用于从植物分离dna的非破坏性方法

专利名称：用于从植物分离dna的非破坏性方法
技术领域：
本发明涉及一种用于从植物分离DNA的非破坏性方法以及该方法 在植物或植物种群的遗传分析中的应用。
背景技术：
植物培育依赖于存在于具体作物物种生殖质中的遗传变异的有效 开发，所述遗传变异决定了植物在特定环境的表型。然而传统上，通 过在表型水平观察到的所期望的性状组合的挑选来实现，渐增地，可
锁的分子标记的挑选来进行。
基于分子标记的性状挑选不依赖于植物的发育阶段，不依赖于环 境，这显著提高了挑选过程。包括由多个基因控制的复杂性状在内的 可以利用分子标记挑选的性状的数目大大增加，并且可以想象这一发 展以渐增的速度持续。
植物培育领域中的另一个趋势起因于反向遗传学。反向遗传学涉 及到一种方法，其中基因被分离，且基因的功能通过修饰它们的一级 结构或表达来确定。随着目前在基因功能方面认识的增加，尤其是在 模式系统中例如拟南芥(AraMdopsis tholiana)，反向遗传学方法 现在在作物系统中增加了效力。
为了确定候选基因的等位基因变异性，过量的DNA诊断工具是可 用的并为本领域技术人员所知。大量包含天然的或诱导的等位基因变 异的植物种群需要在感兴趣的位点对DM多态性进行筛选，以获得饱 和的等位基因变异的采集。因而，可以通过关联分析评价如此发现的 基因的等位基团型对植物表型的贡献。
筛选培育的或突变的种群的成本大部分由在研究过程中种植和采 样种群的个体植物以及从这些样本中制备DNA所需的劳力所决定。在
研究过程中，如果一个种群作为代表存在于种群的个体植物中的遗传 变异的种子样本是可获得的，大量的劳力用于逐林收获种子作为家系 中的相关个体。而且，这任务需要对产生的每一个额外种群进行重复， 并时所述种群在特定遗传位点对等位基因变异进行评价。
发明概述
本发明的目的是提供一种用于从植物中分离DNA的有效的方法。 本发明进一步的目的是提供一种有效的DNA分离方法，所述方法允许
针对在特定遗传位点存在的等位基因变异进行植物种群的筛选，其需 要人工解剖组织样本或需要收获来自被过量研究的种群的每个个体植 物的种子。
根据本发明，发现这样的方法可以基于根部释放的分泌液的使用， 优选地从很幼小的植物如幼苗的根部或从萌芽的种子暴露出的根部或 生长在组织培养基里的植物的不定根，以从中分离DNA。更具体地， 该方法利用从根尖分离的所谓的根边缘细胞作为DNA的主要来源。根 边缘细胞是大部分植物物种围绕根顶端的活细胞。当生长在土壤里以 及生长在液体或者固体培养基时，植物自然地从根部分离根边缘细胞。 因此，本发明的方法被认为是非破坏性的。细胞已经以自然的方式从 植物上分离，可以通过温和的搅动和去除围绕根部且包含根边缘细胞 的培养基(通常是液体)而收获。生长的根部持续产生根边缘细胞， 在稍后的时期可以再一次收获根边缘细胞。
因此本发明涉及一种用于从植物分离DNA的方法，包含
a) 从生长的根部收集根边缘细胞；和
b) 从根边缘细胞提取DNA。
原则上，DNA可以从所有的根边缘细胞获得。但是，很实用的是 收集源自萌芽种子部分的根部的根边缘细胞。种子能够在液体培养基 如水中被浸渍，此后种子萌芽。因此能够在植物发育的很早的阶段， 即种子发育期间，分析植物。没有必要等到叶子在植物上长出来。但 是，该方法也可以在源自幼苗根部的根边缘细胞上进行。
进一步发现生长在组织培养基中的植物材料上的不定根产生根边
缘细胞。根据本发明，这些根边缘细胞也可以用于从中分离DNA。
本领域技术人员所知的各种用于提取DNA的方法是可利用的，例 如CTAB (Doyle JJ and Doyle JL (1990) Focus 12， 13-15)， KingFisher96 (Thermo Labsystems)等等。
如此获得的DNA可以是细胞核和细胞质来源的，并且可以用不同 的核酸分析技术分析。这些核酸分析技术为本领域技术人员所熟知， 包括但不仅限于聚合酶链式反应(PCR), Sanger测序法，mini测序法， pyro测序法，GS20测序法，扩增片段长度多态性(AFLP)，限制片段长 度多态性(RFLP)，随机扩增DM多态性(RAPD) ， Invader(侵染探针法)， 寡核苷酸连接测定法(OLA)，单特征多态性(SFP)。
本发明进一步涉及新颖的非破坏性DNA分离方法在高效筛选大量 植物种群在特定基因座的遗传变异中的应用。该遗传变异可以是自然 的或人工诱导的。
因此从植物分离DNA的方法提供了一个获得可以用于检测由化学 的或物理的诱变产生的植物种群中的特异基因的遗传变异的DNA的有 效工具。可选择地，所述遗传变异可以存在于自然种群中。
本发明的方法的使用消除了建立衍生于发生突变的Ml植物的M2 家系的需要。大量的M2种群可以被替代使用，使得可以用更加有效和 灵活的方式分析M2种群的特异基因不同等位基团型的存在。
本发明的用于从植物分离DNA的方法也适合于在植物种群的遗传 分型中使用，这对商业种子批次的质量控制目的以评价遗传純度和同 一性是有用的。
