专利名称：骨形成的调节的制作方法
技术领域：
无
背景技术：
在过去数年里，骨相关病症和疾病的专题已受到相当大的关注。骨相关病症的特征 在于骨吸收与骨形成之间的不平衡所导致的骨流失。在整个生命过程中，存在持续的骨 骼骨重建。在这一重建过程中，破骨细胞所导致的骨吸收与成骨细胞所导致的骨形成之 间存在微妙的平衡。涉及软骨内与膜内成骨的成骨细胞是骨组织中制造达成新骨形成的 基质蛋白的特殊细胞。骨形成(即，骨生成)对维持骨骼中的骨量(bone mass)来说 不可或缺。不同于成骨细胞，破骨细胞与骨吸收和骨去除相关联。在正常骨中，成骨细 胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡通过复杂的调控相互作用来维持。
存在许多与骨骼系统相关联的不足、疾病和病症。 一些实例包括(但不限于)骨质 疏松、骨癌、关节炎、佝偻病、骨折、牙周病、节段性骨缺损、溶骨性骨疾病、原发性 和继发性甲状旁腺功能亢进、帕哲病(Paget's disease)、骨软化、骨肥厚和骨骼石化症。 涉及成骨分化和更新过程的机理的鉴别是了解骨生理学和诸如骨质疏松的骨骼病症的 关键。这些病症可包括由推定的成骨祖细胞有缺陷成熟所导致的骨形成不足。
对研发治疗与骨吸收和骨形成相关联的疾病或病症的方法、促进骨形成的方法、鉴 别调节(增加或减少)骨形成的药剂的方法、鉴别调节(增加或减少)骨吸收的药剂的 方法和鉴别与骨相关病症相关联的基因或其蛋白质产物的方法存在需要。
涉及骨形成和骨吸收的机理的鉴别是了解骨生理学和诸如骨质疏松的骨骼病症的 关键。与骨相关病症相关联的基因或其蛋白质产物可用于阐明骨形成、骨吸收的分子机 理，筛选和研发新药，诊断、预后、预防和治疗骨发育和骨流失病症且评估诸如骨质疏 松的骨相关病症的治疗。所鉴别的基因和蛋白质也可能适用于探索调节骨形成的医药 剂。最近己鉴别的一种这样的蛋白质是Ror2蛋白。Ror2基因表达的下调抑制地塞米松
(dexamethasone)诱导的人类间充质干细胞的成骨分化(图1)，而Ror2过表达促进这 些细胞的成骨分化(2004年4月14日申请的比里德(Billiard)等人的美国专利申请案 U.S.S.N. 10/823,998;其以引用的方式并入本文中)。因此，Ror2和Ror2通路是调节骨 形成的合适标靶。
发明内容
本发明提供一种调节骨形成的系统。这一系统以Ror2在成骨细胞分化中的作用的 发现为基础。具体来说，Ror2蛋白的活化促使矿物化骨形成。已发现，Ror2表达是间 充质干细胞成骨分化中的关键。也已发现，Ror2过表达抑制间充质干细胞分化为脂肪 细胞。也已发现，Ror2蛋白的活化促使14-3-3卩磷酸化。已发现，14-3-3(3的下调增加 人类间充质干细胞中的矿物化基质形成。这些关于Ror2蛋白、其与14-3-3P蛋白的相 互作用和14-3-3f3的下调的发现使得Ror2、 14-3-3卩和其它下游信号转导生物分子成为 调节骨形成的新颖药剂的探索中的主标靶。活化Ror2蛋白、抑制14-3-3P蛋白或调节 其它下游标靶的活性的药剂适用于治疗和预防骨相关病症，尤其与骨流失相关联的病 症。这些药剂也适用于促进成骨细胞分化和促进矿物化基质形成。或者，这些药剂也可 在抑制干细胞分化为脂肪细胞中获得应用且可能适用于治疗肥胖症、代谢病症或糖尿 病。
本发明提供活化Ror2蛋白的药剂。在某些实施例中，这些药剂引起Ror2蛋白二聚 合，从而导致Ror2活化。Ror2蛋白的二聚合导致激酶活性增加和随后的Ror2结合搭 配物(包括14-3-3(3蛋白)的磷酸化。药剂也导致促进骨生长。
另一方面，本发明提供抑制或下调14-3-3活性(尤其14-3-3p或14-3-3y)的药剂。 这些药剂可在DNA或蛋白质水平下起作用以降低14-3-3在细胞中的活性。在某些实施 例中，使药剂靶向涉及骨形成的细胞，诸如成骨细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、胎 儿干细胞、骨祖细胞、成骨前体细胞(pre-osteoblast)、成熟成骨细胞或成骨细胞品系 中的任何其它细胞。在其它实施例中，使药剂靶向涉及脂肪细胞形成的细胞。举例而言， 可使药剂与双膦酸盐部分接合以靶向骨。已发现，14-3-3(3的下调增加矿物化基质形成。 靶向14-3-3或14-3-3的特定同功异型物的药剂可与活化Ror2蛋白的药剂(例如，弓|起 Ror2蛋白二聚合的药剂)组合使用。这一组合在促进骨形成中可能具有协同效应。
其它方面，本发明提供调控已发现在调控骨形成中很重要的Ror2/14-3-3|3通路的其 它下游元件的药剂。这些药剂可单独使用或与本文中所述的其它药剂组合使用。
本发明药剂可为任何类型的化合物，但优选为蛋白质、肽、聚核苷酸和小分子。在
某些实施例中，药剂是促进Ror2蛋白二聚合的抗体或其片段。抗体可为多克隆或单克 隆抗体；然而，对治疗人类个体来说，通常优选为人化单克隆抗体。抗体或其片段可为 任何同种型；然而，通常优选为IgG同种型。在某些实施例中，药剂为针对Ror2蛋白 的二价或多价抗体片段。在其它实施例中，药剂为14-3-3p特异性RNAi、siRNA或shRNA
构筑体。
一方面，向个体投与活化Ror2蛋白或抑制14-3-3(3活性的药剂以促进骨形成。在 某些实施例中，向个体投与活化Ror2蛋白的药剂与抑制14-3-3P活性的药剂的组合。 尤其，药剂的投与促进成骨细胞分化和/或增加矿物化基质形成。个体可患有任何骨相 关病症或处于患这些病症的风险中，这些病症包括骨质疏松、骨癌、关节炎、佝偻病、 骨折、牙周病、节段性骨缺损、溶骨性骨疾病、原发性和继发性甲状旁腺功能亢进、帕 哲病、骨软化和骨肥厚。药剂尤其适用于治疗与骨流失相关联的疾病。 一方面，药剂促 进Ror2蛋白二聚合，从而活化Ror2蛋白。药剂可为任何类型的化合物；然而，小分子、 聚核苷酸、蛋白质和肽尤其适用。在某些实施例中，药剂为针对Ror2蛋白的抗体或抗 体片段。假定在诸如克罗恩氏病(Crohn's disease)和多发性硬化的人类疾病的治疗中 成功使用人化单克隆抗体，通常优选为人化单克隆抗体。在某些实施例中，药剂下调 14-3-3表达，尤其14-3-3p或14-3-3y表达。在某些特定实施例中，药剂为14-3-3P特异 性RNAi、 shRNA或siRNA。也可使用本发明药剂通过以脂肪细胞分化为代价促进成骨 细胞分化来治疗肥胖症、代谢病症或糖尿病。
另一方面，使细胞与活化Ror2蛋白或抑制14-3-3P活性的药剂接触以促进成骨细 胞分化或成骨分化。所接触的细胞通常表达Ror2蛋白或14-3-3卩蛋白且能够经受分化 为成骨细胞表型。在某些实施例中，细胞为干细胞，例如间充质干细胞。可使细胞与药 剂活体内或活体外接触。也可使细胞与药剂离体接触，且接着将其引入有需要的个体(例 如，患有骨相关病症、尤其与骨流失相关联的骨相关病症的个体)中。
也己发现，Ror2过表达和14-3-3|3抑制会抑制成脂分化。因此，活化Ror2蛋白或 抑制14-3-3卩活性的药剂也适用于抑制成脂分化。因此，本发明药剂尤其适用于抑制干 细胞(例如，间充质干细胞)的成脂分化。以这一发现为基础，Ror2活化剂或14-3-3(3 下调剂可适用于治疗或预防肥胖症、糖尿病或其它代谢病症。
本发明也包括一种鉴别调节Ror2活性或表达或调节14-3-3(3蛋白的磷酸化的药剂 的系统。所述筛分系统包括使Ror2蛋白与药剂接触且检测这一药剂对Ror2活性或表达 的作用。检测到Ror2活性或表达增加指示药剂适用于促进骨形成、促进成骨细胞分化 或抑制成脂分化。在某些实施例中，通过测定Ror2蛋白二聚合的程度检定Ror2蛋白的
活性。在其它实施例中，通过测定Ror2蛋白本身或14-3-3(3的磷酸化状态评定Ror2活 性。在其它实施例中，(例如)使用32P Y ATP或使用抗磷酸化酪氨酸抗体的免疫沉淀 (immunoprecipiation)测量Ror2激酶活性。在某些实施例中，检定为使用表达Ror2蛋 白的细胞的基于细胞的检定。在其它实施例中，检定无细胞，且使用纯化或半纯化Ror2 蛋白。使用本发明筛选法鉴别的药剂和其医药组合物尤其适用于本文中所述的本发明治 疗方法。
本发明也提供鉴别促进Ror2蛋白二聚合的药剂的检定。检定尤其经得起筛选大量 预期化合物的高通量技术。使由Ror2蛋白细胞外域组成的嵌合受体与TrkB细胞内域融 合。使Ror2细胞外域二聚合的药剂活化TrkB信号转导通路，从而使得CRE启动子活 性增加。然后，可使用可操作性连接于CRE启动子的报告基因(诸如，荧光素酶)鉴 别使Ror2 二聚合的化合物。Ror2-TrkB嵌合体检定已使用先前已展示使Ror2 二聚合的 抗Ror2抗体加以验证。当与用非特异性IgG处理的细胞相比时，Ror2特异性抗体引起 所观察到的荧光素酶活性的剂量依赖性增加(参见图12)。所述检定提供鉴别活化Ror2 的药剂的高通量且高灵敏度的快速检定。所属领域的技术人员应了解，可使用除TrkB 之外的其它细胞内域来制备嵌合体。在检定中，然后可能需要可操作性连接于报告基因 的不同启动子。由本发明检定鉴别为Ror2的活化剂或二聚合剂(dimerizer)的药剂也 被视为本发明的一部分。
定义
提供以下定义以充分理解本文中所使用的术语和縮写。
除非上下文另有明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所使用，单数形式"一" 和"所述"包括多个参考物。因此，例如，提及"细胞"包括多个所述细胞，且提及"抗 体"是提及一或多个抗体和所属领域的技术人员已知的其等价物等。
说明书中的縮写对应于如下度量单位、技术、性质或化合物"g"意指克，"mg" 意指毫克，"ng"意指纳克，"kDa"意指千道尔顿，"'C"意指摄氏度，"cm"意指厘米， "s"意指秒，"min"意指分钟，"h"意指小时，"1"意指升，"ml"意指毫升，"^il"意 指微升，"pl"意指皮升，"M"意指摩尔浓度，"mM"意指毫摩尔浓度，"mmole"意指 毫摩尔，"kb"意指千碱基，"bp"意指碱基对，且"RT"意指室温。
"高效液相色谱"縮写为HPLC。
"开放阅读框架"縮写为ORF。
"质谱"縮写为MS。
"串联质谱"縮写为MS/MS。
"聚丙烯酰胺凝胶电泳"縮写为PAGE。 "聚合酶链反应"縮写为PCR。 "逆转录酶聚合酶链反应"缩写为RT-PCR。 "十二烷基硫酸钠"缩写为SDS。
"十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳"缩写为SDS-PAGE。 "腺嘌呤核苷酸转运蛋白2"縮写为ADP/ATP载体蛋白。 "骨矿物密度"縮写为BMD。 "核糖体RNA"縮写为rRNA。 "非翻译区"缩写为UTR。
在本揭示案的上下文中，将使用大量术语。如本文中所使用，术语Ror是指受体酪 氨酸激酶样孤儿受体的家族。"Ror分子"是指Ror多肽、Ror蛋白、Ror肽、其片段、 变异体和突变体以及编码Ror多肽、Ror蛋白、Ror肽和其片段或变异体或突变体的核 酸。"Ror分子"也指Ror聚核苷酸、基因和其变异体和突变体。"Ror分子"和"Ror" 是指Rorl与Ror2分子。
"靶Ror分子"是指由本发明的药剂调节活性的Ror分子。靶Ror分子可为Ror多 肽、其同系物、衍生物或片段或变异体或突变体。所关注的Ror分子也可为核酸(RNA 或DNA的寡核苷酸或聚核苷酸)。举例而言，如果Ror基因的蛋白质在实验中受到关 注，那么靶Ror分子将为蛋白质。应理解，术语靶Ror分子是指全长分子与其片段、变 异体和突变体，诸如蛋白质的表位。靶Ror分子可为Rorl分子或Ror2分子或两者。在 某些特定实施例中，靶Ror分子为Ror2蛋白。
术语"14-3-3"是指涉及信号转导的蛋白质的家族。14-3-3蛋白具有大量结合搭配 物且涉及一大群且多样性的细胞过程。14-3-3蛋白通过结合其靶且引起(1)构形变化； (2)序列特异性或结构蛋白特征的物理阻塞和/或(3)搭支架来发挥其作用。数篇关于 14-3-3蛋白的结构和功能的评论文章为布里治斯(Bridges)和莫赫德(Moorhead), "14-3-3蛋白 一种编号蛋白质的多种功能"("14-3-3 proteins: A Number of Functions for a Numbered Protein,")信号存导,/7択豕裙re 10, 2004;麦金托什 (Mackintosh) , "14-3-3蛋白与磷酸蛋白之间的动态相互作用调控多样性细胞过程" ("Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins regulate diverse cellular processes,")全激众学染,吉^Bioc/zew. /) 381:329-42， 2004;其各自以引用的方 式并入本文中。"14陽3-3"可指14-3-3多肽、14-3-3蛋白、14-3-3肽、其14-3-3片段、
14-3-3变异体和14-3-3突变体以及编码14-3-3多肽、14-3-3蛋白、14-3-3肽和其14-3-3
