选择和稳定dsRNA构建体的制作方法

专利名称：选择和稳定dsRNA构建体的制作方法
选择和稳定dsRNA构建体
背景技术：
本发明主张2006年2月13日递交的美国临时专利申请60/772,736的 优先权，其通过引用整体导入本文。
1. 发明领域
本发明涉及RNAi构建体在植物中的稳定表达以使得能够对植物病 原体和害虫(pest)进行基因控制。本发明提供用于提高源自该构建体的 dsRNAs效力的方法和组合物。
2.
背景技术：
当互补双链RNA (dsRNA)短链存在于活细胞或被导入活细胞时， 当dsRNA和靶基因转录本之间具有核酸序列相似性的区域时，可特异地 影响"把"基因的表达。该RNA分子可包括由"间隔"区分开的互补序列以 便形成RNA的双链区。dsRNA可被称作二聚RNaseIII核糖核酸酶(也称 作"dicer"酶)的酶切割成长度约21-25碱基对的节段；称作siRNAs ("短 干扰RNAs"(short interfering RNAs)或"小干扰RNAs，，) 。 siRNA在RNA國 诱导的沉默复合体("RISC")中产生特异的RNAse活性以水解粑基因 mRNA,从而转录后抑制耙基因的表达。只有与siRNA互补的转录本被 切开并降解，因此该作用(有时也称作RNA干扰(RNA interference, RNAi))是基因特异的。在许多生物包括秀丽线虫(Cae"oWzaZ^^ e/egara ) fFire等,1998 ), 果绳(Z)myo/ /z/A3me/awoga他r ), 昆虫包 括鞘翅目(Co/ec^era) (Bucher等，2002 )和鳞翅目(Z^/7Wo/7&ra, (Uhlirova等，2003; Bettencourt等，2002 )，真菌(Cogoni等，2000)， 和植物例如拟南芥(Jra6,'^;^W/^/&^)等之中，已使用RNAi特异性 地打断基因表达。存在于植物中的dsRNA还可引导耙定的染色质区的 DNA甲基化，导致基因沉默(例如Wassenegger等，1994; Carthew, 2001; Zilberman等,2004 )。
有效使用RNAi导致特定耙基因表达的抑制，因此RNAi构建体在转 基因作物中的稳定表达可以允许对害虫控制的新型基因方法。然而，尽 管由植物中原位U" / /a"ta)转基因产生的dsRNA耙向另一生物，但可 引起植物中的原位应答，例如转基因转录本的切开("切割")，以及转
基因宿主植物中同源转基因的沉默。这些应答可减少或消除dsRNA产生 并因此减少或消除其对耙生物的效力。
设计(Wesley等，2001; Yuan等，2004; Reynolds等，2004; Arziman 等，2005 )。在一些生物中，sRNA ("小RNA")分子(包括dsRNA) 的全身转运机制是已知的(例如Voinnet 2005 ),并且已知被转运的核 糖核苷酸序列对其摄入效率起作用(Winston等，2002 )。例如，秀丽线 虫(C. e/eg"ra)需要长度约100个碱基对(bp)的dsRNA以例如通过SID l蛋白丰裕地(productively)摄入至肠细胞(Feinberg和Hunter, 2003 ), 而WO9953050描述了在间隔区包括内含子序列的dsRNA构建体。然而， 导致对抗把害虫的活性dsRNA的优化生产、稳定化和摄入，而同时保证 编码该dsRNA的转基因的稳定表达，并避免宿主细胞中转基因沉默的参 数并未理解清楚。因此需要保证特异的、有效的dsRNA-编码转基因在植 物内的稳定转录，以及该生成的dsRNA的随后的转运及摄入，以在耙植 物病原体和害虫物种中产生有效且特异的基因抑制。


下述附图形成本说明书的 一部分并^皮包括以进一步说明本发明的某 些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文呈现的具体实 施方式的详细说明可更好地理解本发明。
图1A-1B: 100bp的Dv49靶标节段与来自其它代表多个属、目和门 的生物的相关序列的比对。不同于Dza^o"ca Wrg,/era Wrgz/era ( Dv49 ) 的序列被突出。Dv49概念性翻译的氨基酸比对(a.a.)在核苦酸序列下 示出。对Dv49序列计算Reynolds分数并在氨基酸比对下示出-分数位置对 应于反义链21 mer的核苷酸19。在Reynolds分数下显示来自嵌入的26mer 效力筛查(scan)的数据。可从各筛查节段产生的可能21mer被加上下划 线，每个筛查节段下示出在人工的饮食生物检测中饲以0.2ppm每种嵌入 节段时产生的WCR死亡率。*与未处理对照显著不同，P值0.05， Planned Contrasts 。
图2:与多D&^o"ca spp.比对的来自Na/K-交换ATPase (推定的 Drosophila基因，CG9261,直系同源物)的编码序列的节段。符合群共 有性(group consensus)的序列被框出并且加阴影。测序显示在一些情况下
存在等位基因(例如NCR序列位置49处的"R")。
图3:利用559bp的Dv26节段和DNASTAR软件包中的ClustalW算法 (Madison, WI)确定的系统发育树。
图4:降低基因转录本和生成的dsRNA转录本之间的直接连续序列
同一性的转基因的设计。转录单元可以由来自非丰裕地(productively)
掺入RISC的siRNAs的合成序列终止。
图5:用于在指定位点插入表达盒的小的有效dsRNA节段。
图6:用于在WCR饮食生物检测中作为dsRNA分析的300 bp
D/Wra"cav,>g,y^aV-ATPase A亚基节段。UTC二未处理对照。EST-缺
少片段l和2的短V-ATPase A亚基cDNA克隆。
图7:以lppm饲食时Dv^嵌入的约^mer效力筛查。
图8:以0.2ppm饲食时Dv^嵌入的约2Gmer效力筛查。
图9:以21mers筛查的Dv49筛查14 27mer节段并在0.2ppm检测效力。
发明概述