该DM分离方法可进一步用于存在于遗传上截然不同的植物的种 群中植物的鉴定，该鉴定基于检测多态分子标记的等位基团型，其中 所述多态分子标记与决定某一个表型性状表达的基因的等位基团型是 连锁的。
发明详述 大范围测序的成就提供了模式植物物种如拟南芥和作物物种如水 稻的完整基因组序列。而且，对来自大范围作物物种如番茄，莴苣，
黄瓜，芸苔，甜瓜，玉米等的不同组织样本来源的大量的cDNA片段或 ESTs已进行了测序。目前的挑战是阐明单独的基因的功能，其表达的 调节及其遗传交互作用。为了解决这个挑战，处理每个单独基因的大 量的等位基因变异是重要的。这将为一个基因产物在细胞的，器官的 或更高级别的水平发挥哪种生化作用和基因产物如何相互作用提供线 索。
为了在植物培育中开发基因功能的信息，获得一个非常有效的， 经济效益的反向遗传学技术是令人想要的。反向遗传学涉及一种方法， 在所述方法中，以基因序列信息开始，针对该基因序列产生等位基因 的或表达的变异体，随后对该突变体进行功能上分析。这个术语是相 对于将表型变异作为起始材料以鉴定潜在的基因的等位基因型的正向 遗传学的。
为了在植物培育中应用反向遗传学，基因功能的知识是先决条件。 当前，拟南芥是最广泛研究的涉及基因功能的植物系统，来自拟南芥 研究的结果在这方面提供了丰富的信息来源。
基于氨基酸序列水平的同源性，可以预测 一 个作物物种的同源蛋 白的功能，尽管最终需要直接的实验证据以证实该基因的功能。因此， 基于模式物种的基因的同源性而鉴定的作物物种的基因可以被认为是 特异功能的候选基因。物种间的具有类似或相同功能的基因可以，但 不必要，展现高水平的同源性，并且存在于一个具体模式系统的基因 功能可能只是部分与存在于一个给定的作物物种的基因功能一致。
可以通过反向遗传学开发的等位基因变异性既自然地在适应的种 群中出现又可以通过用化学的或物理的突变剂，分别例如曱基磺酸乙 酯(ems)或X射线，的随机突变获得。通过用这些突变剂处理植物的器 官，细胞，花粉或种子，将会在基因组DM的随机位置引入可能导致 基因功能改变的修饰。在基因功能方面迅速增加的知识，许多植物物 种的基因组和cDNA序列的广泛可获得性和承载自然的和诱导的遗传
变异的种群的可获得性的条件下，反向遗传学作为一种在模式或作物 物种中确定基因功能的研究工具具有渐增的重大意义。另外，反向遗 传学可以被认为是植物改良的有力的技术，用其可以有效鉴定已知的 功能上与特异性状有关的基因的等位基因变异。
为了在一个作物物种中进行反向遗传学，除一个靼基因之外，明 显地需要包含给定作物物种的遗传位点的遗传变异体的植物种群。在
这些种群里，遗传变异可以是自然发生或可以是由突变剂如ems诱导 的。为了获得带有诱导突变的种群，可以在包含不同浓度的突变剂如 ems的溶液中温育例如种子。Ems首先烷基化DNA链的G残基，在DNA 复制期间导致其与T配对，而非与C配对。因此，GC碱基对以一定频 率变成AT碱基对，所述频率由ems的有效剂量和植物的错配修复系统 的活性决定。
Ems的有效剂量依赖于所用的浓度，种子的大小和其他物理性质 和在ems溶液中种子的温育时间。已用ems处理的种子代表性地称为 Ml种子。作为一个处理的结果，Ml种子的组织在它们细胞的基因组中 包含随机的点突变，那些将形成生殖细胞系组织的细胞亚群中的突变 将会转移到被称为M2的下一代。单倍机能不全从而导致不育或者诱导 胚胎致死的突变或它的组合将不能转移到M2代。
和上述的使用ems的类似过程也应用于其他突变试剂。
为了利用反向遗传学评价突变体M2种群特异遗传位点期望的等 位基因变异的存在，可以采用不同的方法，其基于收获和储存M2种子 种群所选择的方法可以被区分开。 一方面可以把M2种子作为单一的巨 大的样本收获和储存而另一方面可以把M2种子作为一个家系收获和 储存，其意味着M2种子是通过逐抹收获并分别保存的。
成批收获M2种子，与把M2作为家系分别收获的情况相比，需要 较少的劳力输入。另一方面，作为家系收获M2种子允许制备种群的每 一个家系的M2种子的子集的DNA提取物，其诊断上可以用于分析种群。 一旦鉴定到一个突变，只需要在温室或田地种植与阳性诊断样本相对 应的家系的种子，以获得突变。
如果成批的M2种子是可获得的，针对每一次执行的筛选，需要分 别种植和采样M2植物用于DNA提取和分析，其需要相当大量的资源输 入。因此，两种方法都有他们特异的缺点，在本技术领域存在一个明 确的需要，以提供能解除两种方法的缺点的解决方案。
当M2种子已被成批收获时，需要非破坏性采样以鉴定包含有特异 基因的期望的等位基因变异体的个体植物。通常，通过种植M2种群幼 小的植物，以采叶子样本的方式对这些植物个体采样和从中制备用于 分析的DNA来实现。这些叶子样本在DNA提取前可以被混合以达到由 使用的突变检测平台的动态范围所确定的程度。适当的标记允许找出 包含期望突变的亚群和最后相应的个体植物的根源。
需要被筛选的M2植物的数目依赖于Ml植物中突变的频率和在研 究中植物物种里促成生殖细胞系的单独细胞的数目。在一个代表性的 实验中，当从5000个M1植物开始时，在2个单独生殖细胞/植物的情 况下，需要筛选约10000个M2植物以捕获诱导的遗传变异。