片段或14-3-3变异体或14-3-3突变体的核酸。已鉴别14-3-3的数种同功异型物，包括 P、 s、 q、Y、 t、《和o。已发现，Ror2蛋白的活化导致同功异型物14-3-3卩磷酸化。 已发现，14-3-3|3和14-3-3Y都与Ror2相互作用。在某些情况下，尤其提及14-3-3p。在 某些其它情况下，尤其提及14-3-3y。
术语"核酸分子"是指核糖核苷酸(RNA分子)或脱氧核糖核苷酸(DNA分子) 的磷酸酯形式或呈单链形式或双链螺旋形式的任何磷酸二酯类似物。可能为双链 DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA螺旋形式。术语核酸分子且具体来说DNA或RNA 分子是指分子的一级结构和二级结构且不将其局限于任何特定三级形式。因此，这一术 语包括线状(例如，限制片段)或环状DNA分子、质体和染色体中可见的双链DNA。 在讨论特定双链DNA分子的结构时，可根据仅给出沿DNA的非转录链(即，具有与 mRNA同源的序列的链)5'到3'方向的序列的正常规定来描述序列。
"重组核酸分子"为经受分子生物操作的核酸分子，即，非天然存在的核酸分子或 基因工程化核酸分子。此外，术语"重组DNA分子"是指非天然存在的核酸序列或可 通过人工组合核酸序列的两个分开的片段(即，通过将通常不连续的DNA碎片连接在 一起)所制造的核酸序列。"重组产生"意指人工组合，其通常通过化学合成方法或通 过人工操作核酸的经分离片段来实现，例如通过使用限制酶、连接酶的基因工程技术和 如以下文献中所述的类似重组技术来实现例如山姆布鲁克(Sambrook)等人，分子克 隆(Molecular Cloning),第2版，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory)，普 莱恩维尤(Plainview),纽约(N.Y.) ,(1989);或阿苏贝尔(Ausubel)等人，分子生物 学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology),实验指南(Current Protocols) (1989);禾卩DNA克隆实践方法(DNACloning: A Practical Approach),第I巻和第II 巻(迪'尼'高尔芙(D.N. Glover)编)，IREL出版社(IREL Press),牛津(Oxford), (1985); 其各自以引用的方式并入本文中。
所述操作可用编码相同或保守性氨基酸的冗余密码子替换密码子，同时通常引入或
去除序列识别位点来进行。或者，可通过将具有合乎需要的功能的核酸片段结合在一起
以产生包含常见天然形式中不可见的合乎需要的功能组合的单一遗传实体来执行。限制
酶识别位点通常为所述人工操作的耙，但可故意并入其它位点特异性靶，例如启动子、
DNA复制位点、调控序列、控制序列、开放阅读框架或其它适用的特征。重组核酸分
子的实例包括重组载体，诸如含有呈5'到3'(有义)定向或3'到5'(反义)定向的编码
Ror家族蛋白或免疫球蛋白蛋白的DNA序列的克隆或表达载体。
术语"聚核苷酸"、"核苷酸序列"、"核酸"、"核酸分子"、"核酸序列"和"寡核苷
酸"是指DNA和RNA中的一系列核苷酸碱基(也称为"核苷酸")且意指任何两个或 两个以上核苷酸的链。聚核苷酸可为单链或双链嵌合混合物或其衍生物或经修饰形式。 寡核苷酸可在碱基部分、糖部分或磷酸盐主链处经修饰(例如)以改良分子的稳定性、 其杂交参数等。反义寡核苷酸可包含经修饰碱基部分，所述部分选自如下群组，包括(但 不限于)5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿核苷、5-羧基甲 基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、p-D-半乳糖基Q核苷(galactosylqueosine)、肌苷、 N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基 甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、P-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧基甲 基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、丁氧核苷(wybutoxosine)、 假尿嘧啶(pseudouracil)、 Q核苷(queosine)、 2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫 尿嘧淀、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。核苷酸序列通 常携带遗传信息，包括细胞机构用于制造蛋白质和酶的信息。这些术语包括双链或单链 基因组和cDNA、 RNA、任何合成和经基因操作的聚核苷酸和有义聚核苷酸与反义聚核 苷酸。其包括单链和双链分子，艮卩，DNA-DNA、 DNA-RNA和RNA-RNA杂交物以及 通过使碱与氨基酸主链共轭而形成的"蛋白核酸"(PNA)。其也包括含有经修饰碱基(例 如，硫尿嘧啶、硫鸟嘌呤和氟尿嘧啶)或含有碳水化合物或脂质的核酸。
本发明的聚核苷酸可由所属领域中已知的标准方法合成，例如，通过使用自动DNA 合成器(诸如，可购自生物搜索(Biosearch)、美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)等的合成器)合成。举例来说，可根据斯坦因(Stein)等人，核酸研究(Nucl. Acids Res.) , 16, 3209(1988)的方法合成硫代磷酸酯寡核苷酸，可通过使用受控微孔玻璃 聚合物支撑物(沙林(Sarin)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.) 85, 7448-7451(1988))制备膦酸甲酯寡核苷酸等。已研发多种向细胞传递反义DNA或 RNA的方法，例如，可将反义分子直接注射到组织位点，或可全身性投与经设计以靶 向合乎需要的细胞的经修饰反义分子(连接于特异性结合表达于靶细胞表面的受体或抗 原的肽或抗体的反义分子)。或者，可通过活体外和活体内转录编码反义RNA分子的 DNA序列产生RNA分子。可将所述DNA序列并入多种合并有合适RNA聚合酶启动 子(诸如T7或SP6聚合酶启动子)的载体中。或者，可将视所使用的启动子而定组成
性或可诱导性合成反义RNA的反义cDNA构筑体稳定地引入细胞系中。然而，通常难以达成足以抑制内源性mRNA翻译的反义分子的细胞内浓度。因此，优选方法利用在 强启动子的控制下放置反义寡核苷酸的重组DNA构筑体。使用所述构筑体转染患者的 靶细胞将达成足量单链RNA的转录，这些RNA将与内源性靶基因转录物形成互补碱 基对，且从而阻止耙基因mRNA的翻译。举例来说，可活体内引入载体以致其由细胞 占据且引导反义RNA的转录。所述载体可仍为游离型或变得在染色体上整合，只要其 可转录以产生合乎需要的反义RNA即可。所述载体可由所属领域中的标准DNA重组 技术方法构筑。载体可为用于在哺乳动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或所属领域中 已知的其它类似物。编码反义RNA的序列的表达可通过所属领域中已知的任何启动子 作用于哺乳动物细胞，较佳人类细胞。所述启动子可为可诱导性的或组成性的。所述启 动子包括(但不限于)SV40早期启动子区(贝诺斯特(Bernoist)和査波(Chambon), 自然(Nature) ,290,304-310(1981))、在劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)的3'长末 端重复序列中所含的启动子(山本(Yamamoto)等人，细胞(Cell) , 22, 787-797(1980))、 疱疹胸苷激酶启动子(瓦格纳(Wagner )等人，美国国家科学院院刊，78, 1441—1445(1981))金属硫蛋白基因的调控序列(布因斯特(Brinster)等人，自然(Nature), 296, 39-42(1982))等。可使用任何类型的质粒、柯斯质粒(cosmid)、酵母人工染色体 或病毒载体来制备可直接引入组织位点中的重组DNA构筑体。或者，可使用选择性感 染合乎需要的组织的病毒载体，在此状况下，可通过另一途径(例如，全身性)实现投 药。
聚核苷酸可由天然调控(表达控制)序列侧接，或可与异源序列缔合，这些异源序 列包括启动子、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)和其它核糖 体结合位点序列、强化子、反应元件、抑制因子、信号序列、聚腺嘌呤序列、内含子、 5'和3'非编码区和其类似物。核酸也可由所属领域中已知的多种方法修饰。所述修饰的 非限制性实例包括甲基化、"加帽"、用类似物取代一或多个天然存在的核苷酸和核苷酸 间修饰，诸如使用不带电键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯、氨基甲酸酯等) 和带电键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的核苷酸间修饰。聚核苷酸可含有 一或多个其它共价连接的部分，诸如蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚 -L-赖氨酸等)、嵌入剂(intercalator)(例如，吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如，金 属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷基化剂(alkylator)。可通过形成磷酸三甲酯 或磷酸三乙酯或磷酰胺垸基酯键联来衍生聚核苷酸。此外，本文中的聚核苷酸也可用能
够提供直接或间接可检测信号的标记来修饰。例示性标记包括放射性同位素、荧光分子、 生物素和其类似物。
"RNA转录物"是指由DNA序列的RNA聚合酶催化转录产生的产物。当RNA转 录物是DNA序列的互补复本时，将其称为一级转录物，或其可为源自一级转录物的转 录后加工的RNA序列且称为成熟RNA。"信使RNA (mRNA)"是指无内含子且可由细 胞翻译为多肽的RNA。 "cRNA"是指由重组cDNA模板转录的互补RNA。 "cDNA"是 指与mRNA模板互补且源自mRNA模板的DNA。 cDNA可为单链形式或使用(例如) DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)转化为双链形式。
与RNA的部分"互补"的序列是指具有足以能够与RNA杂交的互补性，从而形 成稳定双螺旋的序列；在双链反义核酸的状况下，因此可测试双螺旋DNA的单一链或 可检定三螺旋的形成。杂交能力将视互补性程度与反义核酸的长度而定。通常，杂交核 酸越长，其可能含有且又形成稳定双螺旋(或三螺旋，视情况而定)的RNA的碱基错 配越多。所属领域的技术人员通过使用标准程序探知错配的可容许程度，从而确定杂交 复合物的熔点。
术语"核酸"或"核酸序列"、"核酸分子"、"核酸片段"或"聚核苷酸"可与"基 因"、"基因编码的mRNA"和"cDNA"互换使用。
术语"编码多肽的聚核苷酸"涵盖可仅包括编码序列的聚核苷酸以及可包括额外编 码或非编码序列的聚核苷酸。
当核酸分子的单链形式可在适当温度和溶液离子强度条件下与另一核酸分子(诸如
cDNA、基因组DNA或RNA)退火时，那么核酸分子与这另一核酸分子"可杂交"，山
姆布鲁克'杰(Sambrook, J.)等人编，分子克隆(Molecular Cloning):实验手册(A
Laboratory Manual)(第2版，1989),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory
Press)，纽约，第1-3巻(ISBN 0-87969-309-6)。温度和离子强度条件决定杂交的"严
格程度"。对于初步筛选同源核酸，可使用对应于Tm为55'C的低严格杂交条件，例如，
5XSSC， 0.1%SDS, 0.25%乳汁且无甲酰胺；或30％甲酰胺，5XSSC， 0.5% SDS。中
等严格杂交条件对应于较高Tm，例如，40%甲酰胺，5X或6XSSC。高严格杂交条件
对应于最高Tm，例如，50%甲酰胺，5X或6XSSC。杂交要求两个核酸都含有互补序
列，但视杂交的严格程度而定，碱基之间的错配也是可能的。适于使核酸杂交的严格程
度视所属领域中熟知的变量核酸的长度和互补程度而定。两个核苷酸序列之间的相似度
或同源性越大，具有这些序列的核酸杂交物的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对
应于较高Tm)按以下顺序降低RNA:RNA、 DNA:RNA、 DNA:DNA。对于长度大于