一方面，本发明提供获得提供所需靶基因抑制水平的核酸节段 (segment)的方法，包括a)获得与耙基因基本上互补的起始核酸分子； b)由起始核酸分子制备多个核酸节段；c)当核酸节段在包括该靶基因 的细胞中作为dsRNA表达时，检测其抑制靶基因表达的能力；和d)从 在作为dsRNA表达时提供所需靶基因抑制水平的多个核酸节段中鉴定 至少第一核酸节段。在该方法中，核酸节段可包括约21至约26个所述起 始核酸分子的连续核苷酸部分，包括约22、 23、 24和25个核苷酸部分。 在某些实施方式中，节段包括所述起始核酸分子的重叠部分而在具体实 施方式中可能是邻近节段。另外的实施方式中，核酸节段可定义为包括 约0.1%至约98%的所述靶基因，例如包括约0.2%、 0.4%、 0.75%、 2%、 5%、 10%、 15%、 25%、 40%、 60%、 75%和90%。
在发明的一个实施方式中，可根据核酸节段作为dsRNA表达时获得 的粑基因抑制水平对所述核酸节段分等(rank)。所需的耙基因抑制水平可 以是所述靶基因表达的约1%至约100%的抑制。某些实施方式中，所需 的抑制水平可以是靶基因的完全抑制或不完全抑制。
具体实施方式
中， 靶基因可以是植物、昆虫、真菌、细菌或脊推生物，包括作物害虫(crop pest)或病原体基因。检测核酸节段抑制靶基因的能力可包括在包含该靶
个实施方式中，这可包括计算核酸节段的Reynolds分数。另一实施方式 中，检测核酸节段抑制靶基因的能力包括在包含该耙基因的生物的饮食 中以dsRNA分子提供所述节段并确定该耙基因的抑制水平。确定耙基因 的抑制水平可包括观察所述生物的发病率、死亡率或生长迟緩(stunting)。
另一方面，本发明提供在细胞中抑制粑基因表达的方法，包括a)根 据本文提供的方法获得核酸节段；和b)将由核酸表达的dsRNA提供至 包含该靶基因的宿主细胞以抑制耙基因的表达。在该方法中，提供由核 酸节段表达的dsRNA至宿主细胞可包括在宿主细胞中以正义和反义方 向表达核酸节段。提供由核酸节段表达的dsRNA至宿主细胞可包括提供 包括ds RNA的饮食至细胞或包括该细胞的生物并允许细胞摄入该 dsRNA。在一个实施方式中，宿主细胞是害虫细胞并且提供由核酸表达 的dsRNA至害虫细胞包括在植物细胞中表达该dsRNA并允许包括该细 胞的害虫以该植物细胞为食。
具体实施方式
中，通过对所述细胞或包括 该细胞的害虫的表型效应显示害虫细胞中乾基因表达的抑制。该表型效 应可以是程序性细月包死亡。
又一方面，本发明提供调节生物中至少第一基因表达的方法，包括 (a )将由本发明的方法获得的至少第 一核酸节段作为dsRNA提供至所述 生物，其中所述dsRNA节段在所述生物中对所述基因特异；和(b)观 察所述生物的表型效应。在该方法中，所述表型效应可选自由营养生长 停止、生殖生长停止、摄食停止、死亡率、发病率、生长迟緩、瘫痪、 有性生殖抑制、蛻皮抑制、不能飞行和不能从蛹期羽化(failuretoemerge from pupal stage)组成的组。
又一方面，本发明提供用于调节植物害虫中基因表达水平的方法， 包括在所述害虫的饮食中提供至少第一dsRNA分子，并观察所述害虫中 一种或更多种基因抑制的表型效应(phenotypic effect),其中所述dsRNA 分子由显示与所述害虫的一种或更多种必要基因的相应DNA序列基本 上同源的核苷酸序列产生，并且其中所述核苷酸序列是根据本文提供的 方法鉴定的核酸节段。
又一方面，本发明提供用于抑制植物害虫侵染(infestation)的方法，
该植物或其部分或其组织至一种或更多种包括所述核苷酸序列的害虫，
以及观察所述生物中的表型效应，其中该表型效应足以抑制所述害虫侵 染所述转基因植物。
又一方面，本发明提供保护植物免于害虫侵染的方法，包括在转基
因植物中表达根据本发明获得的dsRNA分子并提供该植物或其部分或 其组织至一种或更多种包括所述核普酸序列的害虫，以及观察所述生物 中的表型效应，其中该表型效应足以抑制所述害虫侵染所述转基因植物。 本发明还提供根据本文所述任意方法被保护免于害虫侵染的植物，以及 从该细胞中再生的植物，还有从该植物产生的种子或后代，其中所述种 子或后代包括根据本发明获得的核苷酸序列。
又一方面，本发明提供生产用于在植物细胞中表达具有降低的转基 因沉默的dsRNA的表达构建体的方法，包括(a)制备包括第一序列、 第二序列和第三多核苷酸序列的表达构建体，其中第三多核苷酸序列通 过第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列相连并且第三多核苷酸序列基
本上是第一多核苷酸序列的反向互补物；和(b)导入内含子至第一和第 三多核苷酸序列的至少一个中或导入所述表达构建体至内含子中，其中 第一和笫三多核苷酸序列在转录成RNA时杂交并在内含子剪接后形成 由第二多核苷酸序列稳定的dsRNA分子，其中表达构建体在用该表达构 建体转化的植物细胞中相比于缺乏该内含子的表达构建体显示降低的转 基因沉默。 一个实施方式中，内含子导入第一和第三多核苷酸序列的至 少一个之中。另一实施方式中，内含子导入第一和第三多核苷酸序列。 在另外的实施方式中，表达构建体导入内含子中。
又 一 方面，本发明提供控制靶作物害虫或病原体或其后代对植物的 摄食的方法，包括将利用本文公开的任何方法制备的表达构建体导入植 物。该构建体可例如通过直接遗传转化或通过亲本植物和/或祖细胞的转 化而导入。本发明还提供根据本文公开的任何方法制备的表达构建体。 再进一步提供由本文公开的表达构建体转化的转基因植物和植物细胞。
又 一 方面，本发明提供提高dsRNA的害虫或病原体-抑制活性的方 法，包括(a)获得起始核酸分子，其在作为dsRNA表达并被耙作物害 虫或病原体摄入时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和(b) 连接第一核酸节段至第二核酸节段以产生更长的核酸节段，其中第二核 酸节段是在作为dsRNA表达时不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代 摄食的核酸，且其中相比于单从第一核酸节段表达的dsRNA，由更长的