如果M2种子是被逐株收获的，存在于促成收获种子的Ml植物生 殖细胞的细胞中的诱导的突变在M2家系中是分离的。通过制备源自一 个M2家系的大量个体的DNA样本，可以诊断靶基因中突变的存在，不 需要每次对种群再采样。换句话说， 一个单独的DNA样本可以在诊断 上用于它所代表的M2家系。包含特异基因的期望的等位基因变异体的 个体植物可以通过养育仅仅那些被阳性诊断出期望突变的M2家系的 个体来获得。
虽然一旦建立了 M2家系，这个方法是比较有效的，但是建立这样 的基于家系的系统是劳动密集的，因为它需要单独收获和处理生长在 Ml植物上的种子，并建立一个DNA文库作为种群的遗传变异的代表性 的反映。估计处理5000个M2家系需要至少250个人工时的输入。重 要地，如果期望的突变没有出现在种群里，就必须重复整个活动。
为了检测从(合并的)植物样本分离的DNA中的突变，本领域技 术人员处理了大量的已建立的技术。Ti 11 ing (寻靶在基因组中被诱导 的局部损伤)是以Cell在错配位置对由PCR产生的被标记的异源双链
DNA的特异剪切为基础的。通过变性胶电泳(即在Licor系统上)分 析消化的样本，被消化的PCR片段的出现表明在初始的DM库中DNA 多态现象的存在(Colbert, T. et al (2001) Plant Physiology 126， 480-484)。
变性高效液相色谱(dHPLC)也可以应用于合并的DNA样本。与 tilling过程类似，突变的存在导致与同源双链分子相比，更快的通 过dHPLC柱的异源双链分子的形成，使得在合并样本中的突变的检测 可以进4亍(McCallum， C. et al . (2000) Nature Biotechnology 18， 455-457)。
当用快中子作为突变试剂时，在基因组中在随机位置造成小缺失。 这允许扩增突变的基因座，其通过PCR后在大小上被缩小了 (缺失的 后果)。由于这个PCR反应是特异针对突变基因座的，很高水平的样 本库变成可实行的。另一方面，这个方法只能应用于允许针对包含缺 失的基因座而设计的特异PCR反应的那些突变(Song， X. etal (2001) The Plant Journal 27， 235-242)。
为本领域技术人员所熟知的是，基本上任何可用到的核酸分析技 术都可以;陂应用于检测DNA样本之间的多态性。甚至个体样本的直接 测序也可以被应用。在工业设备中，平台的选择大部分由它的稳定性
(robustness )和每个数据点的成本所决定。
随着各种各样的诱导突变的检测技术的可用性和自动化和小型化
的发展，当与涉及制备M2种群和有代表性的DNA模板的成本相比时，
每个数据点的成本将会被减少到 一个相当低的水平。
因此，植物反向遗传学的改良在制备突变种群和它们的代表性 DNA样本领域里较好的被实现，而不是在诱导的多态现象的检测中。 这些改良由本发明提供。
在任一种情况，即应用基于M2成批种群或M2家系的反向遗传学，
分别在篩选期间或者之前将需要大量的劳力输入。这严重限制了反向 遗传学方法在作物物种的成本效益的适用性。
本发明的DNA分离方法也可以用于在植物培育期间的植物挑选。通过杂交和从后代种群中挑选植物达到植物培育的进步。
传统上，在特异的生长条件下，在显现的植物表型水平进行挑选。 例如，基于果实和叶子的颜色或形状，对病原体的抵抗力，产量或其 他性状或其组合挑选植物。
随着分子标记技术的出现，针对特异性状的挑选可以在DNA水平 进行。技术已经发展到允许鉴定和检测遗传上与导致某一性状表达的 基因的等位基团型紧密连接的标记等位基因。在理想情况中，标记等 位基因与造成某一性状的基因的等位基团型是一致的。在这些情况中， 标记等位基因和性状等位基因不能通过遗传重组分开。
用于间接挑选性状的标记等位基因的使用有大量的优点，其提高 了挑选过程的效率。基于标记的挑选是独立于植物的发育阶段和环境 的。这允许例如在幼苗阶段挑选果实的性状或在室温挑选寒冷耐受性。 目前，使用标记等位基因的间接挑选广泛应用于现代植物培育。最先 进的是标记在检测质量性状，即在生殖质中表型的变异是由单个基因 的等位基团型所决定的性状，中的应用。
例如，对病原体的特异菌林的抵抗力通常是由显性R基因的存在 所决定的，其编码检测病原体病毒性因子的存在或活性的受体。虽然 抗性表型的表达涉及许多基因座，存在于生殖质的和解释表型值的遗 传变异通常由单个R基因的基因座决定。
但是，许多性状是定量的或连续的，其意味着许多基因能贡献于 经常受环境条件影响的性状的表型值。这些表型比如植物的高度，开 花时间或潜在产量。而且，潜在于复杂性状下的个体基因能上位地相 互作用，其使对它们遗传的分析复杂化。
随着高密度遗传图谱和有力的统计工具的可获得，目前涉及这些 数量性状(QTL)的表达的基因座的检测是可行的。因此可以预期，用分 子标记能检测的(复杂)性状的数目将会在不远的将来显著增加。