100个核苷酸的杂交物，已推导出计算Tm的等式，山姆布鲁克(Sambrook)等人编，分
子克隆(Molecular Cloning):实验手册(A Laboratory Manual)(第2版，1989),冷泉
港实验室出版社，NY.第1-3巻(ISBN 0-87969-309-6, 9.50-9.51)。对于与较短核酸(艮P ， 寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，且寡核苷酸的长度决定其特异性，山姆布 鲁克(Sambrook)等人编，分子克隆(Molecular Cloning):实验手册(A Laboratory Manual)(第2版，1989),冷泉港实验室出版社，NY.第1-3巻(ISBN 0-87969-309-6, 11.7 -11.8)。
术语"互补"用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。举例来说，对DNA 来说，腺苷与胸腺嘧啶互补且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。
如所属领域中已知，"一致性"或"相似性"为如通过比较序列所确定的两个或两 个以上多肽序列或两个或两个以上聚核苷酸序列之间的关系。在所属领域中， 一致性视 情况而定也意指如通过所述序列的链之间的匹配所确定的多肽或聚核苷酸序列之间的 序列相关程度。 一致性与相似性可由己知方法容易地计算，所述方法诸如以下文献中所 述的方法计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，莱斯克'阿'米(Lesk, A.M.)编，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约(New York) ，1988;生 物计算信息学和基因组专题(Biocomputing: Informatics and Genome Projects)，史密 斯-迪.沃(Smith, D. W.)编，学术出版社(Academic Press),纽约(New York) ,1993; 分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology),凡-海耳卩'吉(von Heinje, G),学术出版社(Academic Press) ， 1987;序列数据的计算机分析第I部分 (Computer Analysis of Sequence Data, Parti),格里菲因'阿'米(Griffin, A. M.)和格里 菲因'赫'吉(Griffin, H. G.)编，胡玛纳出版社(Humana Press),新泽西州(New Jersey), 1994;和序列分析引物(Sequence Analysis Primer),吉布考夫'米(Gribskov, M.)和德 夫莱克.杰(Devereux, J.)编，米斯托克顿出版社(M Stockton Press),纽约(New York), 1991。通常用于测定序列之间的一致性或相似性的方法包括(但不限于)卡里罗赫 (Carillo, H.)和里皮曼迪(Lipman, D.) ， SIAM应用数学(SIAM J Applied Math. ),48:1073 (1988)中所揭示的方法。测定一致性和相似性的方法以公开可用的计算机程序编纂。测 定两个序列之间的一致性和相似性的优选计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序 包(德夫莱克杰(Devereux, J.)等人，核酸研究(Nucleic Acids Research) , 12(1), 387 (1984))、 BLASTP、 BLASTN和FASTA (阿特舒尔法(Atschul, S. F.)等人，分子生物 学杂志(JMolec. Biol.) ,215,403(1990))。
"同源"是指两个聚合物(即，多肽分子或核酸分子)之间的序列相似性程度。本
文中所提及的同源性％数字反映两个聚合物之间的最大同源可能性，即，当两个聚合物
经比对具有最多匹配(同源)位置数目时的同源性％。
术语"同源性°/。"是指多肽之间的氨基酸序列一致性的程度。任何两个多肽之间的 同源性为任一序列中给定位置处的匹配氨基酸的总数的直接函数，例如，如果任一序列 中的氨基酸总数的一半相同，那么认为两个序列展现50%同源性。
当术语"片段"、"类似物"和"衍生物"提及多肽时是指可保留与原始多肽基本上 相同的生物功能或活性的多肽。因此，类似物包括可通过裂解前体蛋白部分以产生活性 成熟多肽来活化的前体蛋白。多肽的片段、类似物或衍生物可为其中一或多个氨基酸经 保守或非保守氨基酸残基取代且这些氨基酸残基可能为或可能不为遗传密码编码的残 基的片段、类似物或衍生物，或其中一或多个氨基酸残基包括一个取代基的片段、类似 物或衍生物，或其中使多肽与诸如聚乙二醇的化合物融合以增加多肽的半衰期的片段、 类似物或衍生物，或其中使其它氨基酸与多肽融合的片段、类似物或衍生物，诸如信号 肽或用于纯化所述多肽或前体蛋白的序列(诸如聚组氨酸标签)。认为所述片段、类似 物或衍生物在本发明的范畴内。
聚核苷酸序列的"保守"残基是所比较的两个或两个以上相关序列的相同位置中未 改变的那些残基。相对保守的残基是在相关序列中比序列中其它地方所出现的残基保守 的那些残基。
相关聚核苷酸是共享大比例的一致残基的聚核苷酸。
如果一个聚核苷酸最终源自另一聚核苷酸，那么所述不同聚核苷酸彼此"对应"。 举例来说，信使RNA对应于转录为所述RNA的基因。cDNA对应于(诸如)通过逆转 录反应或通过基于RNA序列的知识的DNA化学合成产生所述cDNA的RNA。 cDNA 也对应于编码RNA的基因。如果聚核苷酸起相似作用，诸如编码所比较的不同物种、 菌株或变异体中的相关多肽，那么其也彼此"对应"。
DNA、 RNA或聚核苷酸的"类似物"是指形式和/或功能(例如，参与序列与互补 聚核苷酸序列上的碱基对的特异性氢键结的能力)上类似天然存在的聚核苷酸但某些方 面与DNA或RNA不同(例如，具有不常见或非天然碱基或经改变主链)的分子。例 如参见，乌尔曼(Uhlmann)等人,化学综述(Chemical Reviews) 90,543-584(1990)。
"编码序列"或"编码"诸如RNA、多肽或蛋白质的表达产物的序列是在表达时导 致产生所述RNA、多肽或蛋白质(例如，酶)的核苷酸序列，即，编码所述多肽或蛋 白质的氨基酸序列的核苷酸序列。
氨基酸或核苷酸序列的"实质性部分"是包含多肽氨基酸序列或基因核苷酸序列的 足够部分，从而由所属领域的技术人员通过手动评估序列或使用算法通过计算机自动序 列比较和鉴别来推定性鉴别所述多肽或基因的部分，所述算法诸如基本局部比对搜索工
具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST;阿特舒尔'斯'法(Altschul, S. F.)等人, 生物学分子杂志 (j. Mol. Biol. ) 215, 403-410(1993); 亦参见 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。
因此，核苷酸序列的"实质性部分"包含所述序列的足够部分，从而特异性鉴别和 /或分离包含所述序列的核酸片段的序列。现在，享有本文中所报导的序列权利的所属 领域的技术人员可使用整个所揭示的序列或其实质性部分来达成所属领域的技术人员 己知的目的。
"合成基因"可由使用所属领域的技术人员已知的程序化学合成的寡核苷酸构建块 装配。连接这些构建块且使其退火以形成基因片段，然后酶促装配这些基因片段以构筑 整个基因。"化学合成"当与DNA序列相关时意指活体外装配组分核苷酸。可使用熟 知程序实现DNA的手动化学合成，或可使用若干市售机器中的一种执行自动化学合成。 因此，可基于反映宿主细胞的密码子偏好的核苷酸序列优化来修整基因以达成最佳基因 表达。所属领域的技术人员应了解当密码子使用偏向于宿主偏爱的那些密码子时实现成 功基因表达的可能性。可基于对源自序列信息可用的宿主细胞的基因的观察来确定优选 密码子。
"基因"是指表达特定蛋白质的核酸片段，包括编码序列的前置调控序列(5'非编 码序列)和编码序列的后置调控序列(3'非编码序列)。"原生基因"是指自然界中可见 的具有自身调控序列的基因。"嵌合基因"或"嵌合构筑体"是指不为原生基因的包含 自然界中未在一起发现的调控序列和编码序列的任何基因或构筑体。因此，嵌合基因或 嵌合构筑体可包含源自不同来源的调控序列和编码序列或源自相同来源但以不同于自 然界中可见方式的方式排列的调控序列和编码序列。"内源性基因"是指位于生物体基 因组中的天然位置处的原生基因。"外源"基因是指宿主生物体中通常不可见但通过基 因转移引入宿主生物体中的基因。外源基因可包含插入非原生生物体中的原生基因或嵌 合基因。"转基因"是已通过转型程序引入基因组中的基因。
"调控序列"是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列) 且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调控序列可包 括启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺嘌呤识别序列。
"基因控制序列"是指起始基因转录所需的DNA序列加上调控起始发生的速率所 需的DNA序列。因此，基因控制序列可由启动子组成，其中一般转录因子和聚合酶加 上基因调控蛋白质所结合的控制启动子中这些装配过程的速率的所有调控序列一起装 配。举例来说，适于原核生物的控制序列可包括启动子、视情况算子序列和核糖体结合
位点。真核细胞可利用启动子、强化子和/或聚腺嘌呤信号。
"启动子"是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列。编码序列通 常位于启动子序列的3'处。启动子序列由近端和较远端上游元件组成，后者元件通常称 为强化子。因此，"强化子"是可刺激启动子活性且可为启动子的先天元件或经插入以 增强启动子的表达水平或组织特异性的异源元件的核苷酸序列。启动子可整体源自原生 基因或包含源自自然界中可见的不同启动子的不同元件或甚至包含合成核苷酸片段。所 属领域的技术人员应了解，不同启动子可引导不同组织或细胞类型中或不同发展阶段或 对不同环境条件起反应的基因表达。
"3'非编码序列"是指位于编码序列下游且包括聚腺嘌呤识别序列和编码能够影响 mRNA加工或基因表达的调控信号的其它序列的核苷酸序列。聚腺嘌呤信号的特征通 常在于影响向mRNA前体的3'端添加多聚腺苷酸序列段(polyadenylic acid tract)。
"翻译前导序列"是指位于基因的启动子序列与编码序列之间的核苷酸序列。翻译 前导序列出现在翻译起始序列的经完全加工的mRNA上游。翻译前导序列可影响一级 转录物加工为mRNA、 mRNA稳定性或翻译效率。
术语"操作性连接"是指使两个或两个以上核酸片段缔合为单一核酸片段以使一个 的功能受另一个影响。举例来说，当启动子能够影响编码序列的表达时，启动子与这一 编码序列操作性连接(即，编码序列处于启动子的转录控制下)。编码序列可以有义或 反义定向与调控序列操作性连接。术语"在骨细胞中可操作的启动子"是指由骨细胞的 RNA聚合酶识别的启动子。
"RNA转录物"是指由DNA序列的RNA聚合酶催化转录产生的产物。当RNA转 录物是DNA序列的完美互补复本时，将其称为一级转录物，或其可为源自一级转录物 的转录后加工的RNA序列且称为成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"是指无内含子且可 翻译为多肽的RNA。 "cDNA"是指与mRNA互补且源自mRNA的双链DNA。"有义" RNA是指包括mRNA且因此可由细胞翻译为多肽的RNA转录物。"反义RNA"是指与 整个耙一级转录物或mRNA或其部分互补且阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见美 国专利第5,107,065号，其以引用的方式并入本文中)。反义RNA的互补性可针对特定 核苷酸序列的任何部分，即，在5'非编码序列、3'非编码序列、内含子或编码序列处。 "功能性RNA"是指有义RNA、反义RNA、核糖酶RNA或可能未被翻译但仍对细胞过 程产生影响的其它RNA。
术语"表达"是指源自本发明核酸片段的有义RNA (mRNA)或反义RNA的转录 和稳定累积。表达也可指将mRNA翻译为多肽。"反义抑制"是指产生能够抑制靶蛋白
质表达的反义RNA转录物。
"过表达"是指在生物体中产生超过正常或非转型生物体中的产生水平的基因产物。 "抑制"是指抑制外源或内源性基因或RNA转录物的表达。