核酸表达的dsRNA显示对于靶作物害虫或病原体或其后代摄食的提高 的抑制效力。 一个实施方式中，通过下述方法获得第一核酸节段，包括 步骤I)获得第一核酸节段，其在作为dsRNA表达并被靶作物害虫或病 原体摄入时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；II)选择至少 起始核酸分子的第一部分，其在摄入由所述部分表达的dsRNA后抑制由 靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；和III)使用该部分作为步骤a)所 述的第一核酸节段。该起始核酸分子可以是cDNA。 一个实施方式中， 步骤II)包括从起始核酸分子制备一系列重叠或连续部分并从所述部分 鉴定至少第一部分，其在作为dsRNA表达并由靶作物害虫或病原体摄入 时抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。
在具体实施方式
中，提高dsRNA的害虫或病原体抑制活性的方法可 进一步包括产生包括笫一、第二和第三多核苷酸序列的重组载体，其中 第一多核苷酸序列包括更长的核普酸节段而其中第三多核苷酸序列通过 第二多核苷酸序列与第一多核苷酸序列相联，其中第三多核苷酸序列基 本上是第一多核苷酸序列的反向互补物，从而第一和第三多核苷酸序列 在转录成核糖核酸时杂交以形成被连接的第二核糖核苷酸序列所稳定的 双链核糖核苷酸分子。在具体实施方式
中，第二核苷酸节段不与靶作物 害虫或病原体的核苷酸序列基本上互补。另外的实施方式中，第一核酸 节段和第三核酸节段之一或二者包括内含子。该方法还可包括导入内含 子至所述第一核酸节段。另外的实施方式中，第一核酸节段可包括约19 至约80,约19至约50和约21至约30个与耙作物害虫或病原体的编码序列 基本上互补的连续碱基。更长的核酸节段可包括至少约80个碱基，包括 至少约100个碱基和约80bp至约250个碱基。 一个实施方式中，耙作物害 虫或病原体是昆虫并且可以是鞘翅目(coleopteran )、鳞翅目 (lepidopteran)、 同翅目(Homopteran)或半翅目(Hemipteran),例 如D/a6n3"ca 。在其它实施方式中，革巴作物害虫或病原体是线虫 (nematode)。
另 一方面，本发明还提供生产用于表达具有提高的害虫或病原体抑 制活性的特异性的dsRNA的表达构建体的方法，包括(a)获得与粑作 物害虫或病原体至少第 一编码序列基本上互补的起始核酸分子；(b )在 起始分子内选择这样的区域，其在靶作物害虫或病原体或其后代摄入由 该区域表达的dsRNA后，抑制靶作物害虫或病原体或其后代的摄食；(c )
连接该区域至第二核酸分子以产生表达构建体，其中第二核酸分子在作
为dsRNA表达时，不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代在摄入该 dsRNA后的摄食。该方法使用的起始核酸分子可以是来自靶作物害虫或 病原体(例如昆虫或线虫)的cDNA。
具体实施方式
中，昆虫可以是鞘 翅目、鳞翅目、同翅目或半翅目昆虫，包括选自由下述组成的组的昆虫 Z). vz>gz/enat v/广gz/en2; Z). v/尸gzy^nat ; Z). wwt^ec/^7/ wwc^a^a; Z). 6a/feafa; Z). 6aMen';和Z). ^ecz'osa。另外的实施方式中，第一核酸节段可包括约 19至约80，约19至约50和约21至约30个基本上与靶作物害虫或病原体的 编码序列互补的连续碱基。更长的核酸节段可包括至少约80个碱基，包 括至少约100个碱基和约80bp至约250个碱基。
本发明的又一方面提供方法，包括在起始分子中筌定至少第二区域， 其在作为dsRNA表达时，抑制由耙作物害虫或病原体或其后代的摄食， 并连接该第二区域至第二核酸分子或第三核酸分子，其在作为dsRNA表 达，并随后被靶作物害虫或病原体摄入由第三核酸分子表达的dsRNA 时，不抑制由靶作物害虫或病原体或其后代的摄食。 一些实施方式中， 该区域与非靶作物害虫或病原体的核酸不是基本上互补(is not substantially complementary)。其它实施方式中，该区域与革巴作物害虫或 病原体被分类入其中的种特有的核酸互补。其它实施方式中，该区域与 靶作物害虫或病原体被分类入其中的属特有的核酸互补。其它实施方式 中，该区域是D/a6ra"ca spp.特有的，包括那些选自由Z)&Z^o"ca wwc/e"'w/ wwc似fa/zowaniz'z'(南部玉米才艮虫(SCR ) ) 、 Z)/a6ro〃'ca vz'rgz/era w>gz/em (西部玉米才艮虫(WCR) ) 、 Z)&Z^o"ca 6w6en'(北部玉米才艮 虫(NCR) ) 、 Z)/a6ra"cavz>gz/eraMae (墨西哥玉米才艮虫(MCR))、 D励ro"'ca 6a/feaM、 Z)励n^ca vWc/w/(3和Z)^^c^ca《/ ec/osa (巴西玉 米根虫(BZR))组成的组。
另 一方面，本发明提供控制由靶作物植物害虫或病原体或其后代摄 食植物的方法，包括向植物中导入表达构建体或由前述方法制备的 dsRNA。本发明还提供转化有前述方法制备的表达构建体的植物细胞。
又 一 方面，本发明提供提高植物中对靶作物害虫或病原体的控制的 方法，包括在植物的细胞中表达至少两dsRNA序列，其在^皮害虫或病原 体摄入时发挥作用以抑制耙作物害虫或病原体中至少第 一耙编码序列的 表达，其中两dsRNA序列与第 一靶编码序列的两非连续部分或靶作物害
虫或病原体的两不同编码序列基本上互补。另外的实施方式中，本发明
提供方法，其中两dsRNA序列包括长度约19bp至约80bp,或约19bp至约 50bp，或约21bp至约30bp。另一实施方式中，两dsRNA序列与靶作物害 虫或病原体的至少两靶编码序列基本上互补。本方法还可包括在植物细 胞中表达至少第三dsRNA序列，其在由害虫或病原体摄入时发挥作用以 抑制耙作物害虫或病原体中第三把编码序列的表达，其中第三dsRNA序 列与第三粑编码序列的一部分基本上互补。其它实施方式中，提供了方 法，其中两dsRNA序列/人选自起始核酸分子(其在作为dsRNA表达随后 被耙作物害虫或病原体摄入dsRNA时，抑制由靶作物害虫或病原体或其 后代的摄食)的区域所表达。该起始核酸分子还可是来自靶作物害虫或 病原体的cDNA。