为了应用间接挑选，目前可以使需要被挑选的个体植物的种群的 种子在温室里萌芽生长到组织样本可以用于DNA提取的阶段。取决于 作物物种，这可以在幼苗阶段或幼小植物阶段进行。在进行DNA分析
后，可以进行植物的挑选。显然，这一过程需要时间，空间和劳力，
其消耗了需要的用于执行基于分子标记的间接挑选的总资源的相对巨
大的部分。
增加获得足够质量和数量的DNA提取物的效率，以执行DNA分析 的方法的技术能显著降低基于分子标记的间接挑选的成本。这些技术 由本发明提供。
本发明提供了一种新颖的方法，以用高效的，非破坏性的方式从 植物分离DM。这个方法寸以被应用于例如显著提高反向遗传学以及 间接挑选技术的总效率。
该DNA分离方法可以有效的应用于植物发育的非常早期的阶段， 即在胚根从被浸渗种子暴露出来的阶段，并且重要地，不需要任何通 过钻孔或切割等组织采样。
当种子被置于适合的湿度，光和温度的条件下，水将被吸收且将 开始萌芽。通常，第一个可见的萌芽信号是胚根或根尖的暴露。在生 长时，在根尖后面的区域丢弃称为根边缘细胞的活细胞到环境中 (Hawes， M. et al . (1998) A謂.Rev. Phytopathol . 36， 31卜327)。
虽然根边缘细胞的功能还不完全明确，目前的假说是这些细胞通 过在植物体和它生长的土壤之间形成一个扩散的边界，保护植物抵抗 毒性元素如铝或致病微生物。另外，根边缘细胞可能有吸引有益微生 物或建立菌根的功能。因此根边缘细胞可能在控制根系统的微环境中 非常重要。
当种子在体外例如在水中萌芽时，也产生根边缘细胞，并且根边 缘细胞保持松散地附着于根的表面。通过温和的搅动，根边缘细胞会 从根的表面释放出来，散布到液体中，并且能够被收获。根据本发明， 令人惊讶地发现这些根边缘细胞可以担当用于诊断目的的DNA来源。 大部分的作物物种，如果不是全部，是已知产生根边缘细胞的，意味
着本发明的普遍可应用性。
当种子在水中萌芽到根部已经暴露出约l-2厘米的阶段时，水里 含有足够的细胞物质以用于进行标准的DNA提取过程，为用PCR或其
他DM分析技术进一步分析提供足够的DNA。
根据本发明，体外植物的根部产生根边缘细胞。这些根边缘细胞 不是源自于萌芽种子或幼苗的根尖，而是来自于组织培养材料的不定 根，因而也可以用于从中分离DNA。
当根边缘细胞悬浮液用有效浓度的DNase处理1小时后，在DNase 失活及随后的MA提取后，仍可以荻得信号(

图15)。这确证了从根 分泌液获得的DNA的确是来源于有DNase抵抗能力的结构例如根边缘 细月包的，见念。
能获得的DNA的数量足以进行许多分析，尤其是当使用灵敏的基 于荧光的检测才支术如InvaderTM或Invader PlusTM (Third Wave Technologies)。
大部分作物物种，如果不是全部，其有足够生理质量的种子，在 水中几天里萌芽。已经观察到在这非常早期的阶段，根边缘细胞已经 形成。因此，DNA提取和分析可以令人惊讶地在从千种子开始的几天 里完成。由于萌芽的种子在体外保持生命力至少2周，正常情况下， 在温室中种植植物所需的时间和空间以及收获组织样本所需的劳力可 以大部分纟皮省略。
上述情况也适用于组织培养的根。根边缘细胞可以从培养基中分 离并且这体外植物能继续生长。这个分析可以在植物发育的非常早期 的阶段进行。
根据本发明进一步展示，源自成批M2种群的种子可以在2 - 5个 种子的小库中萌芽，其提供能在检测平台上分析的合并DNA样本，所 述的检测平台具有在包含有3-9倍于野生型等位基因数量的库中检 测一个突变体等位基因的动态范围。
合并也可以在收获根边缘细胞，DNA提取物或PCR产物的水平上
进行。实际采用的合并策略取决于不同过程的技术性，包括液体中种
子的萌芽行为和作物物种与作物物种可能不同的根边缘细胞生成以及 按照每抹成本可以发现最适度的检测平台的动态范围。
就效率而言，根据反向遗传学或使用成批M2种子或M2家系或培育种群的间接挑选方法的资源输入，根据本发明的方法有着大量重要
的含意。由于使用根边缘细胞的非破坏性DNA提取方法能够在体外在 种子萌芽后的非常早期的阶段进行，和已知的幼苗在体外保持生命力 至少几周的事实，使用成批M2种群的反向遗传学方法或间接挑选方 法，不再需要温室时间和空间以及制备植物样本如叶片的密集劳动。 这意味着对M2成批种群工作的可选择性，即需要大量的前期资源输入 的M2家系的工作不再是必需的。
另外，在培育期间，间接挑选方法不需要在温室里种植将不会被 挑选的植物材料。因此，用与本技术领域目前所知的反向遗传学或间 接挑选方法相比，利用本发明，手边的任何需要在特异基因座评价等 位基因变异性的种群可以以空前的效率和灵活性进行筛选。
本发明的用于植物的分离DNA的方法在最广泛的意义中是可应用 的。在本申请中，涉及了多种情况，在所述的情况中，用于分离DNA 的有效的非破坏性方法是有益的。这些例子是不打算限制的。将会为 技术人员所清楚的是，该方法可用于任何DNA分离且在其他本文未提 及的情况里也是同等可应用的。
本发明将在以下的非限制的实施例中进一步用图说明。这些实施 例涉及到以下附图。