"改变水平"是指在生物体中产生与正常或非转型生物体不同的量或比例的基因产 物。本发明的多肽的过表达可通过首先构筑其中编码区与能够在合乎需要的发展阶段引 导基因或构筑体表达于合乎需要的组织中的启动子操作性连接的嵌合基因或嵌合构筑 体来实现。出于简便的考虑，嵌合基因或嵌合构筑体可包含源自相同基因的启动子序列 和翻译前导序列。也可提供编码转录终止信号的3'非编码序列。本发明嵌合基因或嵌合 构筑体也可包含一或多个内含子以促进基因表达。然后，可构筑包含本发明嵌合基因或 嵌合构筑体的质粒载体。质粒载体的选择取决于将用于使宿主细胞转型的方法。所属领 域的技术人员充分认识到为成功转型、选择和繁殖含有嵌合基因或嵌合构筑体的宿主细 胞，遗传元件必须存在于质粒载体上。所属领域的技术人员也应认识到，不同的独立转 型事件将产生不同的表达水平和模式(琼斯(Jones)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.) ,4,2411-2418, (1985);德阿美达(De Almeida)等人，分子和普通遗传学(Mol. Gen. Genetics) , 218, 78-86， (1989))，且因此为获得呈现合乎需要的表达水平和模式的细胞 系必须筛选多个事件。所述筛选可通过DNA的南方分析(southern analysis)、 mRNA 表达的北方分析(northern analysis)、蛋白质表达的西方分析(western analysis)或免疫 细胞化学分析或表型分析来实现。
术语"变异体"指Ror分子的核酸或氨基酸序列的变异。术语"变异体"涵盖Ror 分子的核苷酸和氨基酸取代、添加或缺失。术语"变异体"也涵盖化学修饰的天然和合 成Ror分子。举例来说，变异体可指不同于参考多肽的多肽。在氨基酸序列方面与参考 多肽不同的多肽与参考多肽之间的差异通常是有限的以使参考多肽和变异体的氨基酸 序列总体上非常类似，且在一些区中一致。变异体和参考多肽在氨基酸序列方面可能因 一或多个可为保守性或非保守性的且可以任何组合存在的取代、缺失、添加、融合和截 断而不同。举例来说，变异体可为其中以任何组合插入、取代或缺失数个，例如50至 30、 30至20、 20至10、 10至5、 5至3、 3至2、 2至1或1个氨基酸的多肽。另夕卜， 变异体可为因诸如末端或内部缺失而比参考序列短，从而与参考多肽序列不同的本发明 多肽的片段。本发明的多肽的变异体也包括保留与所述多肽基本上相同的生物功能或活 性的多肽，例如可通过裂解前体部分以产生活性成熟多肽而活化的前体蛋白。这些变异 体可为以编码蛋白质的结构基因的核苷酸序列的差异为特征的等位基因变异或可包括 分化剪接或翻译后修饰。变异体也包括具有大体上相同的生物活性但获自不同物种的相
关蛋白质。所属领域的技术人员可产生具有单一或多个氨基酸取代、缺失、添加或替换 的变异体。这些变异体尤其可包括(i)其中一或多个氨基酸残基经保守或非保守氨基 酸残基(优选保守氨基酸残基)取代且这些取代氨基酸残基可能为或可能不为遗传密码 编码的氨基酸残基的变异体，或(ii)其中肽或蛋白质缺失一或多个氨基酸的变异体， 或(Hi)其中多肽或蛋白质添加有一或多个氨基酸的变异体，或(iv)其中一或多个氨 基酸残基包括一个取代基的变异体，或(V)其中成熟多肽与另一化合物融合的变异体， 所述化合物诸如增加多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇，或(vi)其中其它氨基酸与 成熟多肽融合的变异体，诸如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或前体蛋 白序列。多肽的变异体也可为天然存在的变异体(诸如天然存在的等位基因变异体)或 其可为尚不知是否天然存在的变异体。认为以上所界定的所有这些变异体都在所属领域 的教示的范畴内。
本发明的多肽和聚核苷酸优选以经分离形式提供且可纯化为均一的。在某些情况 下，多肽和聚核苷酸为至少卯％纯、至少95%纯、至少98%纯或至少99%纯。
术语"经分离"意指自原始或原生环境(例如，如果天然存在，那么为自然环境) 移出的物质。因此，存在于活动物中的天然存在的聚核苷酸或多肽不是经分离的，而通 过人为介入与自然系统中的部分或所有共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽是经分离 的。举例来说，"经分离核酸片段"为视情况含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基的 单链或双链RNA或DNA的聚合物。呈DNA聚合物形式的经分离核酸片段可包含 cDNA、基因组DNA或合成DNA的一或多个片段且可与碳水化合物、脂质、蛋白质或 其它物质结合。所述聚核苷酸可为载体的部分和/或所述聚核苷酸或多肽可为组合物的 部分，但其仍为经分离的，因为所述载体或组合物不是其在自然界中可见时所处的环境 的部分。类似地，术语"大体上纯化"是指已通过人为介入与在自然界中存在时所处的 直接化学环境分离或自其中移出的物质。大体上纯化的多肽或核酸可通过所属领域中通 常巳知的若干技术和程序中的任一种获得或产生。
术语"纯化"是指增加样品中特定多肽的比活性或浓度。在一实施例中，比活性以 样品中靶多肽的活性与总多肽的浓度之间的比率表示。在另一实施例中，比活性以靶多 肽的浓度与总多肽的浓度之间的比率表示。纯化方法包括(但不限于)透析、离心和柱 色谱技术，其为所属领域技术人员熟知的程序。例如参见杨(Yoimg)等人，1997，"转 基因产乳动物乳汁中生物医药蛋白质的产生"("Production of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animals,",生物制药(BioPharm) , 10(6): 34-38。
术语"大体上纯"和"经分离"不打算排除聚核苷酸或多肽与自然界中不与聚核苷
酸或多肽缔合的物质的混合物。 .
术语"细胞"、"细胞系"和"细胞培养物"可互换使用。所有这些术语也包括其子 代，子代可为任何后代和所有后代。应了解，归因于故意或偶然突变，所有子代可能并 不相同。在表达异源核酸序列的情况下，"宿主细胞"是指位于活体外或活体内的原核 或真核细胞(例如，诸如大肠杆菌(E.coli)的细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、 禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼细胞和昆虫细胞)。举例来说，宿主且可包括 能够复制细胞的任何可转型生物体可位于转基因动物中。宿主细胞可用作载体载体的接 受者和/或表达由载体编码的异源核酸。
表达和回收由哺乳动物细胞系统产生的外源蛋白质的一般方法由(例如)艾芝华里 (Etcheverry ),"哺乳动物细胞培养物中工程化蛋白质的表达"("Expression of Engineered Proteins in Mammalian Cell Culture,"),蛋白质工程原理和实践(Protein Engineering: Principles and Practice),克里夫兰(Cleland)等人(编),第163页(威利 -利斯公司(Wiley-Liss,Inc.) , 1996)提供。回收由细菌系统产生的蛋白质的标准技术由 (例如)格里斯罕默(Grisshammer)等人，"由大肠杆菌细胞过量产生的蛋白质的纯化" ("Purification of over-produced proteins from E. coli cells,"), DNA克隆2:表达系统(DNA Cloning 2: Expression Systems),第2版，高尔芙(Glover)(编)，第59-92页(牛津大 学出版社(Oxford University Press) , 1995)提供。昆虫细胞的转型和其中外源多肽的产 生由加里诺(Guarino)等人的US5162222和WIPO公开案WO94/06463揭示。从杆状 病毒系统中分离重组蛋白质的方法也由里査德森(Richardson)(编)，"杆状病毒表达方 案"("Baculovirus Expression Protocols")(胡玛纳出版丰土公司(The Humana Press, Inc.), 1995)描述。在一实施例中，本发明的多肽可使用杆状病毒表达系统表达(参见，鲁克 尤(Luckow)等人，生物/技术(Bio/Technology) , 1988,6,47;"杆状病毒表达载体: 实验手册"("Baculovirus Expression Vectors: a Laboratory Manual"),奥里禾U (O'Rielly) 等人(编)，W. H.自由民公司(W. H. Freeman and Company),纽约(New York) ,1992; US4,879,236，其各自以全文引用的方式并入本文中)。另外，可使用MAXBAC.TM.完 全杆状病毒表达系统(英杰(Invitrogen))(例如)在昆虫细胞中产生。
本发明的多肽也可通过利用特定性质分离。举例来说，可使用固定金属离子吸附 (IMAC)色谱来纯化富组氨酸蛋白质，包括那些包含聚组氨酸标签的蛋白质。简言之， 首先使凝胶携带二价金属离子以形成螯合物(沙考斯奇(Sulkowski),生物化学中的趋 势(Trends in Biochem) 3:1(1985))。富组氨酸蛋白质将以视所使用的金属离子而不同 的亲和力吸附于这一基质，且将通过竞争性洗脱、降低pH值或使用强螯合剂而洗脱。
其它纯化方法包括通过凝集素亲和色谱法和离子交换色谱法纯化糖基化蛋白质(米德仕 彻(编)，酶学方法(Meth. Enzymol.) 182:529(19卯))。在本发明的其它实施例中，可构 筑所关注的多肽与亲和力标签(例如，麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白域)的融合物以促 进纯化。
本发明的宿主细胞可用于大规模生产Ror多肽的方法中，其中使细胞在合适培养基 中生长，且根据所属领域已知的纯化方法从细胞中或从细胞生长所处的培养基中分离合 乎需要的多肽产物，所述纯化方法例如常规色谱法，包括免疫亲和色谱法、受体亲和色 谱法、疏水性相互作用色谱法、凝集素亲和色谱法、尺寸排除过滤、阳离子或阴离子交 换色谱法、高压液相色谱法(HPLC)、反相HPLC和其类似方法。其它纯化方法包括如 下方法，其中合乎需要的蛋白质以具有由特异性结合搭配物或药剂识别的特异性标签、 标记或螯合部分的融合蛋白形式表达且纯化。可使纯化蛋白质裂解以产生合乎需要的蛋 白质，或可以完整融合蛋白形式保留。融合组分的裂解可产生具有由裂解过程所产生的 其它氨基酸残基的合乎需要的蛋白质形式。
术语"活体外"是指人工环境和人工环境内所发生的反应或过程。活体外环境包括 (但不限于)试管和细胞培养物。术语"活体内"是指天然环境(例如，动物或细胞) 和天然环境内所发生的过程或反应。
本发明的方法可使用细胞(培养细胞)和细胞溶解产物(包括核提取物)活体外执 行。预期鉴别调节骨形成的药剂的细胞的实例包括(但不限于)颅盖骨细胞、成骨细胞、 破骨细胞、软骨细胞和多能前体细胞，诸如多能骨髓基质细胞。成骨细胞和成骨细胞前 体细胞系的特定实例包括MC3T3-E1、 C2C12、 MG-63细胞、U20S细胞、UMR106细 胞、ROS 17/2.8细胞、SaOS-2细胞和ATCC目录中所提供的类似物(WO 01/19855)以 及以下文献中所述的HOB细胞系波汀'皮'维(BodinePV)，弗农'斯'肯(Vernon SK), 考姆.布'斯(Komm BS.)，内分泌学(Endocrinology) , 137, 4592-4604, (1996);波 汀'皮.维'恩(BodinePVN),曲尔史密斯'米(TrailSmith M),考姆'布'斯(KommBS.), 骨与矿物质研究杂志(JBoneMinRes) , 11,806-819,(1996);波汀'皮'维(BodinePV)， 格林.杰(GreenJ),哈里斯.赫'阿(Harris HA),布哈特-里'阿(Bhat RA),斯坦因'吉邻 (Stein GS)，利安'杰.布(Lian JB)，考姆.布'斯(Komm BS.),细胞生物化学杂志(J Cell Biochem) ,65,368-387,(1997);波汀'皮'维(BodinePV)，考姆'布'斯(KommBS.),骨 (Bone) ,25,535-43 (1999);波汀'皮'维'恩(BodinePVN),哈里斯'赫'阿(Harris HA), 考姆.布.斯(KommBS.),内分泌学(Endocrinology) , 140,2439-2451,(1999);普林斯-米 (Prince M)，班纳耶'希(BanerjeeC),贾维德'阿(JavedA)，格林,杰(GreenJ),利
安-杰'布(LianJB),斯坦因'吉'斯(Stein GS),波汀'皮'维(BodinePV),考姆'布-斯 (KommBS),细胞生物化学杂志(J Cell Biochem) , 80， 424-40， (2001)。本发明的方法 也可使用无细胞系统执行。
