核苷酸(例如，包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列)杂交，以提供测试样品的杂交谱，并将测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱相对比。测试样品中至少一种miRNA的信号相对于对照样品的变化指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。在一个实施方案中，miR-21信号的变化指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。
在本发明的诊断、预后和治疗方法的具体实施方案中，miR基因产物不是下述的一种或多种:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如本文所述的，使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中miR基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员众所周知的。在一个具体的实施方案中，使用RNA印迹分析，检测至少一种miR基因产物的水平。例如，可以如下从细胞纯化总细胞RNA:在有核酸提取缓冲液存在下匀浆，随后离心。沉淀核酸，通过用DNA酶处理和沉淀，去除DNA。然后根据标准技术，通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离RNA分子，并转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热，将RNA固定化在滤膜上。使用与目标RNA互补的适当标记的DNA或RNA探针，进行对特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，J.Sambrook等人编，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapter 7，其所有公开内容通过参考引用并入本文。
从表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成用于给定miR基因产物的RNA印迹杂交的合适探针(例如，DNA探针，RNA探针)，包括、但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针，以及与目标miR基因产物具有完全互补性的探针。标记的DNA和RNA探针的制备方法，和其与靶核苷酸序列的杂交的条件，描述在Molecular Cloning:A Laboratory Manual，J.Sambrook等人编，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapters 10和11，其所有公开内容都通过参考引用并入本文。
例如，核酸探针可用下述物质标记，例如，放射性核素，例如3H，32P，33P，14C，或35S；重金属；能起到标记配体的特异性结合对成员功能的配体(例如，生物素，抗生物素蛋白或抗体)；荧光分子；化学发光分子；酶等。
通过Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113:237-251的切口平移方法，或通过Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.132:6-13的随机引物法，可以将探针标记成高比放射性，所述文献的所有公开内容都通过参考引用并入本文。后者是从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的32P-标记的探针的选择方法。例如，通过根据切口平移方法用高放射性的核苷酸替换现有的核苷酸，可以制备比放射性大大超过108cpm/微克的32P-标记的核酸探针。然后通过使杂交的滤膜曝光于照相胶片，可以进行杂交的放射自显影检测。对杂交的滤膜曝光的照相胶片的光密度扫描，会提供miR基因转录物水平的精确测量。使用另一个方案，通过计算机化成像系统，例如可从AmershamBiosciences，Piscataway，NJ得到的Molecular Dynamics 400-B 2D磷光计，可以定量miR基因转录物水平。
当DNA或RNA探针的放射性核素标记不可行时，随机-引物方法可以用于将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子中。通过与生物素-结合蛋白(例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素和抗体(例如，抗-生物素抗体)，其偶联到荧光染料或产生颜色反应的酶)的反应，可以检测生物素基化的探针寡核苷酸。
除了RNA印迹和其它RNA杂交技术以外，使用原位杂交技术，可以测定RNA转录物的水平。该技术需要比RNA印迹技术更少的细胞，包括将整个细胞放置在显微镜盖玻片上，用含有放射性的或其它标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸内容物。该技术特别适用于分析来自受试者的组织活检样品。原位杂交技术的实践更详细地描述在美国专利号5,427,916，其全部公开内容通过参考引用并入本文。从表1a和表1b中提供的核酸序列，可以生成适用于给定miR基因产物的原位杂交的探针，包括、但不限于，与目标miR基因产物具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％互补性的探针，以及与目标miR基因产物具有完全互补性的探针，如上所述。
通过逆转录miR基因转录物，随后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增逆转录的转录物，也可以测定细胞中miR基因转录物的相对数目。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“管家”基因的mRNA的水平比较，来定量miR基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其变化形式，是本领域技术人员众所周知的。
在一些情况下，可能希望同时测定样品中许多不同miR基因产物的表达水平。在其它情况下，可能希望测定所有已知的与癌症(例如，胰腺癌)相关的miR基因的转录物的表达水平。评估数百个miR基因或基因产物的癌症特异性表达水平是非常耗时的，并且需要大量总RNA(对于每个RNA印迹至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。
为克服这些限制，可构建微芯片形式(即，微阵列)的寡物文库，其包含对于一组miR基因特异性的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种微小RNA的表达水平。然后可将测试样品的杂交谱与对照样品进行比较，以确定在胰腺癌细胞中具有改变的表达水平的微小RNA。如本文所用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如通过杂交)的分子。“miR-特异性探针寡核苷酸”或“对miR特异性的探针寡核苷酸”是指具有经选择与特定miR基因产物杂交或与该特定miR基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。
特定样品的“表达谱”(expression profile)或“杂交谱”(hybridization profile)基本上是样品的状态的指纹图谱；尽管两种状态可具有相似表达的任何特定基因，但同时评估多个基因可允许产生对于细胞状态独特的基因表达谱。即，正常组织可与胰腺癌组织区别，并且在胰腺癌组织内，可确定不同的预后状态(例如，良好的或差的长期存活希望)。通过比较不同状态中的胰腺癌组织的表达谱，可获得关于哪些基因在这些状态每一种中是重要的(包括基因的增量调节和减量调节)信息。在胰腺癌组织或正常胰腺组织中差异表达的序列的鉴定以及导致不同的预后结果的差异表达的鉴定，允许以许多方式使用该信息。例如，可评价特定的治疗方案(例如，以确定化疗药物是否起着改善特定患者的长期预后的作用)。类似地，可通过将患者的样品与已知的表达谱比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达谱(或个别基因)允许筛选抑制胰腺癌表达谱或将不良预后谱转变成更好的预后谱的药物候选品。
不希望受任何一种理论的束缚，认为细胞中一种或多种miR基因产物的水平的变化可导致这些miR的一个或多个目标靶物失调，这可导致胰腺癌的形成。因此，改变miR基因产物的水平(例如，通过减少在胰腺癌细胞中被增量调节的miR的水平，通过增加在癌细胞中被减量调节的miR的水平)可成功地治疗胰腺癌。
因此，本发明包括治疗受试者中的胰腺癌的方法，其中至少一种miR基因产物在受试者的细胞(例如，胰腺癌细胞)中失调(例如，减量调节、增量调节)。在一个实施方案中，测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。在另一个实施方案中，测试样品(例如，胰腺癌样品)中至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。当至少一种分离的miR基因产物在胰腺癌细胞中减量调节时，该方法包括施用有效量的所述至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。例如，当miR基因产物在受试者癌细胞中减量调节时，给受试者施用有效量的分离的miR基因产物可以抑制癌细胞的增殖。给受试者施用的分离的miR基因产物可以与在癌细胞中减量调节的内源野生型miR基因产物(例如，表1a或表1b所示的miR基因产物)相同，或可以是其变体或生物活性片段。如本文所定义的，miR基因产物的＂变体＂是指与相应的野生型miR基因产物具有小于100％同一性、且具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的miRNA。这样的生物活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达(例如，抑制靶RNA分子的翻译，调控靶RNA分子的稳定性，抑制靶RNA分子的加工)和抑制与胰腺癌有关的细胞过程(例如，细胞分化，细胞生长，细胞死亡)。这些变体包括物种变体和作为miR基因中的一个或多个突变(例如，置换，缺失，插入)的结果的变体。在某些实施方案中，所述变体与相应的野生型miR基因产物至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。
如本文所定义的，miR基因产物的＂生物活性片段＂是指具有相应的野生型miR基因产物的一种或多种生物活性的的miR基因产物的RNA片段。如上所述，这样的生物活性的实例包括、但不限于，抑制靶RNA分子的表达和抑制与胰腺癌有关的细胞过程。在某些实施方案中，所述生物活性片段的长度是至少约5，7，10，12，15，或17个核苷酸。在一个具体的实施方案中，可以与一种或多种其它的抗癌治疗相组合，将分离的miR基因产物施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗，放疗和其组合(例如，放化疗)。
当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。这样的化合物在本文中称作抑制miR基因表达的化合物。合适的抑制miR基因表达的化合物的实例包括、但不限于，在本文中所述的那些(例如，双链RNA，反义核酸和酶RNA分子)。在一个具体的实施方案中，抑制miR基因表达的化合物可以与一种或多种其它的抗癌治疗相组合地施用给受试者。合适的抗癌治疗包括、但不限于，化疗，放疗和其组合(例如，放化疗)。