其它实施方式中，提供的方法还包括在细胞中表达选自由马铃薯块 茎蛋白(patatin)、 苏云金芽孢杆菌(5ac/〃w f/mn力gz'eww、 j杀虫蛋白、 X(gnor/za6c/ws杀虫蛋白、尸/zofor/ia6c/ws杀虫蛋白、Sac"/us /a^os/ orus杀 虫蛋白和^ "〃m ^/ /^en'c2^杀虫蛋白组成的组的多核苷酸序列。其它实 施方式中，示例性的多核苷酸可编码选自由Cryl、 Cry2、 Cry3组成的组 的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白，或选自由TIC851、 CryET70、 ET29组成的 组的鞘翅目毒蛋白，双价杀虫蛋白(binary insecticidal protein)CryET33和 CryET34,双价杀虫蛋白CryET80和CryET76,双价杀虫蛋白ET29和 TIC810,双价杀虫蛋白TIC100和TIC101和双价杀虫蛋白PS149B1或其它 鞘翅目毒蛋白(例如deMaagd等，2003 )。其它针对控制其它植物害虫 的杀虫组合物是可能的，例如，如在下述网址lifesci.sussex.ac.uk/home/ Neil一Crickmore/Bt/index.html中罗列的全部毒素，并且也可以包括如其 中所述的一种或更多种VIP毒素。因此，某些实施方式中，控制剂(control agent)的组合包括一种或更多种本发明的表达dsRNA的多核苷酸以及至 少一种对植物害虫(例如昆虫或线虫)有毒性的其它试剂。
本发明还提供方法，其中靶编码序列编码蛋白，其预测的功能选自 由肌肉生成、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、消化酶 的合成、细胞膜电势的维持(maintenance of cell membrane potential)、才聂 食部位的形成、摄食部位的发育、摄食部位的维持、感染、蜕皮、氨基 酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信息素感应、触角 形成、翼形成、腿形成、发育及分化、卵形成、幼虫成熟、消化酶形成、
血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、细胞分裂、能量代谢、呼吸和凋 亡组成的组。另一实施方式中，本发明提供方法，其中两编码序列被粑
向。该两耙编码序列可刊"使至少两种对于4皮dsRNA序列抑制的#巴作物害 虫或病原体存活所必需的功能，该功能选自由害虫或病原体摄食、细胞 凋亡、细胞分化和发育、有性生殖的能力或欲望、肌肉生成、肌肉抽搐、 肌肉收缩、保幼激素形成、保幼激素调节、离子调节和转运、细胞膜电 势的维持、氨基酸生物合成、氨基酸降解、精子生成、信息素合成、信 息素感应、触角形成、翼形成、腿形成、卵形成、幼虫成熟、消化酶形 成、血淋巴合成、血淋巴维持、神经传递、幼虫期过渡(larval stage transition)、蛹4匕、从蛹羽4匕(emergence from pupation)、细胞分裂、能量 代谢、呼吸和细胞骨架结构的形成组成的组。
本发明还提供抗性管理的方法，包括使耙生物接触至少本发明的笫 一核酸节段，以及选自由马铃薯块茎蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、 ^^wor/^Z^z^y杀虫蛋白、尸/zo/or/^6(iws杀虫蛋白、5ac/〃ws /a^ro^s/7orz^y杀 虫蛋白 、 5ac/〃ws s/ /2aen'cws 杀虫蛋白、 或 io 网 i止 lifesd.sussex.ac.uk/home/Neil—Crickmore/Bt/index.html所述的其它杀虫 Bt毒素、生物控制剂和杀虫剂组成的组中的一种或更多种试剂。
发明详细说明
本文描述了用于提高调节植物害虫和病原体中基因表达的dsRNA 分子的效力和表达的方法和组合物。该方法提高由编码dsRNA的植物转 基因产生的小干扰RNA (siRNA)或相关节段的特异性，并提供植物害 虫和植物病原体中dsRNA-介导的耙基因表达抑制。优化转基因构建体和 转基因序列大小以生产并递送在特定靶物种的细胞中有效的一种或更多 种核糖核苷酸，而避免产生相反可能以不想要的方式调节基因表达的非 特异性siRNAs。同时，通过优化靼序列的排列，本发明通过用内含子打 断连续的靶序列降低了植物中转基因沉默的可能，从而防止识别该基因 并导致植物中沉默的反馈。
特异靶向害虫或病原体种的序列可工程化入植物表达构建体，例如 用反向重复的那些方法或通过使用诱发dsRNA形成的其它方法。利用克 隆siRNA或利用通过呈递dsRNA片段至筛查(scan)耙序列的细胞或整 个害虫而凭经验确定，可以确定有效导致耙信息(message)降解的21 -24mers 。使用该信息，可以产生用于植物内原位表达的新型序列结构。 该序列结构可以进一步设计以产生dsRNA分子，其编码一种或更多种净皮 耙物种有效摄入的siRNA分子，同时导致形成对调节耙物种中耙基因的 特定直系同源物、同系物或等位基因表达特异的siRNAs。基于基因家族 成员间序列多态性，通过设计靶向该成员的dsRNA构建体可抑制基因家 族特定成员的表达。因此，基于其对特定耙种、群或亚群凭经验确定或 预测的效力，dsRNA构建体中可包括特定耙序列(例如siRNA大小的 (siRNA-sized)，长度约20-25个碱基对)，并且可不包括特异性差或非特 异序列，而仍旧实现将有效的转基因编码的dsRNA转运至靶生物的细 胞。特异siRNA大小的核糖核酸序列的效力可以通过生物^f全测法的实际 评估或通过使用考虑生物物理参数(对于有效或无效siRNAs是相同的) 的预测工具(例如Reynolds评分；Reynolds等，2004)而确定。