术语"表达系统"是指处于合适条件下的宿主细胞和兼容性载体，所述条件(例如) 适于编码载体所携带且引入宿主细胞中的外源DNA的蛋白质的表达。常见表达系统包 括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体以及哺乳动物宿主细胞 和载体。
"转型"是指将核酸片段转移至宿主生物体的基因组中，从而产生遗传上稳定的遗 传。含有转型核酸片段的宿主生物体称为"转基因"生物体。
术语"分化"是指具有与组织或细胞的原始类型不同的特征或功能。因此，"分化" 是分化过程或分化作用。
术语"成骨细胞分化"是指细胞在成熟化为成骨细胞期间发育专门功能的过程。成 骨细胞分化可包括成骨前体细胞、早期和成熟成骨细胞、骨前体细胞和成熟骨细胞阶段 (波汀(Bodine)等人，维生素和激素65 (Vitamins and Hormones 65) ,101-151 (2002); 斯坦因(Stein)等人，内分泌综述(Endocrine Reviews), 14,424-442 (1993)和利安(Lian) 等人，维生素和激素55 (Vitamins and Hormones 55) ,443-509 (1999))。
术语"增生"是指类似细胞的生长和产生。
术语"表型"是指细胞或生物体的可观察到的特征。所述可观察到的特征可包括物 理外观以及特定生理学组合物存在于细胞或生物体中的含量。成骨细胞表型包括表达数 种标记物蛋白，诸如骨特异性转录因子Cbfal; I型胶原；碱性磷酸酯酶、骨钙素；和 骨涎蛋白 (bone sialoprotein )。
如本文中所使用，术语"结合搭配物"或"相互作用蛋白"是指能够特异性结合另 一分子的分子，例如抗原与抗原特异性抗体或酶与其抑制剂。结合搭配物可包括(例如) 生物素与抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌、IgG与蛋白A、受体-配位体偶合物、蛋白质-
蛋白质相互作用和互补聚核苷酸链。术语"结合搭配物"也可指与细胞中的激酶结合的 多肽、脂质、小分子或核酸。激酶与结合搭配物之间的相互作用的变化本身可通过形成 相互作用的概率的增加或降低或激酶-结合搭配物复合物的浓度的增加或减小来显现。 举例来说，Rorl或Ror2蛋白可与另一蛋白质或多肽结合且形成可导致调节Rorl或Ror2
活性的复合物。
术语"信号转导通路"是指将细胞外信号传播通过细胞膜变为细胞内信号的分子。
这一信号然后可刺激细胞反应。涉及信号转导过程的多肽分子可为受体和非受体蛋白酪
氨酸激酶。
"受体"是指细胞内或细胞表面上的通常以选择性结合特异性物质为特征的分子结 构。例示性受体包括肽激素、神经传递素、抗原、补体片段和免疫球蛋白的细胞表面受 体以及类固醇激素的胞桨受体。
术语"调节"是指抑制、增强或诱导功能。举例来说，基因表达的"调节"或"调 控"是指基因活性的改变。表达的调节可包括(但不限于)基因活化和基因阻遏。"调 节"或"调控"也指增加或降低蛋白质、酶、抑制剂、信号转导剂、受体、转录活化剂、 辅因子和其类似物的生物活性的方法、条件或药剂。活性的这一变化可为mRNA翻译、 DNA转录和/或mRNA或蛋白质降解的增加或减少，这可能又对应于生物活性的增加或 降低。这种增强或抑制可能随特定事件(诸如信号转导通路的活化)的发生而定和/或 可能仅在特定细胞类型中显现。
"经调节活性"是指由蛋白质的生物学活性形式调节的任何活性、条件、疾病或表 型。调节可能通过影响生物学活性蛋白质的浓度而实现，例如通过调控表达或降解而实 现，或通过(例如)抑制、活化、结合或释放受质、化学上或结构上修饰所达成的直接 激动或拮抗效应而实现，或通过可能涉及其它因子的直接或间接相互作用而实现。
"调节剂"是指改变比活性的表达(诸如骨形成或Ror分子表达)的任何药剂。举 例来说，调节骨形成的药剂改变(增加或减少)骨形成。调节剂打算包含任何化合物， 例如，抗体、小分子、肽、寡肽、多肽或蛋白质。
"浆细胞"是指专门用于抗体(免疫球蛋白)产生的成熟B淋巴细胞。浆细胞很少 可见于外周血中。其包含0.2%到2.8%的骨髓白细胞数。成熟浆细胞通常为椭圆形或扇 形，经测量为8-15pm。核的形状为偏心圆形和椭圆形。
术语"小分子"是指合成或天然存在的化合物(例如肽或寡核苷酸)，其可视情况 为衍生的、天然产物或天然或合成来源的任何其它低分子量(通常小于约5千道尔顿) 的有机、生物无机或无机化合物。所述小分子可为治疗上可传递的物质或可进一步被衍 生以有利于传递。
如本文中所使用，术语"诱导剂"是指诱导、增强、促进或增加比活性(诸如骨形 成或Ror分子表达)的任何药剂。
如本文中所使用，术语"抑制剂"或"阻遏剂"是指抑制、阻遏或降低比活性(诸 如骨形成或Ror分子表达)的任何药剂。
如本文中所使用，术语"药剂"或"测试药剂"是指待测试的任何化合物或分子。 本发明药剂的实例包括(但不限于)肽、小分子和抗体。药剂可随机选择或合理地选择
或设计。如本文中所使用，当随机选择药剂而不考虑药剂与靶化合物或位点之间的特异 性相互作用时，认为药剂是"随机选择的"。如本文中所使用，当在考虑药剂与靶化合 物或位点之间的特异性相互作用和/或与药剂作用相关的构形的非随机基础上选择药剂 时，认为药剂是"合理地选择或设计"。
如本文中所使用，术语"抗体"是指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分(例如，抗 原结合部分)。抗体为天然产生的或完全或部分合成产生的。免疫球蛋白分子的免疫活 性部分的实例包括可通过用诸如胃蛋白酶的酶裂解抗体所产生的F(ab)、 Fv和F(ab')片 段。维持特异性结合能力的所有其衍生物也包括在这一术语内。这一术语也涵盖具有与 免疫球蛋白结合域同源或基本上同源的结合域的任何蛋白质。这些蛋白质可源自天然来 源或部分或完全合成产生。抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可为任何免疫球蛋 白类别(包括人类类别IgG、 IgM、 IgA、 IgD和IgE中的任一种)的成员。然而，在本 发明中通常优选IgG类别的衍生物。
术语"抗体片段"是指抗体的小于全长的任何衍生物。抗体片段优选保留至少具有 全长抗体的特异性结合能力的有效部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、 Fab'、 F(ab')2、 scFv、 Fv、 dsFv双功能抗体和Fd片段。抗体片段可以任何方式产生。举例来 说，抗体片段可通过使全抗体断裂而酶促或化学产生，或其可由编码部分抗体序列的基 因重组产生。或者，抗体片段可完全或部分合成产生。抗体片段可视情况为单链抗体片 段。或者，片段可包含多个(例如)通过二硫键或其它更稳定键联连接在一起的链。片 段也可视情况为多分子复合物。功能性抗体片段通常将包含至少约50个氨基酸，且更 通常将包含至少约200个氨基酸。在某些实施例中，抗体片段具有至少两个抗原结合位 点。在某些优选实施例中，抗体片段确切地具有2、 3、 4或5个抗原结合位点。具有两 个抗原结合位点的片段尤其适用于本发明。这些药剂使Ror2 二聚合而不形成多聚复合 物。
单链Fv (scFv)为仅由彼此通过多肽连接子共价连接的可变轻链(V。和可变重 链(Vh)组成的重组抗体片段。Vl或VH可为NH2-末端域。多肽连接子可具有可变长 度和组成，只要两个可变域在无严重位阻影响的情况下桥联即可。连接子通常主要包含 用出于溶解性而散布的一些谷氨酸或赖氨酸使甘氨酸和丝氨酸残基伸展。
双功能抗体为二聚scFv。双功能抗体的组分通常具有比大多数scFv短的肽连接子， 且其展示优选缔合为二聚体。
Fv片段为由通过非共价相互作用结合在一起的一个Vh和一个Vl域組成的抗体片 段。术语dsFv在本文中用于指用工程化分子间双硫键稳定Vh-Vl対的Fv。
F(ab')2片段为基本上与由免疫球蛋白(通常IgG)通过在pH 4.0-4.5下用酶胃蛋白 酶分解所获得的抗体片段等价的抗体片段。所述片段可重组产生。
Fab片段为基本上与通过还原将两个重链碎片结合为F(ab')2片段的双硫桥键所获得 的抗体片段等价的抗体片段。Fab'片段可重组产生。
Fab片段为基本上与通过用酶木瓜蛋白酶分解免疫球蛋白(通常IgG)所获得的抗 体片段等价的抗体片段。Fab片段可重组产生。Fab片段的重链片段为Fd碎片。
如本文中所使用，术语"报告基因"是指表型表达易于监测的任何基因。报告基因 的用途尤其适用于筛选以确定哪些测试药剂活化信号转导通路。报告基因可操作性连接 于受信号转导通路控制的启动子或其它调控元件。在某些实施例中，制备报告基因功能 上连接于特定关注的启动子区或其它调控区的重组DNA构筑体，且使这一构筑体转染 于细胞或生物体中。通常使用的报告基因的实例包括荧光素酶(luciferase， LUC)、绿 色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、 (3-半乳糖苷酶(卩-galactosidase， GAL)、 P陽葡萄糖醛酸酶(^-glucuronidase ， GUS)和氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase ， CAT )。
如本文中所使用，术语"治疗"是指治疗性治疗和预防性治疗或预防性操作或刺激 骨细胞分化或骨形成、延迟骨病症症状发展和/或降低骨病症和/或所述将要或预期由骨 病症发展的症状的严重程度的操作。这些术语进一步包括改善现有骨病症症状、预防其 它症状、改善或预防症状的潜在代谢病因、预防或逆转症状的代谢病因或预防或促进骨 生长。因此，这些术语表示已赋予患有骨病症或具有发展所述病症的潜能的个体有利结 果。此外，术语"治疗"是定义为向可能具有疾病、疾病症状或引发疾病的诱因的个体 或个体的经分离组织或细胞系施用或投与药剂(例如，治疗剂或治疗组合物)，其中目 的在于医治、治愈、缓和、减轻、改变、补救、改善、改良或影响所述疾病、疾病症状 或引发疾病的诱因。如本文中所使用，"治疗剂"是指参与治疗疾病(例如调节骨形成 活性或诱导新骨形成)的任何物质或物质的组合。因此，治疗剂包括(但不限于)小分 子、肽、抗体、核糖酶和反义寡核苷酸。
治疗剂或治疗组合物也可包括预防和/或减少特定疾病的症状的呈医药学上可接受 的形式的化合物。举例来说，治疗组合物可为预防和/或减少骨相关病症的症状的医药 组合物。预期本发明的治疗组合物将以任何合适形式提供。治疗组合物的形式将视多种 因素(包括投药模式)而定。除其它成分外，治疗组合物还可含有稀释剂、佐剂和赋形 剂。
骨强度可根据骨密度(每立方厘米体积的矿物质的克数)和骨质量(矿物化、骨结
构、骨转换、微骨折)确定。作为骨强度的量度，通常使用骨矿物密度(Bone Mineral Density, BMD)。举例来说，如果BMD超过年轻白种成年女性的BMD的平均值以下 2.5个标准偏差，那么可断言骨为骨质疏松(世界卫生组织(World Health Organization)， 1994,骨折风险评定和其筛选绝经后骨质疏松症的应用(Assessment ofFracture Risk and it's Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis), 技术报告文集第843期 (Technical Report Series 843 )，日内瓦世界卫生组织(Geneva: World health Organization))。
"骨组织"是指钙化组织(例如，颅盖骨、胫骨、股骨、椎骨、牙齿)、骨小梁、骨 髓腔(除骨小梁以外的腔)、皮质骨(覆盖骨小梁和骨髓腔的外层周边)和其类似物。 骨组织也指通常位于矿物化胶原基质内的骨细胞；向骨细胞提供营养的血管；骨髓涂片 (bone marrow aspirate);关节液；源自骨组织的骨细胞，且可包括脂肪骨髓。骨组织包 括骨制品，诸如整骨、整骨的切片、骨碎片、骨粉、骨组织活检、胶原制剂或其混合物。 出于本发明的目的，除非另有说明，否则术语"骨组织"用于涵盖人类或动物的所有上 述骨组织和制品。
如本文中所使用，"骨相关活性"包括骨形成活性和骨吸收活性。可通过增加成骨 细胞活性、来自骨祖细胞的成骨细胞分化和成骨细胞增生，通过减少成骨细胞凋亡和通 过任何其组合来诱导骨形成活性。另外，可通过降低破骨细胞活性、破骨细胞分化和增 生，通过增加破骨细胞凋亡和通过任何其组合来抑制骨吸收活性。骨形成活性可在多种 骨组织或细胞中诱导。
如本文中所使用，短语"调节骨形成"是指增加或减少骨形成。"增加骨形成"意 指将成骨细胞或成骨细胞前体募集到骨位点，这达成细胞分化为成熟成骨细胞且成熟成 骨细胞分泌使完整骨物质矿物化且增加位点处的骨量的胶原基质。这一术语也涵盖成熟 成骨细胞产生和分泌的胶原基质增加。骨形成的增加可通过一或多个以下情形确定骨 折速率减小、区域骨密度增加、体积矿物质骨密度增加、小梁结缔性增加、小梁密度增 加、皮质密度或厚度增加、骨直径增加和无机骨含量增加。骨形成的增加可由骨细胞(例 如，成骨细胞)的连接、增生、存活和/或分化的增加和随后的骨矿物化产生。