在一个特定实施方案中，在胰腺癌中失调的(和施用给受试者的)分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合(或这些miR中一种或多种的分离的变体或生物活性片段)。在一个具体的实施方案中，施用的miR基因产物不是下述的一种或多种:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
如所述的，当至少一种分离的miR基因产物在癌细胞中增量调节时，该方法包括，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制胰腺癌细胞的增殖。在一个实施方案中，用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物会抑制选自下述的miR基因产物:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
在一个有关的实施方案中，治疗受试者的胰腺癌的方法另外包括下述步骤:首先测定受试者胰腺癌细胞中至少一种miR基因产物的量，和对比所述miR基因产物的水平与对照细胞中相应的miR基因产物的水平。如果胰腺癌细胞中所述miR基因产物的表达失调(例如，减量调节，增量调节)，该方法另外包括，改变胰腺癌细胞中表达的所述至少一种miR基因产物的量。在一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量小于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，并将有效量的所述miR基因产物或其分离的变体或生物活性片段施用给受试者。在另一个实施方案中，在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，并将有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因的表达的化合物施用给受试者。合适的miR和抑制miR基因的表达的化合物包括，例如，本文所述的那些。
如本文所用的，术语“治疗”、“医治”和“医疗”是指改善与疾病或病症例如胰腺癌相关的症状，包括阻止或延迟疾病症状的发作和/或减少疾病或病症的症状的严重度或频率。术语“受试者”、“患者”和“个体”在本文定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于，灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族动物、羊科动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物或鼠类物种。在优选实施方案中，动物是人。
如本文所用的，分离的miR基因产物的“有效量”是足以抑制患胰腺癌的受试者中癌细胞增殖的量。通过考虑诸如受试者的身材大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径以及给药是局部的还是全身性的等因素，本领域技术人员可容易地确定对给定受试者施用的miR基因产物的有效量。
例如，分离的miR基因产物的有效量可基于被治疗的肿瘤块的近似重量。可通过计算团块的近似体积确定肿瘤块的近似重量，其中1立方厘米的体积大致相当于1克。基于肿瘤块的重量的分离的miR基因产物的有效量可以在约10-500微克/克的肿瘤块的范围内。在某些实施方案中，肿癌块可以是至少约10微克/克的肿瘤块，至少约60微克/克的肿瘤块或至少约100微克/克的肿瘤块。
分离的miR基因产物的有效量还可基于被治疗的受试者的近似或估计的体重。优选，如本文所描述的，通过胃肠外或肠内给药施用该有效量。例如，对受试者施用的分离的miR基因产物的有效量可在约5至3000微克/kg的体重，约700至1000微克/kg的体重的范围内变动，或大于约1000微克/kg的体重。
本领域技术人员也可容易地确定对给定的受试者施用分离的miR基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用miR基因产物一次(例如，作为单次注射或沉积(deposition))。或者，可每天对受试者施用miR基因产物1次或2次，持续约3至约28天，更特别地约7至约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用miR基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，要理解对受试者施用的miR基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。
如本文所用的，“分离的”miR基因产物是合成的或通过人干预从天然状态改变的或取出的产物。例如，合成的miR基因产物或部分地或完全地与其天然状态的共存材料分离的miR基因产物被认为是“分离的”。分离的miR基因产物可以基本上纯化的形式存在，或可存在于已递送了该miR基因产物的细胞中。因此，有意递送至细胞或有意在细胞中表达的miR基因产物被认为是“分离的”miR基因产物。在细胞内从miR前体分子产生的miR基因产物也被认为是“分离的”分子。根据本发明，本文所述的分离的miR基因产物可以用于生产治疗受试者(例如，人)的胰腺癌的药物。
可使用许多标准技术获得分离的miR基因产物。例如，可使用本领域内已知的方法化学合成或重组产生miR基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪，化学合成miR基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的商业提供商包括例如Proligo(Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。
或者，可使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA质粒表达miR基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力范围之内。本发明的重组质粒还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可通过标准技术从培养细胞表达系统分离从重组质粒表达的miR基因产物。也可将从重组质粒表达的miR基因产物递送至和直接在癌细胞中表达。下面更详细地讨论重组质粒用于将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
可从分开的重组质粒表达miR基因产物，或可从相同的重组质粒表达它们。在一个实施方案中，miR基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后前体分子通过合适的加工系统(包括但不限于存在于癌细胞内的加工系统)加工成功能性miR基因产物。其它合适的加工系统包括，例如，体外果蝇细胞裂解物系统(lysate system)(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专利申请号2002/0086356中描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请号2004/0014113中描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文)。
适合用于表达miR基因产物的质粒的选择，用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法和将重组质粒递送入目的细胞的方法在本领域技术人员的能力范围之内。参见，例如，Zeng等人(2002)，Molecular Cell 9:1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20:446-448；Brummelkamp等人(2002)，Science 296:550-553；Miyagishi等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:497-500；Paddison等人(2002)，Genes Dev.16:948-958；Lee等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:500-505；和Paul等人(2002)，Nat.Biotechnol.20:505-508，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
在一个实施方案中，表达miR基因产物的质粒包含在CMV即早期启动子控制之下的编码miR前体RNA的序列。如本文所用的，“在启动子控制之下”意指编码miR基因产物的核酸序列位于启动子的3’，这样启动子可起始编码miR基因产物的序列的转录。
也可从重组病毒载体表达miR基因产物。可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达miR基因产物。可通过标准技术从培养细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA，或可在癌细胞中直接表达它。下面更详细地描述重组病毒载体将miR基因产物递送至癌细胞的用途。
本发明的重组病毒载体包含编码miR基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括、但不限于例如U6或H1 RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力范围之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达miR基因产物的诱导型或调控型启动子。
可使用能够接受miR基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、杆状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。适当时，可通过用包膜蛋白和来自其它病毒的其它表面蛋白假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白来改变病毒载体的向性。
例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病毒病毒、埃博拉病毒、莫科拉病等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。通过对载体进行基因工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来产生本发明的AAV载体，从而使其靶向不同的细胞。例如，在血清2型基因组上表达血清2型衣壳的AAV载体称为AAV 2/2。可用血清5型衣壳蛋白基因取代AAV2/2载体中的该血清2型衣壳蛋白基因以产生AAV 2/5载体。用于构建表达不同的衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力范围之内；参见，例如，Rabinowitz，J.E.，等人(2002)，J.Virol.76:791-801，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法以及表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力范围之内。参见，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap.2:301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6:608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.1:5-14；和Anderson(1998)，Nature 392:25-30，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