图1:根边缘细胞脱落到液体培养基中的黄瓜根尖。左图展示了 白光下的成像，右图展示了根边缘细胞在DAPI染色后荧光下的细胞核。
图2:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由PCR分 析，跟随进行根据本发明的DNA提取方法生成的不同的黄瓜DNA样本 的kom2Q标记位点的Mspl消化而获得。
通道l:分子量标记
通道2至11: 10个个体黄瓜4艮边缘细胞标本 通道12:阴性对照莴苣根边缘细胞标本
通道13:阴性对照水 通道14:阳性对照黄瓜叶片
图3:在用kom20-探针组分析黄瓜根边缘细胞DM提取物后获得 的表达为净Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。对于每一个DNA 样本，RED信号标绘在X轴上而FAM信号标绘在Y轴上。
图4:左图展示了在液体培养基中的萌芽的甜瓜种子及其根尖。 右图展示了来源于根部的脱落的根边缘细胞。
图5:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的甜瓜DNA样本的mlllkl9标记基因 座的PCR分析获得。
通道1:分子量标记
通道2至11: 10个个体甜瓜根边缘细胞标本 通道12:来自甜瓜叶片的DNA 通道13:阴性对照莴苣根边缘细胞标本 通道14:阴性对照水
图6:在用mlllkl9探针组分析甜瓜根边缘细胞DNA提取物后获 得的表达为净Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。对于每一个 DNA样本，RED信号标绘在X轴上而FAM信号标绘在Y轴上。
图7:根边缘细胞脱落到液体培养基中的番茄根尖。
图8:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的番茄DNA样本的侧生抑制因子基因 (lateral suppressor gene)的PCR分析获得。 通道1:分子量标记
通道2至11: IO个个体番茄根边缘细胞标本 通道12:来自番茄叶片的DM 通道13:阴性对照水
图9:带有附着的根边缘细胞的芸苔根尖(左)。芸苜根边缘细 胞的详细视图(右)。
图10:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的野甘蓝(Brassica oleracea) DM 样本的BoAC02基因片段的PCR分析获得。
通道l:分子量标记
通道2至12: 11个个体野甘蓝根边缘细胞标本 通道13:阴性对照水
图11:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由野甘蓝 线粒体基因组的线粒体0RF B区域的PCR分析获得。 通道1:分子量标记
通道2至7: 6个个体野甘蓝根边缘细胞标本 通道8:源自于芸苔植物叶片的DNA 通道9:阴性对照水
图12:甲苯胺蓝染色后从莴苣根部脱落的根边缘细胞的光学显微 镜检查。
图13:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的莴苣DNA样本的与称为NAS2的 Nasonovia抗性基因连锁的分子标记的PCR分析获得。
通道1:分子量标记
通道2至13: 12个个体莴苣根边缘细胞标本
通道14:分子量标记 通道15:阴性对照水
通道16:阳性对照源自于莴苣叶片("ponssla，，)的DNA 通道17:阴性对照源自于黄瓜的DNA
图14:在用NAS2-探针组分析莴苣根边缘细胞DNA提取物后获得 的表达为原始值的FAM和RED值。对于每一个DNA样本，RED信号标 绘在X轴上而FAM信号标绘在Y轴上。
图15:展示用DNase处理的黄瓜才艮部分泌液的DNA提取物的PCR 分析的溴化乙锭染色的琼脂糖胶。
图A:使用黄瓜kom24特异引物組合的PCR分析。 图B:使用莴苣特异的RP引物组合的PCR分析。通道1-18包含 从经过以下处理的黄瓜根部分泌液分离的DNA:在通道l-3， 7-9和 13-15中分析的根部分泌液中加入莴苣基因组DNA。通道1 - 6的样本 不加入DNase。通道7 - 12的样本加入DNase并立即通过在65°C温育 5分钟使其失活。通道13-18，加入DNase，继之以37°C温育30分钟， 随后失活。在图A中，水(通道19)，莴苣DNA(通道20)和黄瓜DNA (通道21 )用作对照。在图B中，水(通道19)，莴苣DNA (通道20 和21 )和黄瓜DNA (通道22 )用作对照。
图16:在26。C水中温育24小时后体外再生黄瓜植物的不定根的 根尖。在这一阶段，根边缘细胞的脱落是清楚可见的。
图17:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的黄瓜DNA样本的kora24标记基因座 的PCR分析获得。
通道l:来源于不定根的黄瓜根边缘细胞标本(BC)。
通道2:源自于黄瓜叶片的DNA
通道3:阴性对照水
图18:根边缘细胞脱落到液体培养基中的胡椒的根尖。