"骨相关病症"包括骨形成和骨吸收病症。这些疾病和病状包括(但不限于)佝偻 病、骨软化、骨质减少、骨硬化、肾性骨营养不良、骨质疏松(包括老年和绝经后骨质 疏松症)、帕哲病、骨转移、高钙血症、甲状旁腺功能亢进、骨骼石化症、牙周炎和可 能伴随类风湿性关节炎和骨关节炎的骨代谢的异常变化。这些疾病中的一些的特征在于 不充足的骨形成或骨流失，而其它涉及骨组织的异常增厚或硬化。将受益于抑制骨异常
增厚的疾病的实例包括(但不限于)骨骼石化症和骨硬化。
"骨相关药剂"是指影响骨形成或骨吸收的药剂。"骨相关药剂"可能诱导合成代谢 或分解代谢效应，可能抑制骨吸收且使得骨矿物密度增加，可能增加骨形成或可能维持 骨形成与骨吸收之间的平衡。
术语"化合物"或"药剂"在本文中互换使用以指当向个体(人类或动物)投与时 通过局部和/或全身性作用诱导合乎需要的药理学和/或生理学效应的物质的化合物或组 合物。
术语"个体"是指任何哺乳动物，包括人类或非人类个体。非人类个体可包括实验、 测试、农业、娱乐或伴侣动物。个体可为人类。个体可为驯养动物，诸如狗、猫、奶牛、 山羊、绵羊、猪等。个体可为实验动物，诸如小鼠、大鼠、兔子、猴等。
术语"生物样品"广泛定义以包括任何细胞、组织、生物流体、器官、多细胞生物 体和其类似物。生物样品可源自(例如)活体外细胞或组织培养物。或者，生物样品可 源自活有机体或单细胞生物体群体。生物样品可为活组织，诸如活骨。术语"生物样品"
也打算包括诸如从个体分离的细胞、组织或生物流体的样品以及存在于个体中的样品。 即，本发明的检测方法可用于检测活体外以及活体内生物样品中的Ror mRNA、蛋白质、 基因组DNA或活性。举例来说，检测Ror mRNA的活体外技术包括TaqMan分析、北 方杂交(northern hybridization)和原位杂交(in situ hybridization)。检测Ror蛋白的活 体外技术包括酶联免疫吸附检定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)、西方 印迹法(western blot)、免疫沉淀法和免疫荧光法。检测Ror基因组DNA的活体外技 术包括南方杂交(southern hybridization)。
由以下详细描述和构成本申请案的一部分的附图可更充分地理解本发明。 图1展示下调Ror2表达抑制dex诱导的人类间充质干细胞(hMSC)的成骨分化。 用含有Ror2特异性shRNA或EGFP特异性shRNA (对照)的腺病毒表达载体感染人 类MSC且将其在补充有0.05 mM抗坏血酸、10 mM |3-甘油磷酸酯(p-GP)和100 nM 地塞米松(dex)的MSC生长培养基(MSCGM)中培育。培育9天后，使总细胞蛋白 质提取物(50微克/泳道)经受以内源性Ror2蛋白或(3-肌动蛋白作为负载对照的西方 免疫印迹法(A)。培育11天后，执行茜素红-S染色(B)且定量(C)以评定矿物化 基质形成的程度。在C中，将在EGFPshRNA存在下并入的茜素红-S的量设定为100%。 B和C中的结果表示三个独立的实验(图l在实例1中提及)。
图2展示Ror2过表达抑制hMSC的成脂分化。A:用P-半乳糖苷酶((3-gal)、 Ror2 或Ror2KD感染人类MSC且将其在补充有成脂混合物的MSCGM中培育8天。分离总 细胞RNA且使其经受使用获自美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)的引物和 探测的成脂转录因子C/EBPa和PPARy的实时RT-PCR分析。将mRNA的含量标准化 为各样品中亲环素B (cyclophilin B)的表达且将卩-gal感染细胞的相对mRNA表达设 定为100%。 B:用p-gal、 Ror2或Ror2KD感染人类MSC，将其在补充有成脂混合物的 MSCGM中培育21天，且然后使其经受油红O染色(图2在实例2中提及)。
图3展示Ror2蛋白的过表达增加新生小鼠颅盖骨的总骨面积，而不是成骨细胞数 目。使4天大的同窝出生小鼠的颅盖骨保留不感染(对照)或用编码P半乳糖苷酶(p) 或人类Ror2 (R2)的腺病毒感染。在腺病毒存在下培育7天后，用苏木精和曙红对颅 盖骨染色，然后评定总骨面积和成骨细胞数目。将未感染培养物中所获得的值设定为 100%。结果是每种病状4-5个颅盖骨的平均值V SE (*与P-半乳糖苷酶感染相比， -PO.Ol)。这一图表表示三个独立的实验(图3在实例3中提及)。
图4说明Ror2蛋白结合14-3-3P且将其在酪氨酸处磷酸化。用P-gal(|3)、 Ror2(R2) 或Ror2KD (KD)腺病毒感染U20S细胞且在24-48小时后，制备总细胞溶解产物且与 抗flag (A)、抗14-3-3(3 (B)或抗磷酸化酪氨酸(C)抗体一起免疫沉淀。通过用指示 抗体执行免疫印迹来分析免疫沉淀(图4在实例4中提及)。
图5展示内源性Ror2蛋白活体内介导14-3-3|3磷酸化。用Ror2 siRNA或非特异性 siRNA瞬时转染U20S细胞，且48小时后，使用每泳道50微克提取物使总细胞蛋白质 提取物经受内源性Ror2蛋白或p-肌动蛋白(负载对照)的西方免疫印迹(A)。另外， 由14-3-3卩抗体直接分析相同溶解产物(20微克/泳道)，或在与抗磷酸化酪氨酸抗体一 起免疫沉淀后分析相同溶解产物(B)(图5在实例4中提及)。
图6展示Ror2蛋白的胞液域在活体外结合14-3-3P且使其直接磷酸化。A:使经 GST标记的Ror2胞液域(GST-R2c)或单独的GST附着于谷胱甘肽琼脂糖珠粒且在4 。C下与活体外翻译的14-3-3(3—起培育4小时。用抗14-3-3p抗体分析结合物质。B:如 "一般方法"中所述，用Ror2蛋白的经纯化重组胞液域(GST-R2c，英杰(Invitrogen)) 和经纯化重组GST-14-3-3卩(生物分子公司(Biomol,Inc.))执行的活体外激酶检定(图 6在实例4中提及)。
图7说明Ror2特异性抗体引起Ror2受体的二聚合和活化。A:为说明二聚合，用 在COOH末端经Flag (R2-F)或His (R2-H)表位标签标记的Ror2表达质粒转染U20S 细胞。24小时后，在37。C下用Ror2特异性山羊多克隆IgG或非特异性山羊IgG处理
细胞1小时，且制备总细胞蛋白质提取物且使其免疫沉淀于抗Flag亲和琼脂糖上。通 过用抗His抗体执行免疫印迹来分析沉淀物(上图)。下图展示用抗Flag抗体再探测同 一个膜以用于沉淀水平对照。B:为说明活化，用如A中的Ror2特异性抗体或对照IgG 处理未转染的U20S细胞，且使总细胞提取物沉淀于抗磷酸化酪氨酸抗体上且用Ror2 或14-3-3(3抗体分析(图7在实例5中提及)。
图8展示Ror2抗体引起hMSC中的矿物化基质形成。在补充有非特异性山羊IgG、 Rorl特异性山羊IgG(各为50吗/ml)或递增浓度的Ror2特异性山羊IgG的含有0.05 mM 抗坏血酸、10 mM p-GP和100 nM dex的MSCGM中培育人类MSC。在培育9天后， 通过茜素红-S染色评定基质矿物化程度(图8在实例6中提及)。
图9说明Ror2抗体诱导的hMSC矿物化是通过Ror2介导。A:用含有对Ror2或 EGFP (对照)具有特异性的shRNA的腺病毒表达载体感染hMSC且将其在补充有0.05 mM抗坏血酸、10mM卩-GP和100nMdex的MSCGM中培育。培育9天后，通过茜素 红-S染色评定基质矿物化的程度。B:用Ror2腺病毒感染人类MSC 24小时，且然后 将其在含有0.05 mM抗坏血酸、10 mM P-GP和Ror2特异性山羊IgG或非特异性山羊 IgG的MSCGM中培育19天，之后用茜素红-S染色(图9在实例6中提及)。
图10说明下调14-3-3P增强hMSC中的矿物化基质形成。用含有零乱shRNA (scramble shRNA)、 14-3-3卩特异性shRNA、 (3-半乳糖苷酶(卩-ga)过表达盒或Ror2过 表达盒的腺病毒表达载体感染人类MSC且将其在补充有0.05 mM抗坏血酸、10mM p-GP和100nM dex的MSCGM中培育。培育9天后，使50微克总细胞蛋白质提取物 经受内源性14-3-3p蛋白的西方免疫印迹法(A)。培育12天后，执行茜素红-S染色(B) 以评定矿物化基质形成的程度(图10在实例7中提及)。
图11说明Ror2抗体治疗和14-3-3|3下调离体促进新骨形成。用含有零乱shRNA (scr)或对14-3-3J3具有特异性的shRNA的腺病毒感染小鼠颅盖骨；且48小时后，在 钙黄绿素存在下用12叫/ml抗Ror2抗体或非特异性IgG处理。与腺病毒和抗体一起培 育7天后，用苏木精-曙红对颅盖骨染色且测定总骨面积(空心条)和成骨细胞数目(实 心条)。将零乱shRNA感染的和IgG处理的培养物中所获得的值设定为100%。结果为 每种病状4个颅盖骨的平均值VSE (*-p<0.05)(图11在实例8中提及)。
图12说明用于Ror2活性的高通量、高灵敏度检定的产生。A:利用TrkB受体的 信号转导通路的检定的示意图。通过配位体诱导的引起Erk磷酸化和刺激靶基因启动子 中的cAMP反应元件(CRE)的均二聚合活化TrkB受体。我们产生由与TrkB的跨膜 域和细胞内域(aa 432-822)融合的Ror2细胞外域(aa 1-407)组成的嵌合受体。当使
用这一嵌合体时，引起Ror2 二聚合的药剂活化TrkB信号转导通路且这一活化可由CRE 启动子-荧光素酶报告体检定评定。B:用Ror2-TrkB嵌合体和CRE-荧光素酶质粒稳定 转染HEK293细胞，用指示量的抗Ror2抗体或非特异性IgG处理24小时，且评定荧光 素酶活性。将用非特异性IgG处理后所观察到的荧光素酶活性设定为1。结果表示三个 独立的实验(平均值VSE; n = 4; *-p<0.05)(图12在实例9中提及)。
具体实施例方式
本发明是基于关于Ror家族和其下游信号转导生物分子在骨代谢、尤其成骨细胞分 化中的作用的发现。参见美国专利申请案U.S.S.N. 10/823，998、60/463,364和60/501,340， 其各自以引用的方式并入本文中。申请者已发现下调Ror2表达抑制地塞米松诱导的人 类间充质干细胞的成骨分化(图1)。相反，Ror2的过表达抑制人类间充质干细胞的成 脂分化(图2)。申请者也己展示下调14-3-3P表达增强人类间充质干细胞中的矿物化基 质形成(图10)。此外，Ror2过表达和14-3-3P抑制诱导比任一者大的基质矿物化(图 10)。基于这些发现，在蛋白质水平下调节Ror2活性或调节14-3-3p活性的药剂或其医 药组合物适用于治疗骨疾病和/或代谢病症，诸如肥胖症或糖尿病。实际上，增加Ror2 蛋白活性的药剂将促进成骨细胞分化且从而增加矿物化骨形成(图8和9)。又，抑制 14-3-3(3活性的药剂将促进成骨细胞分化且从而增加矿物化骨形成(图10)。
一方面，本发明提供调节(增加或降低)Ror2蛋白活性的药剂。在某些实施例中， 药剂增加Ror2蛋白活性。在其它实施例中，药剂降低Ror2蛋白活性。这些药剂通常在 蛋白质水平下作用，增加或降低Ror2蛋白的活性水平。如本文中所讨论，增加Ror2 活性的药剂适用于促进矿物化骨形成和成骨分化。这些药剂也可能通过抑制成脂分化而 适用于治疗肥胖症(图2)。在不希望受任何特定理论限制的情况下，Ror2活性增加似 乎促进成骨分化，同时抑制成脂分化。
这些调节Ror2活性的药剂可为任何类型的化合物，包括小分子、聚核苷酸、蛋白 质、肽等。在某些实施例中，药剂为蛋白质。在其它实施例中，药剂为肽。在其它实施 例中，药剂为聚核苷酸。在其它实施例中，药剂为小分子(例如，分子量小于1500 g/mo1)。 优选，药剂对Ror2蛋白具有特异性且不结合其它生物分子。在某些实施例中，药剂尤 其不结合其它Ror家族成员。在其它实施例中，可能存在与其它生物分子或Ror家族成 员的交叉反应性；然而，药剂对这些其它分子的亲和力小于对Ror2蛋白的亲和力。
在某些特定实施例中，药剂通过引起两个Ror2蛋白的二聚合而起作用。认为Ror2 蛋白的二聚合导致Ror2受体的活化。活化Ror2激酶活性导致其包括14-3-3|3蛋白的结
合搭配物的磷酸化。其它Ror2结合搭配物包括(但不限于)ADP/ATP载体蛋白、UDP-葡萄糖神经酰胺葡糖基转移酶样1、 14-3-3蛋白y、核糖体结合蛋白I (ribophorin 1)、 精氨酸N-甲基转移酶1、细胞凋亡敏感性蛋白、NOTCH2蛋白和人类骨骼肌LIM-蛋白 3(比里德(Billiard)等人，2004年4月14日申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998)。
药剂通常包括至少两个针对Ror2蛋白的结合域。在某些实施例中，药剂确切地具有两 个针对Ror2蛋白的结合域，即药剂为二价药剂。为多价药剂的其它药剂也适用于本发 明。在某些实施例中，药剂为促进Ror2蛋白二聚合的小分子或聚核苷酸。在其它实施 例中，药剂为蛋白质或肽。