特别合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达本发明的miR基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及将载体递送入靶细胞的方法描述于Xia等人(2002)，Nat.Biotech.20:1006-1010中，其全部公开内容通过参考引用并入本文。用于表达miR基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及将载体递送入靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987)，J.Virol.61:3096-3101；Fisher等人(1996)，J.Virol.，70:520-532；Samulski等人(1989)，J.Virol.63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641，其全部公开内容通过参考引用并入本文。在一个实施方案中，从包含CMV立即早期启动子的单个重组AAV载体表达miR基因产物。
在某一实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6RNA的控制下、与polyT终止序列可操作连接的编码miR前体RNA的核酸序列。如本文所用的，“与polyT终止序列可操作连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5’方向与polyT终止信号直接相邻。在从载体转录miR序列的过程中，polyT终止信号起着终止转录的作用。
在本发明的治疗方法的其它实施方案中，可对受试者施用有效量的至少一种抑制miR表达的化合物。如本文所用的，“抑制miR表达”是指在治疗后miR基因产物的前体和/或活性、成熟形式的产量比治疗前产生的量低。通过使用例如本文讨论的测定miR转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定miR表达在癌细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上发生(即，通过抑制编码miR基因产物的miR基因的转录)或在加工水平上发生(例如，通过抑制miR前体加工成成熟的、活性miR)。
如本文所用的，抑制miR表达的化合物的“有效量”是足以在患癌症(例如，胰腺癌)的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑诸如受试者的身材大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、给药途径和给药是局部的还是全身性的等因素，本领域技术人员可容易地确定抑制miR表达的化合物的有效量。
例如，抑制表达的化合物的有效量可基于待治疗的肿瘤块的近似重量，如本文所述。抑制miR表达的化合物的有效量也可基于待治疗的受试者的近似或估计重量，如本文所述。
本领域技术人员也可容易地确定对给定的受试者施用抑制miR表达的化合物的合适的给药方案，如本文所述。用于抑制miR基因表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短的或小的干扰RNA或“siRNA”)、反义核酸和酶RNA分子例如核酶。此类化合物中的各化合物可靶向给定的miR基因产物和干扰靶miR基因产物的表达(例如，通过抑制翻译，通过诱导切割和/或降解)。
例如，通过用与miR基因产物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％、或100％序列同源性的分离的双链RNA(＂dsRNA＂)分子诱导对miR基因的RNA干扰，可以抑制给定miR基因的表达。在一个具体的实施方案中，dsRNA分子是＂短的或小的干扰RNA＂或＂siRNA＂。
用于本方法的siRNA包含长度为约17个核苷酸至约29个核苷酸，优选长度为约19至约25个核苷酸的短的双链RNA。siRNA包含根据标准的Watson-Crick碱基配对相互作用(以下称“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含基本上与靶miR基因产物内包含的核酸序列一致的核酸序列。
如本文所用的，siRNA中与靶mRNA中包含的靶序列“基本上一致”的核酸序列是与靶序列一致或与靶序列相异1个或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包含两个互补的单链RNA分子，或可包含其中两个互补部分是碱基配对的并且通过单链“发夹结构”区域共价连接的单链分子。
siRNA可以是与天然存在的RNA不同在于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的改变的RNA。此类改变可包括非核苷酸材料的添加，例如添加至siRNA的末端或添加至siRNA的一个或多个内部核苷酸，或使siRNA对核酸酶降解具有抗性的修饰或用脱氧核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。
siRNA的一条或两条链还可包含3′突出端。如本文所用的，“3′突出端”是指从双链RNA链的3′末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含长度为1个至约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至约5个核苷酸、长度为1至约4个核苷酸或长度为约2至约4个核苷酸的至少一个3′突出端。在一个具体的实施方案中，3′突出端存在于siRNA的两条链上，且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各链包含二胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dithymidylic acid)(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。
可通过化学或生物学的方法产生siRNA，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请号2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请号2004/0018176，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
还可通过反义核酸来抑制给定的miR基因的表达。如本文所用的，“反义核酸”是指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用结合至靶RNA的核酸分子，其可改变靶RNA的活性。适合用于本发明的方法的反义核酸是通常包含与miR基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合体、肽核酸(PNA))。反义核酸可包含与miR基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补的核酸序列。表1a和表1b中提供了特定人miR基因产物的核酸序列。不希望受限于任何理论，认为反义核酸激活RNA酶H或降解miR基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。
反义核酸还可包含对核酸主链的修饰或对糖和碱基部分(或其等同物)的修饰，以增强靶物特异性、对核酸酶的抗性、与分子的功效相关的递送或其它性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体插入剂(例如吖啶)或一种或多种抗核酸酶基团。
可通过化学或生物学方法产生反义核酸，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力范围之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261:1004和Woolf等人的美国专利号5,849,902，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
还可用酶核酸抑制给定的miR基因的表达。如本文所用的，“酶核酸”是指包含具有与miR基因产物的连续核酸序列的互补性的底物结合区的核酸，其能够特异性切割miR基因产物。酶核酸底物结合区可以与miR基因产物中的连续核酸序列例如50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补。酶核酸还可包含在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本发明的方法的示例性酶核酸是核酶。
酶核酸可通过化学或生物学方法产生，或如上面关于分离的miR基因产物所描述的，可从重组质粒或病毒载体表达。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucleic Acids Res.23:2092-96；Hammann等人(1999)，Antisenseand Nucleic Acid Drug Dev.9:25-31；和属于Cech等人的美国专利号4,987,071，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
至少一种miR基因产物或至少一种抑制miR表达的化合物的施用，将抑制患有癌症(例如，胰腺癌)的受试者中的癌细胞的增殖。如本文所用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性地或临时性地阻止或减缓细胞的生长。如果在施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物后，受试者中癌细胞的数目保持恒定或减少，那么可推断此类细胞的增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长速率减小也可推断癌细胞的增殖被抑制。
可通过直接测量或通过从原发性或转移性肿瘤块的大小估计来确定受试者体内的癌细胞的数目。例如，可通过免疫组织学方法、流式细胞计量术或设计用于检测癌细胞的特征性表面标记的其它技术测量受试者中的癌细胞数目。
可通过直接目视观察或通过诊断性影像学方法例如X射线、磁共振显像、超声和闪烁照相术确定肿瘤块的大小。如本领域内已知的，可以用或不用造影剂，使用用于确定肿瘤块的大小的诊断性影像法。还可使用物理方法例如组织块的触诊或使用测量仪器例如测径器测量组织块来确定肿瘤块的大小。
可通过适合将这些化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。例如，可通过适合于用这些化合物或用包含编码这些化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用miR基因产物或抑制miR表达的化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。
用于真核细胞的转染方法在本领域内熟知，包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射、电穿孔、脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移、受体介导的核酸递送、bioballistic或粒子加速；磷酸钙沉淀和通过病毒载体介导的转染。