图19:在用GMS探针组分析胡椒根边缘细胞DNA提取物后获得的 表达为净Fold Over Zero (FOZ)的FAM和RED值。对于每一个DNA样 本，RED信号标绘在X轴上而FAM信号标绘在Y轴上。在图中，杂合 信号用蓝色标绘而对照样本的纯合信号用红色和绿色符号标绘。
图20:根边缘细胞脱落到液体培养基中的玉米的根尖。
图21:展示条带的溴化乙锭染色的琼脂糖胶，所述条带由根据本 发明的DNA提取方法生成的不同的玉米DNA样本的细胞壁转化酶基因 Incwl的PCR分析获得。
通道1:分子量标记。
通道2至7:源自于玉米根边缘细胞的DNA。 通道8:阴性对照水。
通道9至10:阳性对照源自于玉米叶片的DNA提取物。 图22:根边缘细胞脱落到液体培养基中的苣荬菜根尖。 图23:根边缘细胞脱落到液体培养基中的胡萝卜根尖。 实施例
实施例1源自于黄瓜的根边缘细胞的DM提取和分析 黄瓜种子在26。C, 10(^1水中(milliQ)萌芽。取决于目的，可以 使用不同的规格，如允许易于将样本转移到96孔微量滴定板以进一步 处理的12 x 8 MicronicTM微管规格。在暴露的根有约1. 5cm的长度的 阶段，其取决于种子的种类和质量，发生在约18小时后，包含有萌芽
种子的管道用涡旋温和地振动15秒，以从根尖释放根边缘细胞。如图 1所示，通过光学显微镜的评价清楚地展示了培养基中黄瓜的根边缘 细胞的存在。
主根和根毛没有被这一过程破坏。包含有根边缘细胞的液体通过 添加lOOpl裂解緩沖液(Agowa)用于进行DNA提取(植物DNA分离试 剂盒，与King FisherTM 4几器人技术组合的Agowa GmbH， Thermo Labsystems )。该混合物在55°C温育10分钟。随后加入300|nlDNA结 合緩沖液(Agowa)并在3000rp/n将混合物离心5分钟。随后，往上清 夜力口入15|il King Fisher粒子悬浮液(Agowa Magnetic Particles (Suspens ion BLM))。
在用120pl洗脱緩冲液(lOmM Tris-HCl緩冲液pH = 7. 6)将结 合的DNA从粒子上洗脱下来后，该DNA准备好用于分析。对于黄瓜， 选择存在于基因组中的名为"kom20，，的随机分子标记，以分析来自基 于根边缘细胞获得的DNA提取物的DNA。
在这个实施例中，所用的种群针对kom20标记的等位基因之一分 离为杂合的或纯合的。用获得的DM提取物的总量中的5pl进行PCR。 当用琼脂糖胶分析时，预期PCR反应产生372bp的片段。用限制性酶 Mspl对kom2GPCR片段的消化辨别本实施例中用于实验的种群中这个 标记基因座的两个等位基因。当限制性酶的识别位点出现在PCR产物 中时，用Mspl消化产生279和93bp的片段。分析的结果在图2中展 示。
为了证实这一结果，用kom20-特异荧光探针组(Invader )分析 DNA标本，其针对每一个kom20等位基因(FAM or RED)产生一个特异 荧光信号(表达为净Fold Over Zero or FOZ)。因此，预期的是根 据本发明从用kom20-探针分析的分离种群的个体中获得的DNA样本 将为标记等位基因的任一个杂合体型产生诊断的荧光信号(在对角线 上标绘，RED + FAM信号)或为标记等位基因之一的纯合体型产生诊 断的荧光信号(对这个具体情况用RED标记并标绘在X轴上)。分析 的结果在图3中展示并证实了预期值。
发现与每一抹分析的植物一致。因此，该结果证明根据作为本发明的
主题的方法分离的DNA的数量足以进行使用与琼脂糖胶电泳组合的 PCR的或作为检测平台的基于焚光的探针系统的DNA标记分析。进一 步可以推断标记信号(marker calls)是源自于存在于种子中的杂合 组织来源的DNA，而不是母本组织来源的，因为所用的标记是分离的， 其在用于产生用于此分析的杂合种子的母系中不是这种情况。
为了证实使用根据本发明的DNA分离方法而获得的数据，将萌芽 的种子种在温室中，取叶片组织并用PCR/MspI对kom20标记分析。用 叶片DNA获得的数据展示出与用源自于根边缘细胞DNA提取物的DNA 获得的数据一致。这证明通过根边缘细胞DNA提取物产生的标记数据
代表着一林既定的由新生幼苗生长而成的植物。
为了确定每一份DNA提取物可以进行的实验的数量，用两次重复
的检测5个不同的随机标记位点的5个基于荧光的实验测定了一系列 稀释度的DNA提取物。发现每一个DNA提取物可以被稀释至少20倍而
不丢失任一个不同实验的信号。由于每一个提取物在ioopi体积中制
备，并且每一个实验用5pl，每一次分离的每一个DNA提取物可以进 行总数为400个的实验。另外，对于黄瓜，每一个幼苗可以进行至少 2轮的根边缘细胞收获和DNA分离，其意味着使用根边缘细胞DNA提 取物每一个幼苗可以进行总数为800个的实验。
当已经作为根边缘细胞DNA来源的萌芽种子储存在4°C时，黄瓜 幼苗保持生命力至少3周。这意味着在DNA分析完成后，幼苗有充足 水平的活力以转移到温室。