对用外源性(例如转基因植物产生的)RNA靶向害虫种所需的特定 要求的理解提高生产高效且特异的转基因构建体的能力。在西部玉米根 虫(WCR)中，确定WCRV-ATP酶A亚基的50bp片段在串联重复5次(总 计250bp)时足以诱发死亡，但作为50bp单体则是无效的。该50bp片段 嵌入中性载体序列以产生1 OObp的总dsRNA也是有效的。因此对于高效 摄入至RNAi易感生物存在最优大小。该观察指明对于害虫控制需要"稳 定"近似大小的dsRNA的产生。
使用载体概念，可以在更长序列中嵌入一种或更多种siRNA序列用 于转录。该序列可用于证明任何候选siRNA (独立于相邻的天然发生序 列)的效率，允许在设计编码dsRNA的转基因构建体时提高灵活性。天 然发生的相邻序列(其证明效力或特异性更差)可从dsRNA构建体除去， 然而该构建体编码必需序列和序列长度，以便在在植物宿主内表达并在 耙生物细胞中摄取和加工后产生有效的siRNA。这一知识使得建立将编 码siRNAs的被选序列整合至高效初级表达转录本的新型嵌合序列。
利用本发明的方法设计的转基因也可具有编码siRNA序列(通过放 置内含子而打断)的dsRNA片段。耙序列中一种或更多种内含子序列的 包涵体可提高最终产生有效siRNA的初级转录本的生产和稳定性，而显 示将在植物细胞中沉默的降低的倾向。诸如5和3，非翻译区(UTRs)和 其它序列的附加序列，例如产生至少植物加工所需的最小尺寸的外显子， 可通过组合不诱发有效siRNAs的序列(例如直接串联正义序列)而产生。
导致转基因沉默(例如通过曱基化和在植物宿主细胞的最终转录沉默)
的可能性降低，因为该基因在序列上与产生siRNAs的加工的转录本(其 可相反通过染色质结构的改变造成转基因沉默)不同。初级转录本的 siRNA区中内含子的存在也可减緩整体加工并提高因此得到的dsRNA的 存活力或稳定性(图4)。
其它靶序列可通过用上述设计的多种内含子和外显子延伸该初级转 录单元而添加。有效siRNAs的重叠和在重叠内放置内含子可扩大靶序列 的数量而最小化构建体内所需内含子的数量(图5)。可以配置一种或更 多种不同的序列，每种编码siRNA (针对于一种或更多种輩巴基因的表达) 并调节粑生物中的基因表达。
两种或多种靶基因的表达抑制允许通过dsRNA-介导的基因抑制向 靶生物提供多种作用;f莫式。也可通过结合一种或更多种dsRNA-介导的方 法与诸如源自芽孢杆菌的杀虫肽(例如晶体蛋白)的其它方法在转基因 植物中实现多种作用模式以干扰耙生物的生长和发育。结合几种或多种 编码有效siRNAs的序列，可能地于其它方法结合也允许产生持久的害虫 抗性管理方案。
A、核酸组合物和构建体
本发明提供重组DNA构建体以用于实现宿主植物细胞的稳定转化。 转化的宿主细胞可表达有效水平的优选的dsRNA分子和因此来自重组 DNA构建体的siRNA以调节靶细胞中的基因表达。可从cDNA和/或基因 组文库提供分离并纯化的核普酸片段。推导的核苷酸序列信息允许鉴定 成对核苷酸序列(其可源自任何优选的无脊推害虫，例如昆虫)以用作 热扩增引物而产生本发明的dsRNA和siRNA分子。
如本文所使用，术语"核酸"指单链或双链的脱氧核糖核苦酸或核糖 核苷酸碱基的聚合物。该"核酸"也可以任选地含有非天然生成或改变的 核糖核苷酸碱基，其允许聚合酶正确通读并且不减少由该核酸编码的多 肽的表达。术语"核苷酸序列，，或"核酸序列"指单个单链或双链核酸的正 义和反义链。术语"核糖核酸"(RNA )包括RNAi (抑制性RNA ) 、 dsRNA (双链RNA) 、 siRNA (小干扰RNA) 、 mRNA (信4吏RNA) 、 miRNA (微小RNA) 、 sRNA (小RNA) 、 tRNA (转移RNA,带有或者不带有 相应的酰化氨基酸)和cRNA(互补RNA),而术语"脱氧核糖核酸"(DNA)
包括cDNA和基因组DNA以及DNA-RNA杂交体。措辞"核酸节段"、"核 苷酸序列节段"或更普遍地，"节段"(segment)将被本领域技术人员理解为 包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操 纵子序列和更小的工程化的核苦酸序列(其表达或可适于表达多核苷酸、 蛋白、多肽或肽)的功能性术语。
根据本发明提供核苷酸序列，其表达产生与靶生物中靶基因的RNA 分子基本上同源的RNA序列。因此，摄入稳定的RNA序列后，可以获得 靶生物的细胞中靶基因核苦酸序列表达的下调，导致耙生物在维持、摄 食、生存力、繁殖或再生上的有害效应。
如本文所使用，对于核酸序列的术语"基本上同源的"(substantially homologous)或"基本的同源性"(substantial homology)包括在严谨条件下 杂交至如序列表中所述的编码序列的核苷酸序列，或其互补物。在严谨
序列在严谨条件下能够与相对链上的相应碱基形成氬键以形成:^谨条 件下足够稳定至利用本领域公知的方法可检测的双链分子。基本上同源 的序列优选地具有与如序列表所述的核苷酸序列或其互补物约70%至约 80%的序列同一性，或更优选约80%至约85%的序列同一性，或更优选 约90%至约95%的序列同一性，至约99%的序列同一性。
如本文所使用，术语"序列同一性"、"序列相似性"或"同源性，，用于 描述两个或多个核苷酸序列间的序列关系。通过在对比窗比较两个优化 比对的序列确定两序列间的"序列同 一性"百分数，其中对比窗中的序列 部分相比于参照序列(其不包括添加或缺失)可包括添加或缺失(即缺 口 )用于两序列的优化比对。这样计算百分数确定在两序列中出现相 同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以获得匹配位置的数量，将该匹配位 置的数量除以对比窗中位置总数，并将结果乘以100得到序列同一性的百 分数。在比较的每个位置都与参照序列相同的序列被认为与参照序列相 同，反之亦然。如果第一多核苷酸序列显示与第二或参照序列完全互补， 则认为从5，到3，方向观察时的第一多核苷酸序列是从3，到5，方向观察时 的第二或参照核苷酸序列的互补体或与其互补。如本文所使用，当一个