例如，可用脂质体转移化合物DOTAP(甲基硫酸N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基-铵，Boehringer-Mannheim)或等同物例如LIPOFECTIN转染细胞。使用的核酸的量对于本发明的实践不是至关重要的；可用0.1-100微克的核酸/105个细胞获得可接受的结果。例如，可使用每105个细胞约0.5微克质粒于3微克DOTAP中的比率。
还可通过任何合适的肠内或胃肠外给药途径对受试者施用miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物。用于本方法的合适的肠内给药途径包括例如口服、直肠或鼻内递送。合适的胃肠外给药途径包括例如血管内给药(例如，至脉管系统的静脉内快速注射、静脉输注、动脉内快速浓注、动脉内输注和导管滴注)；组织外周和组织内注射(例如，瘤周和瘤内注射、视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其它安置装置(例如，视网膜弹丸剂或栓剂或包含多孔、无孔或凝胶状材料的植入体)；以及吸入。特别适合的给药途径是注射、输注和直接至肿瘤的注射。
在本方法中，可将miR基因产物或抑制miR基因产物的表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起或作为核酸(例如，重组质粒或病毒载体)给受试者施用，所述核酸包含表达miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，多聚赖氨酸)和脂质体。
包含表达miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的重组质粒和病毒载体以及用于递送此类质粒和载体至癌细胞的技术在本文讨论，和/或是本领域众所周知的。
在一个具体的实施方案中，脂质体用于将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体也可以增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质(其通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇)形成用于本发明的合适的脂质体。通常通过考虑诸如想要的脂质体大小和血流中脂质体的半衰期等因素，指导脂质的选择。用于制备脂质体的许多方法是已知的，例如，如在Szoka等人(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467；和美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容通过参考引用并入本文)中描述。
用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍存在的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。
还可对用于本方法的脂质体进行修饰，以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体具有存在于表面上或整合入脂质体结构中的调理作用抑制部分。在特别优选实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用抑制部分和配体两者。
用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是结合至脂质体膜的大的亲水聚合物。如本文所用的，当其例如通过脂溶性锚嵌入膜本身中或通过与膜脂质的活性基团直接结合而被化学地或物理地附着至膜时，调理作用抑制部分“结合”至脂质体膜。这些调理作用抑制性亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES摄取的保护表面层；例如，如美国专利号4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
适合用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有约500至约40,000道尔顿和优选约2,000至约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)或它们的衍生物；例如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸酯；合成聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯酮；线性的、分支的或树状聚酰胺-胺(polyamidoamines)；聚丙烯酸；多元醇，例如羧基或氨基化学连接至其的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，调理作用抑制性聚合物可以是PEG与多聚氨基酸、多糖、聚酰胺-胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。调理作用抑制性聚合物也可以是包含氨基酸或羧酸例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉菜胶的天然多糖；氨化多糖或寡糖(线性或分支的)；或羧化多糖或低聚糖，例如与碳酸的衍生物反应，获得羧基的连接。优选，调理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。
可通过许多熟知的技术中的任一种将调理作用抑制部分与脂质体膜结合。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯结合至磷脂酰乙醇胺脂溶性锚，然后再将其结合至膜。类似地，可使用Na(CN)BH3和溶剂混合物(例如以30:12比例的四氢呋喃和水)在60℃下通过还原氨化作用用硬脂酰胺脂溶性锚衍生葡聚糖聚合物。
用调理作用抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持长得多的时间。因此，这样的脂质体有时称为“秘密(stealth)”脂质体。已知秘密脂质体在由多孔的或“渗漏的”微血管滋养的组织中积累。因此，特征在于该微血管缺陷的组织例如实体瘤将有效率地积累这些脂质体；参见Gabizon，等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18:6949-53。此外，减少的由RES进行的吸收通过防止脂质体在肝和脾中大量积累而降低了秘密脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的脂质体特别适合将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。
按照本领域内已知的技术，在给受试者施用之前，可将miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物配制为药物组合物，有时称为“药物”。因此，本发明包括用于治疗胰腺癌的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。在一个具体实施方案中，所述至少一种miR基因产物对应于这样的miR基因产物，即相对于合适的对照细胞，该miR基因产物在胰腺癌细胞中具有减少的表达水平(即，减量调节)。在某些实施方案中，所述分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。在一个实施方案中，分离的miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1。在另一个实施方案中，miR基因产物不是miR-210或miR-212。在另一个实施方案中，miR基因产物不是miR-21，miR-143，miR-205或miR-9。在另一个实施方案中，miR基因产物不是miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-214，miR-218-2，miR-145，miR-106a，miR-192，miR-203，miR-150，miR-220，miR-212或miR-9。
在其它实施方案中，本发明的药物组合物包含至少一种抑制miR表达的化合物和药学上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，所述至少一种抑制miR表达的化合物对在胰腺癌细胞中的表达大于对照细胞(即，增量调节)的miR基因产物是特异性的。在某些实施方案中，所述抑制miR表达的化合物对一种或多种选自下述的miR基因产物是特异性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。在一个实施方案中，所述分离的miR基因产物对miR-15a或miR-16-1不是特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物对miR-210或miR-212不是特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物对miR-21，miR-143，miR-205或miR-9不是特异性的。在另一个实施方案中，所述miR基因产物对miR-21，miR-191，miR-126*，miR-210，miR-155，miR-143，miR-205，miR-126，miR-30a-5p，miR-140，miR-214，miR-218-2，miR-145，miR-106a，miR-192，miR-203，miR-150，miR-220，miR-212或miR-9不是特异性的。
本发明的药物组合物的特征在于是至少无菌的和无热原的。如本文所用的，“药物组合物”包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的能力范围之内，例如，如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，Pa.(1985)中所描述的，其全部公开内容通过参考引用并入本文。
本发明的药物组合物包含与药学上可接受的载体相混合的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)(例如，0.1-90％重量)或其生理上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的药物组合物另外包含一种或多种抗癌剂(例如，化疗剂)。本发明的药物制剂也可以包含由脂质体包封的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)，和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物包含不是miR-15，miR-16，miR-143和/或miR-145的miR基因或基因产物。
特别合适的药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、生理盐水、0.4％的盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
在一个具体实施方案中，本发明的药物组合物包含对核酸酶的降解具有抗性的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)。本领域技术人员可容易地合成对核酸酶具有抗性的核酸，例如通过将一个或多个在2’位置被修饰的核糖核苷酸掺入miR基因产物。合适的2’-修饰的核糖核苷酸包括在2’位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。