因此，只有拥有期望分子标记值的植物需要转移到温室，而其他 没有期望分子标记值的植物可以在非常早的体外时期抛弃。这可以导 致相当多的成本节约。
实施例2
源自于甜瓜的根边缘细胞的DNA提取和分析
被称为Danubio的杂交品种的自交后代的种子在26°C， 100|iil水
中(milliQ)萌芽。用于从甜瓜分离DNA的方法与本申请的实施例1 中针对黄瓜的所述的方法相当。图4展示了在包含甜瓜幼苗的液体培 养基中的根边缘细胞的存在。
为了研究该方法是否产生足够的DNA以用PCR检测标记等位基因， 用5pl的DNA提取物进行使用特异针对标记等位基因mlllkl9的引物 组合的PCR反应。该PCR反应预期产生一个342bp的片段。这一分析 的结果在图5中展示。
展示在图5的结果证明获得了足够的DNA以通过PCR产生期望的 DNA片段。为了证明该片段确实时来源于胚，进行了基于荧光的 mlllkl9实验，其检测初始杂种中存在的并预期在该分析所用的种子 中分离的两个等位基因。该实验的结果在图6中展示。
该结果清楚地证明标记等位基因mlllkl9的分离成为三种情况 纯合型A ( FAM信号)，纯合型B ( RED信号)和杂合型，其表明DNA 是胚来源的。
实施例3
源自于番茄根边缘细胞的DNA提取和分析
番茄种子在26'C， 50^1水中(milliQ)萌芽，当暴露的根有平均 1. Ocm长度时，根据本申请的实施例1提取DNA。如图7所示，用光学 显微镜的分析清楚地展示了在液体培养基中番茄的根边缘细胞的存在。
用特异针对称为侧生抑制因子的番茄已知基因的引物组合，用 DNA总量的5pl进行PCR反应，预期其产生360bp的条带。该实验结
果在如图8展示。
该结果清楚地证明了用该方法分离的DNA数量足以产生能在琼脂 糖胶上检测的期望分子量的PCR片段。需要注意的是，在那些没有观 察到条带的情况中(图8中用星号标记的通道)，种子没有萌芽。这 表明用该方法对PCR片段的检测依赖于种子的萌芽。
实施例4
源自于野甘蓝根边缘细胞的DNA提取和分析
用源自于芸苔的萌芽种子实施了一个实验。所用的方法与实施例
l中所述的方法相当。萌芽温度是2TC。图9展示了在野甘蓝幼苗根 尖的根边缘细胞。
为了证明从根边缘细胞获得的DNA提取物能被用于检测存在于细 胞核中的核酸，设计了一个引物组合，其能扩增涉及乙烯生物合成的， 称为BoAC02的基因的片段。
预期PCR反应产生一个344bp的片段。该分析的结果在图10中展示。
如图IO所示的结果证明获得了足够的DNA以通过PCR产生期望的 细胞核DNA片段。
进行了另一个实验以证明除了细胞核序列外，存在于细胞质基因 组的序列可以在根边缘细胞起源的DNA中被检测。进行了一个PCR反 应，其扩增了位于线粒体基因组中的0RF B基因区域。0RF B区域的 片段有1180bp的期望分子量。该实验的结果在图11中给出。
该结果展示了产生的特异针对0RF B基因区域的条带并且证明细 胞质DNA序列可以用所述的DNA分离方法检测。
实施例5
源自于莴苣根边缘细胞的DNA提取和分析
莴苣种子在21'C， 50|nl水中(milliQ)萌芽。根露出在2天内发 生且通过温和振动根边缘细胞从根部脱离。通过光学显微镜显现的莴 苣的根边缘细胞在图12中展示。
在当根部有约1.5cm的平均长度时的阶段进行DNA提取。所用的
DM提取方法与实施例1中所述的针对黄瓜的方法类似。为了评价是 否获得充足的DNA,用称为NAS2的与Nasonovia抗性基因连锁的基因 组标记进行PCR反应。该结果在图13中给出。
该结果展示了当在PCR反应中用了 5^1获得的DNA提取物时，生 成的针对所用分子标记的期望分子量的特异条带。推断出根据本发明 的DNA分离方法满足进行DNA分析如PCR的需要。
图13所示的结果证明获得足够的DNA以通过PCR产生期望的DM片段。为了证明该片段确实是胚来源的，进行了基于荧光的NAS2测定， 其检测出现在初始杂种中的NAS2的两个等位基因并且预期其在该分 析所用的种子中分离。该实验的结果在图14中展示。
该结果清楚地证明标记等位基因NAS2的分离为3种情况纯合型 A (FAM信号)，纯合型B (RED信号)杂合型，其表明DNA是胚来源 的。
实施例6
来源于根分泌液的DNA存在于具有DNase抗性的组分中。
为了证明根据由本发明所述的方法从根部分泌液获得的DNA来源 于根边缘细胞，实施了 DNase敏感性实验。
根边缘细胞由如实施例1所述的黄瓜幼苗产生并且通过使用针对 标记基因座koifl24的引物组合的PCR分析DNA。在进行DM提取之前 用DNase处理根部分泌液。如果DNA存在于根部分泌液中，如此它将 会被DNase降解。如果DNA存在于根边缘细胞中，DNase将不会对DNA 提取后的PCR信号的产生有影响。
该实验的结果在图15中展示。该结果表明外源加入的源自于莴苣 的DNA当,皮加入到黄瓜才艮部分泌液时对DNase的处理是敏感的，然而 黄瓜DNA的PCR信号没有由于DNase处理而消失。这证明黄瓜根部分 泌液包含黄瓜DNA，其受到保护不受加入的DNase影响并且因此源自 于存在于分泌液中的根边缘细胞。