序列的每个核苷酸从5，到3，阅读与其它序列的每个核苷酸从3，到5，阅读 时互补，认为核酸序列分子显示"完全互补性"。与参照核苷酸序列互补 的核苷酸序列将显示与参照核苷酸序列的反向互补序列相同的序列。这
些术语和说明在本领域^艮好地定义并且易于被本领域普通技术人员所理解。
如本文所使用，"对比窗"指至少6个连续位置的概念性节段，通常约 50至约100,更通常约100至约150个位置，其中序列与连续位置数相同 的参照序列在两序列优化比对后相比较。对比窗相比于参照序列(其不 包括添加或缺失)可包括约20%或更少的添加或缺失(即缺口 )用于两 序列的优化比对。例如本领域技术人员应参考Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, ( Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wis., USA )用于序列比对的具体方法。
本发明提供能够在细胞或微生物中表达为RNA以抑制靶生物的细 胞、组织或器官中靶基因表达的DNA序列。该序列可包括编码一种或更 多种不同核苷酸序列的DNA分子，其中不同核苷酸序列的每个包括正义 核苷酸序列和反义核普酸序列。该序列可通过间隔序列连接。该间隔序 列可组成正义核苷酸序列或反义核苷酸序列的一部分并且发现位于正义 和反义序列间的dsRNA分子内。正义核苷酸序列或反义核苷酸序列与靶 基因或其衍生物的核香酸序列或其互补序列基本上相同。dsDNA分子可 在于表达dsDNA的宿主的细胞、组织或器官中起作用的启动子序列的控 制下可操作地放置以产生dsRNA分子。如本文所使用，术语"植物表达构 建体"指重组DNA分子，其包括在植物细胞中可操作地连接至编码 dsRNA的DNA序列的功能性启动子，以及3 ，转录末端的多核苷酸分子。
本发明还提供用于在植物细胞中表达的DNA序列，其在DNA表达为 RNA并被耙生物(例如植物病原体或植物害虫)摄入时，实现靶生物的 细胞、组织或器官中的耙基因抑制。dsRNA可包括一种或更多种结构基 因序列，其中每种结构基因序列包括可以被间隔序列(其在互补正义和 反义序列内形成环)连接的正义核苷酸序列和反义核普酸序列。具有适 当剪接位点的内含子序列可置于至少正义和反义核苷酸序列之一 。没有 任何内含子存在的正义核苷酸序列或反义核苷酸序列与耙基因、其衍生 物的核苦酸序列或其互补序列基本上相同。 一种或更多种结构基因序列 可在一种或更多种启动子序列的控制下可操作地放置，至少其一在宿主 生物的细胞、组织或器官中对转录本的表达是可操作的。
根据本发明，用于控制靶生物中基因表达的基因序列或片段可克隆 于两组织特异性启动子(其在转基因细胞中是可操作的)之间，并在转
基因植物细胞中表达以产生mRNA，其与它形成dsRNA分子。植物组织 中含有的dsRNA分子可被乾生物摄入从而实现想要的耙基因表达抑制。
本发明提供的核苷酸序列可包括由"间隔序列"分开的反向重复。该 间隔序列可以是包括促进每个重复间形成二级结构(在需要的地方)的 任何核苷酸序列的区域。本发明的一个实施方式中，间隔序列是mRNA 的正义或反义编码序列的一部分。或者间隔序列可包括能够共价连接至 核酸分子的核苷酸或其同源物的任何组合。例如，间隔序列可包括长度 至少约10-100个核苷酸，或者长度至少约100-200个核苷酸，长度至少约 200-400个核苷酸，或长度至少约400-500个核苷酸的核苷酸序列。
核酸分子或核酸分子的片段或序列表中的其它核酸分子能够在某些 条件下特异地杂交其它核酸分子。如本文所使用，认为如果两分子能形 成反相平行、双链核酸结构，那么两核酸分子能够相互特异杂交。如果 核酸分子与又一核酸分子显示完全互补，则认为它们互补。如果两分子 能够以允许它们在至少常规"低严谨性"条件下保持相互退火的足够稳定 性而相互杂交，则认为其是"最小互补"。类似地，如果它们能够以允许 它们在至少常规"高严谨性，，条件下保持相互退火的足够稳定性而相互杂 交，则认为其互补。Sambrook等(1989 )和Haymes等(1985 )描述了 常规严谨条件。
因此允许并非完全互补，只要其不完全阻碍分子形成双链结构的能 力。因此，为了核酸分子或核酸分子的片段用作引物或探针，其只需要 序列充分互补以能够在使用特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
促进DNA杂交的适当的严谨性条件是例如，在约45。C, 6.0 x氯化 钠/柠檬酸钠(SSC),随后在50。C用2.0 x SSC冲洗，这是本领域技术 人员已知的或者可以在Current Protocols in Molecular Biology ( 1989 ) 中找到。例如，冲洗步骤的盐浓度可以选择从50。C时约2.0xSSC的低严 谨性至50。C时约0.2x SSC的高严谨性。另外，冲洗步骤的温度可以从室 温约22。C的低严谨性条件提高至约65。C的高严谨性条件。温度和盐都可 以变化，或者温度或盐浓度可以保持恒定而改变其它变量。优选地，用 于本发明的核酸将显示与如序列表中所述一种或更多种核酸分子至少约 80%,或至少约90%,或至少约95%,或至少约98%或甚至约100%的序 列同一性。
也可利用本领域已知的方法全部或部分(特别是在需要提供植物偏
爱的序列时)合成本发明的核酸。因此，利用所选择的宿主偏爱的密码 子可以合成本发明的核酸的全部或部分。例如，物种偏爱的密码子可以 从在具体宿主物种中所表达蛋白最常用的密码子来确定。核苷酸序列的 其它修饰可导致具有略微改变的活性的突变体。