本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂(osmolalityadjusting agent)、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理生物相容性缓冲剂(例如，盐酸氨丁三醇(tromethaminehydrochloride))、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合物(例如，DTPA钙、CaNaDTPA-双酰胺)的加入，或任意地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的加入。可包装本发明的药物组合物以使以液体形式使用或可将其冻干。
对于本发明的固体药物组合物，可使用常规的无毒性固体药学上可接受的载体例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。
例如，用于口服给药的固体药物组合物可包含上列的任何载体和赋形剂和10-95％，优选25％-75％的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)给药的药物组合物可包含封装在上述脂质体中的按重量计算0.01-20％、优选按重量计算1％-10％的至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)和喷射剂。当需要时也可包含载体；例如用于鼻内给药的卵磷脂。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在一个具体的实施方案中，组合物包含至少一种miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物(或至少一种包含编码miR基因产物或抑制miR基因表达的化合物的序列的核酸)和至少一种化疗剂。适用于本发明的方法的化疗剂，包括、但不限于，DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-CoA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。适用于本发明的组合物的试剂的实例包括、但不限于，阿糖胞苷，甲氨蝶呤，长春新碱，依托泊苷(VP-16)，多柔比星(阿霉素)，顺铂(CDDP)，地塞米松，arglabin，环磷酰胺，沙可来新，甲基亚硝基脲，氟尿嘧啶，5-氟尿嘧啶(5FU)，长春碱，喜树碱，放线菌素-D，丝裂霉素C，过氧化氢，奥沙利铂，伊立替康，托泊替康，亚叶酸，卡莫司汀，链佐星，CPT-11，泰素，他莫昔芬，达卡巴嗪，利妥昔单抗，柔红霉素，1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶，伊马替尼，氟达拉滨，多西他赛和FOLFOX4。
本发明也包括鉴定抗胰腺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，并测量细胞中至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中降低的表达水平相关的至少一种miR基因产物的水平。相对于合适的对照(例如，对照细胞中所述miR基因产物的水平)，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。在一个具体的实施方案中，所述至少一种与胰腺癌细胞中降低的表达水平相关的miR基因产物选自miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。在一个实施方案中，miR基因产物不是下述的一种或多种:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
在其它实施方案中，该方法包括，给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中增强的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平。在一个实施方案中，相对于合适的对照(例如，对照细胞中所述miR基因产物的水平)，所述细胞中与胰腺癌中增强的表达水平有关的miR基因产物的水平的降低指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。在一个具体的实施方案中，所述至少一种与胰腺癌细胞中增强的表达水平有关的miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。在一个实施方案中，所述miR基因产物不是下述的一种或多种:let7a-2，let-7c，let-7g，let-7i，miR-7-2，miR-7-3，miR-9，miR-9-1，miR-10a，miR-15a，miR-15b，miR-16-1，miR-16-2，miR-17-5p，miR-20a，miR-21，miR-24-1，miR-24-2，miR-25，miR-29b-2，miR-30，miR-30a-5p，miR-30c，miR-30d，miR-31，miR-32，miR-34，miR-34a，miR-34a prec，miR-34a-1，miR-34a-2，miR-92-2，miR-96，miR-99a，miR-99b prec，miR-100，miR-103，miR-106a，miR-107，miR-123，miR-124a-1，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-126*，miR-127，miR-128b，miR-129，miR-129-1/2prec，miR-132，miR-135-1，miR-136，miR-137，miR-141，miR-142-as，miR-143，miR-146，miR-148，miR-149，miR-153，miR-155，miR159-1，miR-181，miR-181b-1，miR-182，miR-186，miR-191，miR-192，miR-195，miR-196-1，miR-196-1prec，miR-196-2，miR-199a-1，miR-199a-2，miR-199b，miR-200b，miR-202，miR-203，miR-204，miR-205，miR-210，miR-211，miR-212，miR-214，miR-215，miR-217，miR-221和/或miR-223。
合适的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)，和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。可通过重组、合成方法产生该试剂，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于对细胞提供此类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，上文中描述了几种这样的方法。用于检测至少一种miR基因产物的表达的方法(例如，RNA印迹法、原位杂交法、RT-PCR、表达谱分析)在本领域内也是熟知的。上文中也描述了这些方法中的几种方法。
现在通过下列非限制性实施例解释本发明。
实施例 材料和方法 患者数据，肿瘤细胞富集和RNA提取。
在表2中报道了从意大利Verona大学病理系的冷冻组织库得到的40个PET和4个PACC的临床病理学特征。所有肿瘤都是散发的，这通过患者的直接面谈得到的个人和家族史来评判。通过组织病理学和细胞标记分析来诊断PET，并根据WHO标准分类(Kloppel，G.等人，＂The Gastroenteropancreatic Neuroendocrine Cell System and ItsTumors:The WHO Classification.＂Ann.N.Y.Acad.Set1014:13-27(2004))。它们包括28个无功能的和12个有功能的肿瘤。28个NF-PET包括11个分化良好的内分泌肿瘤(WDET)和18个分化良好的内分泌癌(WDEC)。12个F-PET是胰岛素瘤，其包括11个WDET和1个WDEC。根据考虑肿瘤大小、Ki-67增殖指数和血管侵入的WHO标准，认为WDET具有良性的或不确定的生物学行为(表2)。通过肿瘤细胞中脂肪酶、淀粉酶和胰蛋白酶的免疫组织化学表达，证实了PACC的诊断。作为对照，在12个相对应的患者标本中采取正常的胰腺。
在所有情况下，通过显微解剖或恒冷箱富集，得到超过90％的肿瘤细胞构成。根据生产商的说明书，用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)从至少10个20-30μm厚的冷冻切片提取总RNA，每5个切片检查样品的细胞组成。在每种情况下，使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)证实总RNA的完整性。
表2.胰腺内分泌和腺泡肿瘤的临床病理学数据。
a病例用前面有F或NF(它们分别是功能性的或无功能的内分泌肿瘤)的随机分配的数字标示。
bWDEC，分化良好的内分泌癌；WDET-b，分化良好的具有良性行为的内分泌肿瘤；WDET-u，分化良好的具有不确定生物学行为的内分泌肿瘤。
c侵入胰周脂肪和/或邻近器官(例如十二指肠，胆总管，脾)。
dIHC，免疫组织化学；pos，阳性；pos-w，弱信号的阳性；neg，阴性。
e通过Ki67免疫组织化学测量的增殖指数。
fLN，淋巴结。
gn.a.，未得到。
微小RNA微阵列杂交和定量。
如前所述(Liu，C.G.等人，＂An Oligonucleotide Microchip forGenome-Wide microRNA Profiling in human and Mouse Tissues.＂Proa Natl.Acad.Sci.USA 707:9740-44(2004))，在微小RNA微阵列芯片上进行微小RNA标记和杂交。简而言之，使用生物素末端标记的随机八聚体，逆转录来自每个样品的5μg总RNA。在我们定制的微小RNA微阵列芯片(OSU-CCC 2.0版)上进行杂交，该芯片含有含注解的活性部位的一式四份安置的460个成熟微小RNA(235个人类的，222个小鼠的，和3个拟南芥的)的探针。经常，对给定的成熟的微小RNA存在超过1个探针组。另外，存在用于检测微小RNA前体的与大多数前-微小RNA相对应的一式四份探针。微阵列也包括对几种剪接snRNA包括U6的探针。用链霉抗生物素-Alexa647缀合物检测杂交信号，并使用Axon 4000B扫描。使用Genepix 6.0软件(AxonInstruments(现为Molecular Devices Corp.)，Sunnyvale，CA)，定量扫描图像。
微小RNA微阵列数据的计算分析 使用R软件v.2.0.1-和Bioconductor v.1.6包(Gentleman，R.C.等人，＂Bioconductor:Open Software Development forComputational Biology and Bioinformatics.＂Genome Biol.5:R80(2004))，建立大多数分析和图像。按照顺序，从56个微小RNA微阵列的数据集合去除空白和探针对照点，然后从中值信号减去局部背景。接着，使用通过vsn包中的栅格在每个阵列中分层的方差-稳定化转化，标准化数据。随后，使用genefilter包来去除其强度小于所有阵列中第99百分位数的空白点的所有点。与空白/阴性对照探针的相对杂交和随后的RNA分析表明，小于4.5的log-转化的信号的绝对值是不可靠的。
使用samr包，通过直接的2级非配对比较，进一步分析得到的数据。应用在它们的标题中特别报道的输入标准(基于倍数变化和δ值)，得到差异表达的微小RNA的表。为了增加严格性，进一步过滤微小RNA探针，保留具有至少3个显著复本的微小RNA探针。
使用应用Tukey的中值抛光算法得到的重复点的累计值，进行分级聚类分析。使用具有最高四分位数间距的前200个探针进行分析，所述探针含有成熟的微小RNA序列。用于聚类样品和基因的距离度量分别是皮尔森关联和欧几里德距离法。群聚方法是完全-关联。使用Maple Tree(0.2.3.2版)(www.mapletree.sourceforge.net)，显现输出。使用MIAMExpress，将所有数据呈递给Array Express数据库。