实施例7
用源自于体外成年植物的根部分泌液的DM提取 在体外，通过把植物从体外培养基转移到允许它产生根边缘细胞 的包含巨孔板(macrowell)的水中，取黄瓜的带根的芽用于分析。如图 16所示，在26。C温育24小时后，形成的根边缘细胞通过光学显微镜 时清楚可见的。
在收集根边缘细胞的阶段，提取DNA并用特异针对标记基因座 kom24的PCR分析。如图17所示，用源自于根边缘细胞的DNA提取物 获得了诊断黄瓜基因組DNA存在的清晰的条带。
图H所示的结果证明获得了足够的DNA以通过PCR产生期望的 DNA片段，因此可以推断基于根边缘细胞的DNA分离技术是可以应用 于来源于体外成年植物的不定根的分泌液。
实施例8
源自于胡椒根边缘细胞的DNA提取与分析
胡椒种子在26°C， 40nl水中(milliQ)萌芽，当露出的根有平均 l.Ocm长度时，根据本申请的实施例1提取DM。如图18所示，通过 光学显微镜的观察清楚地展示了培养基中胡椒根边缘细胞的存在。
用GMS-特异的荧光探针组(Invader )分析DNA标本，其针对任 一个GMS等位基因(FAM或RED)产生一个特异的荧光信号(表达为净 net Fold Over Zero或net F0Z，即净Fold Over Zero或净F0Z)。 在本实施例中，对已知的GMS标记等位基因一致杂合的Fl代杂合种子 进行分析。因此预期的是根据本发明从用GMS探针分析的Fl代杂交种 群的个体中获得的DM标本将会产生诊断标记等位基因杂合体型的荧 光信号(标绘在对角线上，RED + FAM信号)。分析的结果在图19中 展示。
用基于荧光的种群分析获得的GMS基因分型值被发现是与被分析 的每一株植物的标记基因座的已知的表型值一致的。因此，该结果证 明根据本发明的方法分离的DNA的数量足以进行利用基于荧光的探针 系统作为检测平台的DNA标记分析。
实施例9
玉米根边缘细胞的形成
玉米种子在21。C， 500ja1水中(milHQ)萌芽，当露出的根有平均 2.0cm的长度时，通过光学显微镜的观察清楚地展示了培养基中玉米 根边缘细胞的存在，如图20所示。
在该阶段收集根边缘细胞，提取DNA并用特异针对细胞壁转化酶 (Incwl，登记号AF050129)的PCR进行分析。如图21所示，用源自 于根边缘细胞的DNA提取物获得了诊断玉米基因组DNA存在的6卩0bp 的清晰条带。
实施例10
苣荬菜根边缘细胞的形成
荬菜苣种子在21'C， 40pl水中(milliQ)萌芽，当露出的根有平 均l.Ocm的长度时，通过光学显微镜的观察清楚地展示了培养基中苦 苣根边缘细胞的存在，如图22所示。
实施例11
胡萝卜根边缘细胞的形成
胡萝卜种子在21。C， 40pl水中(railliQ)萌芽，当露出的根有平均 1. Ocm的长度时，通过光学显微镜的观察清楚地展示了培养基中胡萝卜 根边缘细胞的存在，如图23所示。
权利要求
1、一种用于从植物获得DNA的方法包括:a)从生长的根收集根边缘细胞；和b)从根边缘细胞提取DNA。
2、 根据权利要求1的方法，其中根边缘细胞是包含在生长的根的 根分泌液中。
3、 根据权利要求1或2的方法，其中根是生长在培养基中。
4、 根据权利要求3的方法，其中培养基是水。
5、 根据权利要求3的方法，其中培养基是组织培养基。
6、 根据权利要求3的方法，其中培养基是土壤。
7、 根据权利要求1-6中任一项的方法，其中根是萌芽种子的一部分。
8、 根据权利要求1 - 6中任一项的方法，其中根是幼苗的根。
9、 根据权利要求1-6中任一项的方法，其中根是组织培养植物或植物部分的不定根。
10、 根据权利要求7的方法，其中种子是萌芽到胚根或根尖出现为止的。
11、 根据权利要求1 - 10中任一项的方法，其中根边缘细胞是从 已经出现1至2cra的根收集的。
12、 根据权利要求1 - 11中任一项的方法在源自于成批M2突变体 植物种群的遗传变异的检测中的应用。
13、 根据权利要求l-ll中任一项的方法在源自于成批自然植物 种群的遗传变异的检测中的应用。
14、 根据权利要求1-11中任一项的方法在培育种群中的遗传变 异的检测中的应用。
15、 根据权利要求l - ll中任一项的方法在商业种子批次中的遗传 变异的检测中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于从植物获得DNA的方法，包括从生长的根收集根边缘细胞；和从根边缘细胞提取DNA。根边缘细胞包含在生长的根的根分泌液中，所述的根生长在培养基中，如水，组织培养培养基或土壤。适宜地，根是萌芽种子的一部分，或幼苗的根或组织培养植物或植物局部的不定根。
文档编号C12N15/10GK101384717SQ200780005500
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月14日 优先权日2006年2月14日
发明者C·M·P·梵邓恩 申请人:瑞克斯旺种苗集团公司