在某些实施例中，药剂为针对Ror2蛋白的抗体或抗体片段(例如，双功能抗体)。 所述抗体或抗体片段可针对Ror2蛋白的任何区；然而，抗原结合位点优选不针对可能 干扰Ror2的生物活性(例如，激酶活性)或干扰两个蛋白的二聚合的区。通过抗体或 抗体片段执行的两个Ror2蛋白的结合促进Ror2蛋白二聚合且从而促进其活化。抗体可 为多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可为任何同种型；然而，通常优选为IgG同种型。抗 体可源自任何物种；然而，为用于人类，抗体通常具有人类来源或已被人化。如果抗体 将用于其它物种中，那么可使抗体适合于这种物种。在某些实施例中，抗体为人化单克 隆抗体。在其它实施例中，抗体为完全人类抗体。在某些特定实施例中，抗体为完全人 类单克隆抗体。
在某些实施例中，通过用经纯化人类Ror2蛋白或源自Ror2蛋白的肽使诸如兔子或 其它啮齿动物的哺乳动物免疫来制备针对Ror2蛋白和抗体。免疫后，收集产生抗体的 细胞(诸如B细胞或浆细胞)且将其用于制备融合瘤，然后筛选融合瘤以产生针对Ror2 蛋白的抗体。在某些实施例中，就抗体使Ror2蛋白二聚合和/或活化Ror2蛋白的能力 筛选抗体。 一旦鉴别产生合乎需要的抗体的B细胞，就可使B细胞永生。然后，可使 用所得融合瘤产生合乎需要的单克隆抗体。可进一步表征且修饰由融合瘤产生的抗体。 举例来说，在某些实施例中，可使抗体人化以致向人类个体投与抗体并不产生不良反应， 不良反应可从治疗抗体的清除率增加变化到致命过敏症。在某些特定实施例中，使用识 别Ror2蛋白的抗体区(即，互补决定区)来替换具有不同特异性的人类抗体的CDR。 用于工程化和制备抗体的技术在所属领域中为已知的且描述于1989年3月28日颁布的 美国专利第4,816,567号；1992年1月7日颁布的美国专利第5,078,998号；1992年2 月25日颁布的美国专利第5,091,513号；1993年7月6日颁布的美国专利第5,225,539 号；1996年12月17日颁布的美国专利第5,585,089号；1997年12月2日颁布的美国 专利第5,693,761号；1997年12月2日颁布的美国专利第5,693,762号；1991年颁布的
美国专利第5,869,619号；2001年1月30日颁布的美国专利第6,180,370号；2003年4 月15日颁布的美国专利第6，548,640号；2005年4月19日颁布的美国专利第6,881,557 号；2006年1月3日颁布的美国专利第6,982,321号中，其以引用的方式并入本文中。 在其它实施例中，设计和/或修饰抗体以实现对Ror2蛋白具有较高特异性和/或亲和力的 抗体。
在其它实施例中，药剂包含针对Ror2蛋白的抗体片段。可使用一或多个针对Ror2 蛋白的抗体片段。片段通常包括负责抗体对Ror2蛋白的亲和力的互补决定区(CDR)。 为使Ror2蛋白二聚合，需要至少两个用于Ror2蛋白的结合位点；因此，药剂可为两个 彼此连接的抗体片段。这些片段可共价或非共价连接在一起。举例来说，药剂可为两个 共价连接在一起的Fab片段。药剂也可为双功能抗体。在某些实施例中，药剂可包括两 个以上抗体片段。举例来说，药剂可包括3、 4、 5或6个针对Ror2蛋白的抗原结合位 点。
在某些其它实施例中，药剂可为模拟针对Ror蛋白(诸如Ror2蛋白)的抗体的抗 原结合位点的蛋白质、肽或小分子。这些药剂可基于针对Ror2蛋白的抗体的抗原结合 位点的结构而经模拟设计或鉴别。然后，可在多种活体外检定中测试药剂以评定药剂使 Ror2蛋白二聚合和/或活化Ror2蛋白的能力。也可使用高通量筛选法使用小分子、肽或 聚核苷酸文库鉴别药剂。
另一方面，本发明提供使用本发明药剂调节Ror活性的方法。调节Ror蛋白(尤其 Ror2蛋白)活性的药剂适用于调节骨相关活性。这些药剂也可适用于在肥胖症、糖尿 病或其它代谢病症的治疗中调节脂肪细胞分化。许多疾病及病状的特征是需要调节骨相 关活性(例如，增强骨形成)。最明显的是骨折的状况，其中希望剌激骨生长且加速和 完成骨修复。举例来说，增强骨形成的药剂可能潜在适用于面部重建程序或整形外科程 序。其它骨缺乏病状包括(但不限于)节段性骨缺损、牙周病、转移性骨疾病、溶骨性 骨疾病和其中结缔组织修复将为有利的病状(诸如软骨缺陷或损伤的治愈或再生)。包 括年龄相关骨质疏松和与绝经后激素状态相关联的骨质疏松等骨质疏松病状也具有重 要意义。以需要骨生长为特征的其它病状包括原发性和继发性甲状旁腺功能亢进、糖尿 病相关骨质疏松、废用性骨质疏松和糖皮质激素相关骨质疏松。
增加Ror2活性的药剂可用于促进矿物化骨形成。这些药剂也可用于促进成骨细胞 分化。成骨细胞分化的促进可能以成脂分化为代价来进行。这些药剂也可用于促进矿物 化基质形成。
另一方面，本发明提供调节(增加或降低)14-3-3 (例如，14-3-3(3、 14-3-3y等)
活性的药剂。在某些实施例中，药剂抑制14-3-3的活性。在其它实施例中，药剂增加 14-3-3的活性。药剂可在核酸或蛋白质水平下起作用。在某些实施例中，药剂降低 14-3-3(3的表达。如本文中所讨论，抑制14-3-3(5活性的药剂适用于促进矿物化骨形成 和成骨分化。在某些实施例中，药剂降低14-3-3丫的表达。这些药剂也可能适用于通过 抑制成脂分化来治疗肥胖症、糖尿病或其它代谢病症。在不希望受任何特定理论限制的 情况下，下调14-3-3 (尤其14-3-3卩)表达似乎促进成骨分化，同时抑制成脂分化。
这些调节14-3-3活性的药剂可为任何类型的化合物，包括小分子、聚核苷酸、蛋 白质、肽等。在某些实施例中，药剂为蛋白质。在其它实施例中，药剂为肽。在其它实 施例中，药剂为聚核苷酸。在其它实施例中，药剂为小分子。在某些实施例中，药剂为 聚核苷酸。在某些实施例中，药剂为DNA。在其它实施例中，药剂为RNA。在某些实 施例中，药剂为14-3-3特异性RNAi。在某些特定实施例中，药剂为14-3-3p特异性RNAi。 在某些特定实施例中，药剂为14-3-3特异性siRNA。在某些实施例中，药剂为14-3-3卩 特异性siRNA。在某些特定实施例中，药剂为14-3-3特异性shRNA。在某些实施例中， 药剂为14-3-3p特异性shRNA。在其它实施例中，药剂对14-3-3y具有特昇性。在某些 实施例中，药剂尤其特异性耙向间充质干细胞或骨细胞(诸如成骨细胞)中可见的 14-3-3。举例来说，在某些实施例中，药剂包括靶向部分。在某些实施例中，靶向药剂 为双膦酸盐或其它骨器官靶向药剂。
另一方面，本发明提供使用本发明药剂调节14-3-3活性的方法。调节14-3-3 (尤 其14-3-3卩)活性的药剂适用于调节骨相关活性。这些药剂也可能适用于在肥胖症、糖 尿病或其它代谢病症的治疗中调节脂肪细胞分化。存在许多以需要调节骨相关活性(例 如，增强骨形成)为特征的疾病及病状。最明显的是骨折的状况，其中将希望刺激骨生 长且加速和完成骨修复。举例来说，增强骨形成的药剂可能潜在适用于面部重建程序或 整形外科程序。其它骨缺乏病状包括(但不限于)节段性骨缺损、牙周病、转移性骨疾 病、溶骨性骨疾病和其中结缔组织修复将为有利(诸如软骨缺陷或损伤的治愈或再生) 的病状。包括年龄相关骨质疏松和与绝经后激素状态相关联的骨质疏松的骨质疏松病状 也具有重要意义。以需要骨生长为特征的其它病状包括原发性和继发性甲状旁腺功能亢 进、糖尿病相关骨质疏松、废用性骨质疏松和糖皮质激素相关骨质疏松。
降低14-3-3活性的药剂可用于促进矿物化骨形成。这些药剂也可用于促进成骨细 胞分化。成骨细胞分化的促进可能以成脂分化为代价来进行。这些药剂也可用于促进矿 物化基质形成。
用于本发明方法中的药剂可并入适于向个体投与的医药组合物中。如本文中所使
用，药剂可为调节Ror分子(例如，Ror2蛋白)活性或14-3-3 (例如，14-3-3p、 14-3-3y)
活性的任何经鉴别的化合物(例如，口服活性的小有机分子、蛋白质、免疫球蛋白、免 疫球蛋白片段、肽)。这些组合物通常包含化合物和医药学上可接受的载剂。本发明的 组合物可含有一或多种与一或多种已知调节骨相关活性的药剂组合的药剂。举例来说， 促进Ror活性或抑制14-3-3活性的药剂可与类似雌激素、双膦酸盐或组织选择性雌激 素(即，选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulator, SERM))的 抑制骨吸收的药剂组合。本发明药剂也可与促进骨形成的其它药剂组合。
一或多种药剂是以治疗有效剂量使用。治疗有效剂量是指足以展示益处(例如，减 少与所治疗的病症、疾病或病状相关联的病征和/或症状)的药剂的量。当应用于单独 投与的个别成分时，术语仅指这一成分。当应用于组合时，术语是指组合、相继或同时 投与的达成益处的成分的组合量。举例来说，治疗性使用的有效量是包含提供骨折修复 治愈率的临床显著增加、逆转骨流失和预防骨质疏松个体骨折、逆转软骨缺陷或病症、 预防或延迟骨质疏松发作、预防与骨质疏松相关联的进一步骨流失、剌激和/或抑制骨 折骨不连和牵张成骨中的骨形成、增加和/或降低假肢器官中的骨生长、修复牙缺陷和 其类似情形的药剂的组合物的量。这些有效量将使用常规优化技术来确定且视待治疗的 特定病状、患者的状况、投药途径、配方和从业者的判断和所属领域的技术人员明了的 其它因素而定。本发明化合物所需的剂量(例如，在希望骨形成增加的骨质疏松中)是 确保治疗组与对照组之间的骨量存在统计上显著的差异的剂量。可见，骨量的这一差异 为(例如)治疗组中的骨量增加5-20%或以上。治愈的临床上显著的增加的其它量度可 包括(例如)关于抗断强度和张力、抗断强度和扭矩、四点弯曲、骨活检中结缔性增加 的测试和所属领域的技术人员熟知的其它生物力学测试。治疗方案的一般指南可获自所 关注的疾病的动物模型中所进行的实验。
药剂的毒性和治疗功效可根据标准医药程序在细胞培养物或实验动物中确定，例 如，确定LDso(使50%的群体致死的剂量)和ED5o(治疗上对50%的群体有效的剂量)。 毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数且其可以LDso/ED5o比率表示。优选为 展现大治疗指数的药剂或化合物。获自细胞培养物检定和动物研究的数据可用于调配一 定范围的供人类使用的剂量。这些药剂或化合物的剂量可在包括具有极小毒性或没有毒 性的EDso的循环浓度范围内。剂量可在这一视所采用的剂型和所利用的投药途径而定 的范围内变化。
对于本发明方法中所使用的任何药剂来说，治疗有效剂量最初可由细胞培养物检定 估算。举例来说，可在动物模型中调配剂量以获得包括细胞培养物或动物研究中所确定
的ED5()(即，实现Ror2蛋白的最大二聚合的一半的测试化合物的浓度)的循环血浆浓 度范围。所述信息可用于更精确地确定适用于人类的剂量。血浆中的含量可(例如)通 过HPLC测量。剂量可由个体医师根据患者的状况进行选择。主治医师应知道如何且何 时终止、中断或调整投药。相反地，主治医师也应知道如果临床反应不足，那么将治疗 调整到更高水平(排除毒性)。所关注病症的控制中所投与的剂量的量值应随待治疗的 病状的严重程度而变化。病状的严重程度可(例如)部分地由标准预后性评估方法评估。 另外，剂量和或许剂量频率也应随个体患者的年龄、体重和反应而变化。可相当于以上 所讨论内容的计划可用于兽医学中。
用于特殊情形的适当剂量的确定在所属领域的技术范围内。治疗通常由比化合物的 最佳剂量小的剂量起始。此后，剂量可以小增量递增直到在所述情况下达到最佳效果。 举例来说，必要时可将总每日剂量分成数份且在一天中分数份投与。可将每日剂量分成 二、三或四份，每一份都在24小时的时间里投与。
在抗体或抗体片段作为所投与的药剂的状况下，通常经由静脉内输注投与这一药 剂。剂量可在每1-6周l-25mg/kg的范围内。在某些实施例中，剂量可在每1-6周1-10 mg/kg的范围内。在某些实施例中，每3-5周通过静脉内输注传递1-10 mg/kg药剂。在 其它实施例中，每4周通过静脉内输注传递3-6mg/kg药剂。
视所治疗的特定病状而定，可全身性或局部调配并投与药剂。调配本发明的医药组 合物以使其与预定的投药途径相容。调配和投药的技术可见于雷明顿医药科学 (Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版，马克出版公司(Mack Publishing Co.), 伊斯顿，宾夕法尼亚(Easton, Pa.) (19卯)中。仅举几个例子，合适途径可包括经口、 直肠、阴道、经皮、粘膜或肠内投药；肠道外传递，包括肌肉内、皮下和髓内注射；以 及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。可使用的一些传递方法包括 (但不限于)封装于脂质体中、并入假肢器官中、由逆转录病毒载体转导和用随后的再 植入或投与经转染细胞离体转染细胞。
当医药学上使用组合物时，其与供诊断和治疗使用的"医药学上可接受的载剂"组 合。这些组合物的调配为所属领域的技术人员所熟知。本发明的医药组合物可包含一或 多种其它药剂且优选包括医药学上可接受的载剂。
合适的医药学上可接受的载剂和/或稀释剂包括任何及所有常规溶剂、分散介质、 填充剂、固体载剂、水溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂和其类似 物。术语"医药学上可接受的载剂"是指在所投与的患者中不引起过敏反应或其它不良 作用的载剂。合适的医药学上可接受的载剂包括(例如)水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、