通过皮尔森关联，测量微小RNA之间协同表达的水平，当它们的距离低于50kb时，将微小RNA基因分配到同一簇(Baskerville，S.和D.P.Bartel，“Microarray Profiling of microRNAs RevealsFrequent Coexpression with Neighboring miRNAs and Host Genes.”RNA 11:241-47(2005))。接着，使用Mann-Whitney非参量检验法，将属于同一簇的微小RNA之间测量的关联值集合与簇中每个微小RNA相对于该簇以外的所有其它微小RNA之间测量的关联值集合相对比。
RNA印迹。
将5μg总RNA在15％Criterion预制PAGE/尿素凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上电泳，转移到Hybond-N+膜(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上，并在ULTRAhybTM-Oligo杂交缓冲液(Ambion，Austin，TX)中在37℃与32P末端标记的DNA探针杂交过夜。在37℃用2X SSC/0.5％ SDS洗涤膜2次，每次30分钟。DNA探针是相对于成熟微小RNA的反义寡核苷酸，相对于5S RNA的用作对照。使用Typhoon9410磷光计(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)分析滤膜，使用ImageQuant TL(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)定量。通过在0.1％ SDS水溶液中煮沸5分钟，剥离印迹，并重新探测几分钟。
结果 使用定制的微阵列，测定12个正常胰腺样品和44个胰腺肿瘤(包括40个PET和4个PACC)的微小RNA表达谱。经证实该平台会产生稳健的结果，如通过几个以前的研究所验证的(Liu，C.G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9740-44(2004)；Calin，G.等人，New Eng1.J.Med.353(17):1793-1801(2005)；Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))。在基因组簇中物理连锁的微小RNA共表达的发现提供了进一步的支持，这证实了分组的微小RNA基因表现出协同表达(Baskerville，S.，和D.P.Bartel，RNA 77:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，Nucleic Acids Res.33:2697-2706(2005))。
使用200个最可变的微小RNA的分级聚类的非监督分析，证实了共同的微小RNA表达模式，其可以将胰腺内分泌和腺泡肿瘤与正常胰腺区分开(图1A-1E)。值得注意地，PACC落入作为包括所有PET的更宽簇的一部分的独特簇中，而胰岛素瘤和NF-PET之间没有特征谱。
类对比分析证实了PACC或PET和正常组织之间几种微小RNA的差异表达，而更小数目的微小RNA在PET和PACC之间差异表达，以及在PET的WDEC亚组和PACC之间差异表达。更具体地，PET表现出相对于正常胰腺87个增量调节的和8个减量调节的微小RNA(表3)，而PACC具有30个增量调节的和7个减量调节的微小RNA(表4)。仅10个微小RNA在PET和PACC之间差异表达(表5)，相对于PACC，4个是WDEC独有的(表6)。
共同的微小RNA表达模式将胰腺内分泌和腺泡肿瘤与正常胰腺区分开。
在PET相对于正常组织中也发现了大多数在PACC相对于正常组织中发现的差异表达的微小RNA。更具体地，发现在PACC中过表达的30个微小RNA中的28个(93％)也在PET中增量调节。类似地，7个表达不足的微小RNA中的5个(71％)在两种肿瘤亚型中都减量调节。该重叠，以及仅有限组的微小RNA在PET和PACC之间或在PET亚型中差异表达的事实，暗示着腺泡和胰岛-衍生的肿瘤共有的微小RNA表达模式。
在PET中增量调节的微小RNA(也是PACC共有的)中，通过RNA印迹分析验证了7个。更具体地，miR-103是正常胰腺、腺泡细胞癌和胰腺内分泌肿瘤的所有配对比较的最佳区分鉴别因子(图2A和2B)。miR-107的表达与它的高度同源的miR-103的表达平行，也证实了肿瘤中相对于正常而言miR-23a，miR-26b，miR-192和miR-342的显著过表达(图6A-6C)。
在PET中减量调节的微小RNA中，miR-155的RNA印迹分析表明了PET和PACC中都缺乏可检测的表达(图2A和2B)。尽管miR-155不在以上列出的在PACC中减量调节的基因(表4)中，通过微阵列也检测到它在该肿瘤类型中的低表达，如图2A的方框和细线图所示。
有限组的微小RNA将胰腺内分泌肿瘤与腺泡肿瘤区分开 PET和PACC的直接对比，显示了仅10个增量调节的微小RNA(表5)，它们也都在PET中相对正常组织过表达。相比之下，没有发现微小RNA在PACC中特异性地增量调节或减量调节。
miR-204的过表达是胰岛素瘤特异性的，且与胰岛素的免疫组织化学表达相关联 胰岛素瘤与NF-PET的对比，鉴别出仅3个在胰岛素瘤中显著过表达的微小RNA，包括miR-204、它的同系物miR-211和miR-203(表7)。值得注意地，如通过免疫组织化学染色所测得的，胰岛素蛋白的表达与miR-204表达的关联性比与胰岛素mRNA表达的关联性更强(图3A-3C)。实际上，基于阴性或阳性ICH染色的对数回归分析表明，通过胰岛素mRNA和miR-204表达两者都预测了胰岛素蛋白表达(p<0.001)；但是，在一个多变量模型中，仅miR-204表达保持统计显著性(p<0.001)。
由于有人提出miR-375在小鼠胰岛中特异性地表达，且起胰岛素胞吐作用的负调节剂的功能(Poy，M.N.等人，Nature432:226-30(2004))，我们通过RNA印迹研究了它在正常人组织和我们的样品中的表达。使用几种人成年组织的集合，仅在正常胰腺中检测到miR-375(图7A)。在肿瘤中的miR-375的表达水平通常高于在正常胰腺中，但是显示在胰岛素瘤和无功能的肿瘤之间没有差异(图7B和7C)。
miR-21的表达与增殖指数和肝转移的存在强烈相关 评价表达谱以鉴定基于转移状态或增殖指数区分PET的微小RNA，仅将miR-21鉴别为显著的(图4A-4C和表8)。这不是令人惊奇的，因为这2种肿瘤特征是相关的。实际上，所有转移性PET都具有>2％的增殖指数，而没有具有更低增殖评分的肿瘤是转移性的。此外，miR-21也在具有高(Ki-67>2％)和低(Ki-67≤2％)增殖指数的NF-PET或WDEC之间区分开。另一个令人感兴趣的观察是，相对于正常胰腺，miR-21也在PACC中过表达(表4)。
差异表达的微小RNA的推定的mRNA靶的鉴别。
使用3个不同的程序(miRanda，TargetScan，PicTar，分别从www.microrna.org/mammalian/index.html；www.genes.mit.edu/targetscan/；和www.pictar.bio.nyu.edu获得)来鉴别选定的微小RNA的预测靶物，所述选定的微小RNA即miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21。为了增加分析的严格性，我们仅仅考虑了从所有3种算法发现的靶基因(表9)。因为还已经用定制的EST微阵列评价了为微小RNA表达分析的相同肿瘤样品和5个正常胰腺的基因表达谱(数据未显示)，我们尝试评价PET和正常组织中、以及具有不同临床病理学特征的PET中的预测的mRNA靶的状态。双样品-t-检验分析鉴别了减量调节的或增量调节的几个推定的靶基因，即对于miR-103/107为28个增量调节的和7个减量调节的基因，对于miR-155或miR-204/211为2个增量调节的和2个减量调节的基因，和对于miR-21为1个增量调节的和1个减量调节的基因(表10)。值得注意地，发现PDCD4基因(miR-21的一种推定靶物)的mRNA表达在肝转移性PET3中以及在具有高增殖指数的肿瘤中减量调节，表明与miR-21表达的负相关(图5)。
讨论 正常胰腺、胰腺内分泌肿瘤和腺泡癌中的微小RNA表达谱的观察测量结果可总结如下: i)共同的微小RNA表达谱将内分泌和腺泡肿瘤与正常胰腺区分开； ii)伴随miR-155的表达缺失的miR-103和miR-107的表达，将肿瘤与正常区分开； iii)有限组的微小RNA是内分泌肿瘤特异性的，且可能与内分泌分化或肿瘤发生相关； iv)miR-204表达主要发生在胰岛素瘤中，且与胰岛素的免疫组织化学表达相关；和 v)miR-21的表达与增殖指数和肝转移强相关。
表达谱的非监督分级聚类表明，这2个肿瘤类型与正常胰腺区分开。尽管PACC落入独特簇中，这是包括所有PET的更宽簇的一部分。虽然与腺泡癌相对于正常相比，我们在PET相对于正常中鉴别出了许多更为差异表达的微小RNA，绝大多数在PACC中差异表达的微小RNA在PET中类似地改变。值得注意的是，胰腺本体主要由腺泡形成，因此代表着腺泡细胞癌分析的理想正常对应物，而胰岛细胞代表着胰腺内分泌肿瘤的正常对应物。不幸地，我们没有可得到的这些细胞的制品。但是，发现腺泡和胰岛肿瘤之间差异表达的微小RNA的很大程度上一致的模式，包括28个增量调节的和5个减量调节的基因，暗示着这2种肿瘤类型共有的该组可能与胰腺致瘤性转化相关。已经发现在这2种肿瘤类型中差异表达的几种微小RNA在乳房、结肠和B-细胞白血病中差异表达，这为该断言提供了附加的支持(Caldas，C等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，CM.，和G.A.Calin，Cell122:6-7(2005)；Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))。另外，在我们的肿瘤中差异表达的微小RNA中的至少20种已经被鉴别为在肺A549或宫颈HeLa癌细胞系中具有生长相关的或细胞凋亡的效应(Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.53:1290-97(2005))。
此外，我们在PACC和PET中观察到miR-17、miR-20和miR-92-1的协同过表达，它们包含在多顺反子簇中。已经描述该miR-17-92簇作为与c-MYC基因有关的癌基因起作用(He，L.等人，Nature455:828-33(2005))。值得注意地，已经在胰腺内分泌肿瘤中、也在增生性胰岛中报道了c-MYC的过表达，这暗示着它在胰岛肿瘤发生早期中的参与(Pavelic，K.等人，Anticancer Res.76:1707-17(1996))。另外，体外或体内模型中小鼠胰岛或腺泡细胞中MYC的诱导，会分别产生内分泌肿瘤(Katic，M.等人，Carcinogenesis 20:1521-27(1999)；Lewis，B.C.等人，Genes Dev.17:3127-38(2003))或混合的腺泡/导管腺癌(Sandgren，E.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:93-97(1991))，而对MYC-诱导的细胞凋亡的抑制导致胰岛细胞癌(Pelengaris，S.等人，Cell 109:321-34(2002))。