dsRNA或siRNA核苷酸序列包括聚合的核糖核苷酸的双链并且可以 包括对磷酸-糖骨架或核苷的修饰。可设计RNA结构的修饰以允许特异的 基因抑制。在一个实施方式中，dsRNA分子可通过酶解修饰以便可产生 siRNA分子。siRNA可有效介导一些耙生物的一些耙基因的下调效应。 该酶解可通过使用存在于昆虫、脊推动物、真菌或真核RNAi途径的植物 (Elbashir等，2002; Hamilton和Baulcombe, 1999 )的细胞中的RNAse III 酶或DICER酶完成。该过程也可使用通过易于被本领域技术人员获知的 重组DNA技术导入生物细胞中的重组DICER或RNAse III。生物中天然存 在的，或者通过重组DNA技术制造的DICER酶和RNAse III将较大dsRNA 链切割成更小的寡核苷酸。DICER酶特异地将dsRNA分子切成每个长度 是约19-25个核苷酸的siRNA片段，而RNAse III酶通常将dsRNA分子切 成12-15个碱基对的siRNA。由上述任一种酶产生的siRNA分子具有2-3 个核苦酸3'突出(overhang)以及5'磷酸和3'羟基末端。在真核RNAi途 径中由RNAse III酶产生的siRNA分子与由Dicer酶产生的那些相同，并 因此在其随后展开后通过固有的细胞RNA-降解机制被靶向并降解，分离 成单链RNA并与由耙基因转录的RNA序列杂交。该过程产生靶生物中由 把基因的核苷酸序列编码的RNA序列被有效降解或除去。结果是靶生物 中特定耙核苷酸序列的沉默。可以在Hannon (2002)中找到酶解的详细 说明。
本发明的核苷酸序列可以在计算机可读介质上记录。如本文所使用， 计算机可读介质，，指任何可以被计算机直接读取和存取的有形的表达介 质。该介质包括但不限于磁性存储介质，例如软盘、硬盘、存储介质 和磁带；光存储介质，例如CD-ROM;电存储介质，例如RAM和ROM; 光字符识别格式的计算机文件，以及这些类型的混合，例如磁/光存储介 质。熟练的技术人员可以容易地理解任何目前已知的计算机可读介质可 以用于生产其上包括记录了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质的产
口P e
如本文所使用，"记录"指在计算机可读介质上存储信息的过程。熟
练的技术人员可以容易地采用任何目前已知的用于在计算机可读介质上 记录信息的方法以产生包括本发明核苷酸序列信息的介质。熟练的技术 人员可以获得多种数据存储结构以产生在其上记录了本发明的核苷酸序 列的计算机可读介质。数据存储结构的选择通常将基于所选择的用来访 问存储信息的方法。此外，多种数据处理程序和格式可用于在计算机可 读介质上存储本发明的核苷酸序列信息。序列信息可以用文字处理文本
文件(釆用市售可得的软件格式(例如WordPerfect和MicrosoftWord)) 表示，或者以ASCII文本文件的形式(存储于诸如DB2， Sybase, Oracle 等的数据库应用中)表示。熟练的技术人员可以容易地采用任何数量的 数据处理的结构化形式(例如文本文件或数据库)以便获得于其上记录 了本发明的核苷酸序列的计算机可读介质。
计算机软件是公众可得的，其允许熟练的技术人员存取计算机可读
介质所提供的序列信息。在Sybase系统实现了 BLAST ( Altschul等，1990 ) 和BLAZE (Brutlag等，1993 )检索算法的软件可被用于鉴定本文提供 的和来自含有与其它生物的ORFs或蛋白同源序列的序列(例如Unigenes 和EST，s)内的开放读码框(ORFs)。该ORFs是本发明的序列中编码蛋 白的片段并且对生产商业上重要的蛋白是有用的，该蛋白例如用于氨基 酸生物合成、代谢、转录、翻译、RNA加工、核酸和蛋白降解、蛋白修 饰和DNA复制、限制、修饰、重组和修复的酶。
本发明进一 步提供系统，尤其是含有本文所述序列信息的基于计算 机的系统。设计该系统以鉴定在商业上重要的本发明核酸分子的片段。 如本文所使用，"基于计算机的系统，，指用于分析本发明的核苷酸序列信 息的硬件工具、软件工具、和数据存储工具。最小硬件指包括中央处理 单元(CPU)、输入工具、输出工具和数据存储工具的本发明的基于计 算机的系统。熟练的技术人员可以容易地理解任何一种目前可得的基于 计算机的系统适合用于本发明。
如本文所使用，"靶结构模体"或"耙模体"(targetmotif)指任何被合理 选择的序列或序列的组合，其中基于粑模体折叠时形成的三维构型选择 序列或一条序列。存在多种本领域已知的靶模体。蛋白耙模体包括但不 限于酶活性位点和信号序列。核酸靶模体包括但不限于启动子序列、顺 式元件、发夹结构、siRNAs、以及诱导型表达元件(蛋白结合序列)。
B、重组载体和宿主细胞转化
例如，重组DNA载体可以是线性或闭合环状的质粒。载体系统可以 是一个载体或质粒或者一起含有待导入到细菌宿主基因组的总DNA的 两个或多个载体或质粒。另外，细菌载体可以是表达载体。如序列表中 所述的核酸分子或其片段可以例如，在适当启动子(其在一种或更多种
控制下，适当地插入载体:许多载体对此目^是可获得的，并且适当载 体的选择将主要取决于待插入载体中的核酸大小以及待用该载体转化的 特定宿主细胞。每个栽体根据其功能(DNA扩增或DNA表达)以及与其 相容的特定宿主细胞而含有不同组分。用于细菌转化的载体组分通常包 括但不限于，下述一种或更多种信号序列、复制起点、 一种或更多种 选择标记基因以及允许表达外源DNA的诱导型启动子。
表达和克隆载体可含有选择基因(也称作选择标记)。该基因编码 生长于选择培养基中的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。典型 的选择基因编码这样的蛋白(a)赋予抗生素、除草剂或其他毒素，例如 氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤、草甘膦或四环素抗性，(b)补充营养 缺陷，或(c)供给不能从复合培养基中获得的关键营养，例如编码杆菌 D-丙氨酸消旋酶的基因。被外源蛋白或其片段成功转化的那些细胞产生 赋予药物抗性的蛋白并因此在选择方案中存活。
产生mRNA的表达载体也可以含有诱导型启动子，其被宿主生物识 别并可操作地连接至编码目的核酸分子或其片段的核酸。适合与细菌宿 主一起使用的诱导型启动子包括p-内酰胺酶启动子、大肠杆菌x噬菌体PL 和PR启动子，大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启 动子、色氨酸(trp)启动子，和乳糖操纵子启动子及其变异以及杂合启 动子例如tac启动子。然而，其它已知的细菌诱导启动子是适合的。下面 "i寸i仑纟直物启动子。