2种高度同源的miR-103和miR-107微小RNA的表达以及miR-155的表达的缺失，是肿瘤区别于正常胰腺样品的特征。有趣地，已经发现miR-103/107在几种肿瘤类型中过表达(与主题申请同日提交的美国申请号______；标题“Micro-RNA-Based Methods andCompositions for the Diagnosis and Treatment of Solid Cancers”，Stefano Volinia，George A.Calin和Carlo M.Croce；代理人案卷号_____；其教导通过参考引用整体并入本文)。鉴于已经在淋巴瘤(Caldas，C.等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))和乳腺癌(Iorio，M.V.等人，Cancer Res.65:7065-70(2005))中观察到miR-155的过表达(该发现已经导致miR-155可能是致癌微小RNA的推测(Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))，miR-155在正常胰腺中表达、但是在PET和PACC中表达不足或不表达的发现是相当有趣的。这可能不是意料之外的，因为在成年人中表达的微小RNA是组织-特异性的(Babak，T.等人，RNA 10:1813-19(2004))，微小RNA错误表达的结果高度依赖于微小RNA调节的mRNA的细胞-特异性的表达模式(Cheng，A.M.等人，Nucleic Acids Res.33:1290-97(2005))。
10种微小RNA在PET中特有地过表达，并将该肿瘤与PACC和正常胰腺区分开。它们包括miR-99a，miR-99b，miR-100，miR-125a，miR-125b-1，miR-125b-2，miR-129-2，miR-130a，miR-132，和miR-342。这些微小RNA可以是内分泌分化或内分泌肿瘤发生所特征性的。另一方面，没有发现微小RNA在PACC中特异性地增量调节或减量调节，尽管有限数目的PACC样品可能影响分析能力。
尽管胰岛素瘤和无功能的内分泌肿瘤之间的微小RNA谱几乎不可区分，2种密切相关的微小RNA(即miR-204和miR-211)的过表达很大程度上限于胰岛素瘤。很有意思的是，miR-204表达与胰岛素的免疫组织化学表达相关联。在这方面，最近已经报道miR-375在小鼠胰岛中特异性表达，并起胰岛素胞吐作用的负调节物的功能(Poy，M.N.等人，Nature 432:226-30(2004))。我们的数据表明，该微小RNA在人正常胰腺以及腺泡细胞和内分泌肿瘤中表达。但是，发现在胰岛素瘤和无功能的内分泌肿瘤之间其表达水平没有差异。
我们还测定了微小RNA表达是否与PET的临床特征相关联。我们的结果表明，miR-21过表达与增强的Ki-67增殖指数和肝转移有关。已经在几种癌症中观察到miR-21过表达，包括成胶质细胞瘤、乳腺癌、肺癌和结肠癌(Caldas，C.等人，Nat.Med.11:712-14(2005)；Croce，C.M.，和G.A.Calin，Cell 122:6-7(2005))。在成胶质细胞瘤细胞系中的击倒(knockdown)实验也支持了miR-21的癌症相关功能，表明该微小RNA具有抗细胞凋亡功能(Chan，J.A.等人，Cancer Res.65:6029-33(2005))。在这方面，发现推定地被miR-21靶向的程序性细胞死亡4(PDCD4)基因在转移性和高增殖性PET样品中显著减量调节，表现出与miR-21表达的负相关。已经报道该基因通过激活p21wafl和抑制转录因子复合物AP-1来起肿瘤抑制基因的作用；所述转录因子复合物AP-1控制已经参与细胞侵袭和转移进展的基因(Jansen，A.P.等人，Mol.Cancer Ther.3:103-10(2004))。此外，PDCD4表达在肺、乳房、结肠和前列腺癌的进展性癌中丧失(Goke，R.等人，Am.J.Physiol.Cell Physiol.287:C1541-46(2004))，值得注意地，还已经在神经内分泌肿瘤细胞模型中报道了PDCD4的肿瘤抑制基因作用(Goke，R.等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.1014:220-21(2004))。
PET中差异表达的微小RNA表现出在染色体臂中非随机分布，大多数位于染色体臂5q，7q，13q和19p的微小RNA是过表达的。该发现可能是由于多顺反子簇中微小RNA的频繁结合(Baskerville，S.和D.P.Bartel，RNA 11:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，NucleicAcids Res.33:2697-2706(2005))或含有这些微小RNA的染色体臂的扩增。我们的分析表明，在PET中这2种现象都可能涉及。实际上，在簇内微小RNA对之间测得的相关系数与在簇外微小RNA对之间测得的相关系数显著不同。这些数据证实在PET中分组微小RNA基因显示出协同表达的普遍观察结果(Baskerville，S.和D.P.Bartel，RNA11:241-47(2005)；Altuvia，Y.等人，Nucleic Acids Res.33:2697-2706(2005))。
微小RNA通过靶向特异性mRNA进行降解或翻译抑制，发挥它们的生物学作用。为了了解在胰腺肿瘤中表现出改变的表达的最令人感兴趣的微小RNA(例如miR-103/miR-107，miR-155，miR-204/miR-211和miR-21)的生物学牵涉，我们搜索了在通过3种不同算法鉴别出的靶物中共有的预测靶物(参见结果)。然后，为了评价微小RNA的表达和它们的预测靶物的表达之间是否存在关联，我们利用了相同肿瘤和正常样品的EST表达谱。在我们的EST微阵列中含有的选择的靶物中，我们发现了几种增量调节的和减量调节的基因。令人感兴趣地，miR-103/107的预测的靶基因比预期更频繁地过表达。该发现与Babak等人的发现一致，Babak等人报道了在一组17种不同小鼠组织中微小RNA表达和它们的预测mRNA靶物之间的低关联(Babak，T.等人，RNA10:1813-19(2004))。这支持了目前偏好的模型，即大多数微小RNA更可能通过翻译抑制起作用，而不发生mRNA降解(Bartel，D.P.，Cell116:281-97(2004))。
总之，本文所述的结果暗示，微小RNA表达的改变与内分泌和腺泡致瘤性转化和恶性进展有关。
未明确引作参考的本文引述的所有出版物的相关教导通过参考引用整体并入本文。另外，在本文中通过特定登记号标识的核苷酸序列(例如微小RNA核苷酸序列)也通过参考引用整体并入本文。尽管参考其优选实施方案已具体地显示和描述了本发明，但本领域技术人员将理解其中可进行形式和细节上的不同变化，而不偏离所附权利要求包括的本发明的范围。
权利要求
1.诊断受试者是否患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变，指示着受试者患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中。
2.权利要求1的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
3.权利要求2的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
4.权利要求2的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-103，miR-107和其组合。
5.权利要求2的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-23a，miR-26b，miR-192，miR-342和其组合。
6.权利要求1的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
7.权利要求6的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
8.权利要求6的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-155。
9.权利要求1的方法，其中:
所述至少一种miR基因产物是miR-103，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节；
所述至少一种miR基因产物是miR-107，与对照样品相比，它在测试样品中被增量调节；和/或
所述至少一种miR基因产物是miR-155，与对照样品相比，它在测试样品中被减量调节。
10.权利要求1的方法，其中所述胰腺癌选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)，胰腺腺泡细胞癌(PACC)和胰岛素瘤。
11.诊断受试者是否患有胰腺腺泡细胞癌(PACC)或处于发生胰腺腺泡细胞癌(PACC)的风险中的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变，指示着受试者患有PACC或处于发生PACC的风险中。
12.权利要求11的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
13.权利要求12的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-25，miR-200c，miR-335，miR-21，miR-103-1，miR-92-1，miR-181b-2，miR-191，miR-93，miR-26a-1，miR-17，miR-20，miR-107，miR-26b，miR-215，miR-92-2，miR-192，miR-342，miR-100，miR-3p21-v，miR-106a，miR-15a，miR-23a，miR-181b-1，miR-128b，miR-106b，miR-194-1，miR-219-1，miR-242和其组合。
14.权利要求11的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
15.权利要求14的方法，其中所述至少一种miR基因产物选自:miR-218-2，miR-339，miR-326，miR-34c，miR-152，miR-138-2，miR-128a和其组合。
16.诊断受试者患有的胰腺癌的类型的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中的所述miR基因产物的水平的改变，指示着胰腺癌的类型。
17.权利要求16的方法，其中所述胰腺癌的类型选自:胰腺内分泌肿瘤(PET)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。
18.权利要求17的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
19.权利要求17的方法，其中所述胰腺癌的类型是胰腺内分泌肿瘤(PET)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。
20.权利要求17的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
21.权利要求20的方法，其中所述胰腺癌的类型是胰腺腺泡细胞癌(PACC)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-99b，miR-125b-1，miR-342，miR-130a，miR-100，miR-132，miR-129-2，miR-125b-2和其组合。
22.权利要求16的方法，其中所述胰腺癌的类型选自:分化良好的内分泌癌(WDEC)和胰腺腺泡细胞癌(PACC)。
23.权利要求22的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
24.权利要求22的方法，其中所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-125a，miR-99a，miR-132和其组合。