在述及调控序列和结构核苷酸序列时使用的术语"可操作地连接，，指 调控序列造成连接的结构核苦酸序列的调控表达。"调控序列，，或"控制元 件"指位于结构核苷酸序列上游(5，非编码序列)，其中，或下游(3，非 翻译序列)的核苷酸序列，其影响转录的时序和水平或数量、RNA加工 或稳定性或相关结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译 前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏蛋白结合序列以及多聚腺
苷酸化识别序列等。
或者，表达构建体可以通过整合载体整合到宿主细胞基因组。整合 载体通常含有至少一个与允许载体整合的染色体同源的序列。在细菌的
情况下，整合似乎由载体和染色体的同源DNA之间的重组而产生。例如 用来自各种芽孢杆菌(Sa"'〃M)株系的DNA所构建的整合载体整合到 芽孢杆菌染色体(EP 0 127,328 )。整合载体也可由细菌噬菌体或转座 子序列所组成。自杀性质粒载体也是本领域已知的。
使用标准重组DN A技术构建含有 一 种或更多种上述罗列组分的适 宜载体。可以以产生需要的质粒所需的形式切割、加工和重连接分离的 质粒或DNA片段。有效的细菌表达载体的实例包括但不限于多功能大肠 杆菌克隆和表达载体，例如BluescdptTM(Stratagene,LaJolla,CA) ; pIN 载体(Van Heeke和Schuster, 1989 )等。
酵母重组构建体可通常包括下述一种或更多种启动子序列、融合 伙伴序列、前导序列、转录终止序列、选择标记。这些元件可以结合到 表达盒，其可于复制子中保持，例如能够在诸如酵母或细菌的宿主中保 持的染色体外元件(例如质粒)。复制子可具有两个复制系统，从而允 许其被保持例如，在酵母中(用于表达和)在原核宿主中(用于克隆和 扩增)。该酵母-细菌穿梭载体的实例包括YEp24 (Botstein等，1979 ), pC1/1 (Bmke等，1984 )，和YRpl7 (Stinchcomb等，1982 )。另外， 复制子可为高或低拷贝数的质粒。高拷贝数质粒将通常具有拷贝数在约5 至约200的范围，且通常约100至约150。含有高拷贝数质粒的宿主将优 选具有至少约IO,更优选至少约20个拷贝。
有用的酵母启动子序列可以源自在代谢途径中编码酶的基因。该基 因的实例包括乙醇脱氢酶(ADH) (EP0284044)、烯醇化酶、葡糖激 酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP或GAPDH)、 己糖激酶、；舞酸果糖激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PyK) (EP 0 3215447)。编码酸性磷酸酶的酵母PH05基因也提供有用的启动子序 列(Myanohara等，1983 )。此外，天然不存在的合成启动子也起酵母 启动子的作用。该杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区相联的ADH 调控序列(美国专利No. 4,876,197和4，880,734)。转录终止子序列和其 它酵母识别的终止序列(例如编码糖酵解酶的那些)的实例是本领域技 术人员已知的。
或者，表达构建体可以用整合载体整合到酵母基因组。整合载体通 常含有至少一种与允许载体整合的酵母染色体同源的序列，并优选含有 表达构建体的两个同源侧翼序列。整合似乎产生于载体和酵母染色体的
同源DNA之间的重组(Orr-Weaver等，1983 )。通过选择载体中适于包 涵体的同源序列可将整合载体整合到酵母中的特定座位。参见 Orr-Weaver等，上文。可整合一种或更多种表达构建体，可能影响产生 的重组蛋白的水平(Rine等，1983 )。
本发明还考虑转化本发明的核苷酸序列到植物中以实现一种或更多 种dsRNA分子表达水平的抑制。转化载体通常包括一种或更多种能够被 转录成与靶生物基因组编码的 一种或更多种核苷酸序列基本上同源和/ 或互补的RNA分子的核苷酸序列，并且可在其它同源或互补的序列中包 括内含子序列以至于从一种或更多种核苷酸序列转录和加工的RNA被 生物摄入导致靶生物基因组分别的核苷酸序列中至少其一的表达下调。
转化载体可定义为dsRNA构建体并且也可定义为重组分子、害虫或 疾病控制剂、遗传分子或嵌合基因构建体。本发明的嵌合基因构建体可 包括，例如编码一种或更多种反义转录本、 一种或更多种正义转录本、 一种或更多种前述每种核苷酸序列，其中因此形成的转录本的全部或部 分与靶生物基因组中包括由核苷酸编码的RNA序列的RNA分子的全部 或部分同源。
一个实施方式中，植物转化载体包括分离并纯化的DNA分子，其包 括可操作地连接至 一种或更多种本发明的核苷酸序列的同源启动子。核 苷酸序列可选子序列表中所述的那些或其片段。核苷酸序列可包括编码 存在于耙生物内的全部或部分RNA的片段。RNA转录本可包括耙RNA的 全部或部分的反向重复。包括表达载体的DNA分子也可含有位于编码序 列上游或甚至在编码序列内的功能性内含子序列，并且也可在启动子和 翻译起始点之间含有五个主要(5，)非翻译前导序列(即UTR或5，-UTR)。
植物转化载体可含有来自 一种或更多种基因的序列，因此使得产生 一种以上的用于抑制靶生物细胞中基因或多个基因表达的dsRNA。本领 域技术人员将容易地理解与不同基因中存在的序列相应的DNA片段可 以结合至一个复合DNA片段以在转基因植物中表达。或者，已经含有至 少一个DNA片^殳的本发明质粒可以在增强子和启动子和终止子序列之 间通过按顺序插入其它DNA片段而修饰。在本发明设计用于抑制多基因
的疾病或害虫的控制剂中，可以从相同的耙物种中获得待抑制的基因以 便增强控制剂的效力。在某些实施方式中，基因可以源自不同病原体或 害虫生物以便拓宽病原体(试剂对其是有效的)的范围。当针对于多基
因的抑制或表达和抑制的组合时，可以按照美国申请
发明者G·R·赫克, J·C·戈利, J·K·罗伯茨, S·C·约翰逊, T·R·I·蒙伊克瓦, T·T·沃恩 申请人:孟山都技术有限公司