25.权利要求22的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平小于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
26.权利要求25的方法，其中所述胰腺癌的类型是分化良好的内分泌癌(WDEC)，且所述至少一种miR基因产物是miR-148a。
27.权利要求16的方法，其中所述胰腺癌的类型选自:胰岛素瘤和无功能的胰腺内分泌肿瘤(NF-PET)。
28.权利要求27的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
29.权利要求27的方法，其中所述胰腺癌的类型是胰岛素瘤，且所述至少一种miR基因产物选自:miR-204，miR-203，miR-211和其组合。
30.确定患胰腺癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中:
所述miR基因产物与胰腺癌的不良预后有关；且
与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平的改变，指示着不良预后。
31.权利要求30的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
32.权利要求31的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
33.权利要求31的方法，其中所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。
34.确定受试者的胰腺癌是否是转移性的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中:
所述miR基因产物与转移有关；且
与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平的改变，指示着转移。
35.权利要求34的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
36.权利要求34的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
37.确定受试者的胰腺癌是否具有高增殖指数的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中:
所述miR基因产物与高增殖指数有关；且
与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平的改变，指示着高增殖指数。
38.权利要求37的方法，其中测试样品中所述至少一种miR基因产物的水平大于对照样品中的相应的miR基因产物的水平。
39.权利要求37的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-21。
40.确定患胰腺癌的受试者的预后的方法，其包括测量来自所述受试者的测试样品中PDCD4的水平，其中与对照样品中的相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中PDCD4的水平的改变，指示着不良预后。
41.权利要求40的方法，其中测试样品PDCD4的水平小于对照样品中PDCD4的水平。
42.权利要求40的方法，其中所述胰腺癌伴随着转移和/或高增殖指数。
43.诊断受试者是否患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中的方法，其包括:
(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供测试样品的杂交谱；和
(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱，
其中至少一种miRNA的信号的改变指示着受试者患有胰腺癌或处于发生胰腺癌的风险中。
44.权利要求43的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号被增量调节。
45.权利要求43的方法，其中与从对照样品产生的信号相比，至少一种miRNA的信号被减量调节。
46.权利要求43的方法，其中所述微阵列包含对于选自以下的一种或多种miRNA的miRNA-特异性探针寡核苷酸:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375，miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
47.诊断受试者是否患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中的方法，其包括:
(1)从获自受试者的测试样品逆转录RNA，以提供一组靶寡脱氧核苷酸；
(2)使靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交，以提供所述测试样品的杂交谱；和
(3)对比测试样品杂交谱与从对照样品产生的杂交谱，
其中信号的改变指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。
48.权利要求47的方法，其中miR-21信号的变化指示着受试者患有不良预后的胰腺癌或处于发生不良预后的胰腺癌的风险中。
49.治疗患有胰腺癌的受试者的胰腺癌的方法，其中与对照细胞相比，受试者癌细胞中的至少一种miR基因产物被减量调节或增量调节，其包括:
(1)当所述至少一种miR基因产物在癌细胞中被减量调节时，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，条件是，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1，从而抑制受试者中癌细胞的增殖；或
(2)当所述至少一种miR基因产物在癌细胞中被增量调节时，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。
50.权利要求49的方法，其中步骤(1)中所述至少一种分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
51.权利要求49的方法，其中步骤(2)中所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
52.治疗受试者的胰腺癌的方法，其包括:
(1)测定与对照细胞相比，胰腺癌细胞中至少一种miR基因产物的量；和
(2)通过下述方式，改变在胰腺癌细胞中表达的miR基因产物的量:
(i)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量小于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，条件是，所述miR基因产物不是miR-15a或miR-16-1；或
(ii)如果在癌细胞中表达的miR基因产物的量大于在对照细胞中表达的miR基因产物的量，给受试者施用有效量的至少一种用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的化合物。
53.权利要求52的方法，其中步骤(i)中所述至少一种分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
54.权利要求52的方法，其中步骤(ii)中所述至少一种miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
55.用于治疗胰腺癌的药物组合物，其包含至少一种分离的miR基因产物、或其分离的变体或生物活性片段，和药学上可接受的载体。
56.权利要求55的药物组合物，其中所述至少一种分离的miR基因产物对应于相对于对照细胞在胰腺癌细胞中减量调节的miR基因产物。
57.权利要求56的药物组合物，其中所述分离的miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
58.用于治疗胰腺癌的药物组合物，其包含至少一种miR表达抑制剂化合物和药学上可接受的载体。
59.权利要求58的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑制剂化合物是对相对于对照细胞在胰腺癌细胞中增量调节的miR基因产物特异性的。
60.权利要求59的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑制剂化合物是对选自下述的miR基因产物特异性的:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
61.鉴定抗胰腺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中降低的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平，其中与对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的增加，指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。
62.权利要求61的方法，其中所述miR基因产物选自:miR-326，miR-155，miR-339，miR-34c，miR-345，miR-152，miR-372，miR-128a和其组合。
63.鉴定抗胰腺癌剂的方法，其包括给细胞提供测试试剂，并测量与胰腺癌细胞中增加的表达水平有关的至少一种miR基因产物的水平，其中与对照细胞相比，所述细胞中所述miR基因产物的水平的降低，指示着测试试剂是抗胰腺癌剂。
64.权利要求63的方法，其中所述miR基因产物选自:miR-103-2，miR-107，miR-103-1，miR-342，miR-100，miR-24-2，miR-23a，miR-125a，miR-26a-1，miR-24-1，miR-191，miR-15a，miR-368，miR-26b，miR-125b-2，miR-125b-1，miR-26a-2，miR-335，miR-126，miR-1-2，miR-21，miR-25，miR-92-2，miR-130a，miR-93，miR-16-1，miR-145，miR-17，miR-99b，miR-181b-1，miR-146，miR-181b-2，miR-16-2，miR-99a，miR-197，miR-10a，miR-224，miR-92-1，miR-27a，miR-221，miR-320，miR-7-1，miR-29b-2，miR-150，miR-30d，miR-29a，miR-23b，miR-135a-2，miR-223，miR-3p21-v，miR-128b，miR-30b，miR-29b-1，miR-106b，miR-132，miR-214，miR-7-3，miR-29c，miR-367，miR-30c-2，miR-27b，miR-140，miR-10b，miR-20，miR-129-1，miR-340，miR-30a，miR-30c-1，miR-106a，miR-32，miR-95，miR-222，miR-30e，miR-129-2，miR-345，miR-143，miR-182，miR-1-1，miR-133a-1，miR-200c，miR-194-1，miR-210，miR-181c，miR-192，miR-220，miR-213，miR-323，miR-375和其组合。
全文摘要
本发明提供了用于胰腺癌的诊断、预后和治疗的新的方法和组合物。本发明也提供了鉴定抗胰腺癌剂的方法。
文档编号C12Q1/58GK101384273SQ200780005791
公开日2009年3月11日 申请日期2007年1月3日 优先权日2006年1月5日
发明者C·M·克罗斯, G·A·卡林 申请人:俄亥俄州立大学研究基金会