右旋糖、甘油、乙醇和其类似物中的一或多种以及其组合。医药学上可接受的载剂可进 一步包含少量助剂物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增强组合物的一或 多种药剂的保存期或效力。用于医药学上可接受的物质的这些介质和药剂的使用在所属 领域中为熟知的。
用于肠道外、真皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可包括以下组分无菌稀释剂，诸 如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂， 诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸 如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的试剂，诸如 氯化钠或右旋糖。pH值可用诸如盐酸或氢氧化钠的酸或碱来调节。可将肠道外制剂封 装于由玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器或多剂量小瓶中。适于注射的医药组合物 通常包括无菌水溶液(其中水可溶)或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的 无菌粉剂。对于静脉内投药，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、赛莫菲艾尔(Crem叩hor EL ) (BASF,帕瑟伯尼，新泽西州(Parsippany, N丄))、磷酸盐缓冲盐水。载剂可为 溶剂或分散介质，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙 二醇和其类似物)和其合适混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情 况下维持所需的粒度且通过使用表面活性剂，可维持适当的流动性。通过各种抗菌剂和 抗真菌剂可达成对微生物作用的预防，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏 血酸、硫柳汞和其类似物。在许多状况下，将优选在组合物中包括等张剂，例如糖或多 元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物 中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)而引起。
另外，治疗由本发明鉴别的疾病和病状的药剂也可与关于抵抗所治疗的病状的特定 效用而选择的其它治疗剂共投与。举例来说，药剂可与雌激素或雌激素相关化合物或其 它骨吸收抑制剂组合。雌激素化合物包括(但不限于)接合雌激素、雌二醇和其类似物。 其它骨相关治疗化合物包括(但不限于)双膦酸盐和相关化合物(诸如美国专利第 5,312,814号中所述的化合物)、钙补充剂(普林斯'里'利(Prince, R. L.)等人，新英格 兰医学杂志(N. Engl. J. Med.) 325, 1189, (1991))、维生素D补充齐iJ(査普'米'希(Chapuy M. C.)等人，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med.) 327， 1637， (1992))、氟化钠(里格 斯.布,利(Riggs, B.L.)等人，新英格兰医学杂志(N. Engl. J. Med.) ,327,620,(1992))、 雄激素(Nagent de Deuxchaisnes, C,骨质疏松 一个多学科问题，(Osteoporosis, a Multi-Disciplinary Problem),英国皇家医学学会国际会议和专题研讨会论文集第55期 (Royal Society of Medicine International Congress and Symposium Series No. 55),学术出
版社(Academic Press),伦敦(London),第291页，(1983))和降钙素(克里斯坦逊-希 (Christiansen, C)，骨(Bone) , 13 (增刊1):S35, (1992))。
另一方面，本发明提供一种鉴别活化Ror蛋白的药剂的系统。确定药剂是否改变 Ror2蛋白活性的方法包括执行所属领域的技术人员熟知的分析和检定。实例包括(但 不限于)组织化学分析、西方印迹分析、ELISA、酶检定(例如，激酶检定)和功能分 析(包括例如测量Ror或14-3-3(3磷酸化的程度(较高磷酸化状态反映较高活性))。在 某些实施例中，通过确定已展示结合Ror2蛋白且由Ror2蛋白磷酸化的14-3-3J3的磷酸 化状态来评定Ror (尤其Ror2蛋白)活性。14-3-3(3蛋白的磷酸化可使用所属领域已知 的任何技术来检定。具体来说，使用抗磷酸化酪氨酸抗体的免疫沉淀法可用于追査 14-3-3P蛋白的磷酸化。或者，也可使用磷的放射性同位素(例如，32P-Y-ATP)。
本发明也提供一种鉴别调节骨相关活性的药剂的方法，其中Ror分子(例如，Ror2 蛋白)的活性的增加或降低指示药剂调节骨相关活性。
在某些实施例中，本发明提供一种使用嵌合受体(例如，Ror2/TrkB)和报告基因 (诸如由Ror2的二聚合调控的荧光素酶)来鉴别促进Ror2二聚合的药剂的检定方法。 在某些实施例中，在本发明检定中使用表达包含与TrkB细胞内域融合的Ror2细胞外域 的嵌合受体的细胞。在某些特定实施例中，Ror2蛋白的细胞外域的氨基酸1-407与TrkB 的跨膜域和细胞内域(氨基酸432-822)融合。在其它实施例中，使用不同细胞内域来 构筑嵌合体。举例来说，可使用二聚合后活化的任何细胞内域来替换TrkB域。优选， 细胞内域来自单一跨膜受体，且信号转导通路为己知的。可用于制备嵌合受体的其它细 胞内域的非限制性实例包括TrkA、 TrkC、 EGFR、 PDGFR和FGFR的细胞内域。细胞 内域在细胞外域二聚合后活化且启动最终导致报告基因上调的信号转导级联。举例来 说，在Ror2/TrkB嵌合体的状况下，使嵌合受体的细胞外Ror2域二聚合的药剂引起TrkB 信号转导通路的活化。TrkB信号转导通路的活化通过使用cAMP反应元件(CRE)启 动子-报告基因系统来评定。另一信号转导通路(诸如EGFR)的活化将需要另一报告 基因系统，诸如由EGFR通路启动的基于STAT结合元件的系统。TrkB通路的活化引 起刺激CRE启动子，这又增加其控制下的任何报告基因的表达。诸如荧光素酶(LUC)、 绿色荧光蛋白(GFP)、 P-葡萄糖醛酸酶(GUS)和氯霉素乙酰转移酶(CAT)等的容易 检定的报告体可置于CRE启动子的控制下且用于本发明检定中。在某些实施例中，使 用荧光素酶作为报告基因。在其它实施例中，使用绿色荧光蛋白作为报告基因。在某些 实施例中，将质粒上的CRE启动子-报告体构筑体转染于表达嵌合受体的细胞中。在其 它实施例中，构筑体为细胞基因组的一部分。在某些实施例中，将构筑体稳定转染于细
胞中。基于Ror2/TrkB嵌合体的本发明检定系统已使用本文中展示使Ror2二聚合的Ror2 特异性抗体加以验证。Ror2特异性抗体引起所观察到的报告体(即，荧光素酶)活性 的剂量依赖性增加。参见图12。
本发明嵌合受体检定系统可使用与相应启动子系统成对的不同细胞内域来修饰。其 它细胞内域的实例包括TrkA、 TrkC、 EGFR、 PDGFR和FGFR的细胞内域。然后，在 报告体系统中使用由细胞内域调节的相应启动子。举例来说，在使用具有EGFR细胞内 域的嵌合受体的系统中可使用STAT结合元件。
本发明包括执行本发明嵌合受体检定的试剂盒。这些试剂盒包括一些或所有使用本 发明检定筛选测试药剂所必需的组分。在某些实施例中，试剂盒的组分便利地经包装以 备研究者使用。试剂盒可包括以下各者中的任一种或所有DNA构筑体、细胞系、缓 冲液、酶、多孔板、阳性和阴性对照、介质、抗生素、核苷酸、说明书等。在某些实施 例中，试剂盒包括表达Ror2/TrkB嵌合受体的细胞系。在其它实施例中，试剂盒包括编 码Ror2/TrkB嵌合受体的DNA构筑体。在其它实施例中，试剂盒包括与CRE启动子可 操作性连接的报告基因。在某些实施例中，试剂盒包括与CRE启动子可操作性连接的 荧光素酶基因。报告基因/CRE启动子构筑体可为质粒。
本发明包括上述本发明检定中所使用的具有细胞外Ror2域的嵌合受体。嵌合 Ror2/TrkB受体的例示性氨基酸序列如下。源自Ror2蛋白的氨基酸序列以大写字母展 示；源自TrkB蛋白的氨基酸序列以小写字母展示。
MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLD
GQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNIT1VQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLK
NDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRJQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITA
TGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVD
SLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSR
APKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPE
SPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPW
ALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRM
ELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyawviasvvgfcllvmlfllklarhskfgmkgpasvisn
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ymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhfVhrdlatmclvgenll
vkigdfgmsrdvystdyyrvggh加lpirwmppesimyrkfrtesdvwslgwlweiftygkqpwyqls
nneviecitqgrvlqrprtcpqevyelmlgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspvyldilg
(SEQIDNO: 4)
所属领域的技术人员应了解，在不脱离本发明的情况下，可对本发嵌合蛋白进行多 种突变、缺失、取代等。在某些实施例中，嵌合蛋白与上述氨基酸序列至少99%、 98%、 95%、 90%、 80%或70%同源。在某些实施例中，嵌合受体在由嵌合受体的细胞外Ror2 域的二聚合所引起的二聚合后活化信号转导通路，诸如TrkB通路。所属领域的技术人 员应了解，在不改变受体活性的情况下可对上述蛋白质序列进行多种改变。认为嵌合受 体的这些变异体在本发明的范畴内。本发明也包括编码嵌合受体或其变异体的聚核苷酸 序列。编码序列视情况与调节嵌合蛋白的表达和/或翻译的启动子、强化子、调控元件 等可操作性连接。本发明也包括细胞，这些细胞包括编码嵌合受体的本发明聚核苷酸序 列。
本发明的方法可以任何可用格式(包括高通量检定)修正或执行。高通量检定适用 于在给定的时间内筛选大量测试药剂。在另一实施例中，执行使用基于细胞的筛选的检 定。2000年8月15日颁布的美国专利第6,103,479号(其以引用的方式并入本文中) 揭示用于基于细胞的筛选的微型细胞阵列方法和设备。已描述制备用于其他应用的均一 微模式细胞阵列的方法，例如光化学刻蚀法(photochemical resist photolithography)(米 克思仕(Mrksich)和怀特思德(Whitesides),生物物理和生物分子结构年鉴(Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.), 25, 55-78(1996))。2000年8月1日颁布的美国专利第6,096,509 号(其以引用的方式并入本文中)提供实时测量细胞流动悬浮液对测试药剂的细胞反应
的设备和方法，其中使一系列细胞类型的各成员的均质悬浮液以特定浓度与测试化合物 组合，引导穿过检测区，且当测试混合物中的细胞流经检测区时实时测量活细胞的细胞 反应。所述专利揭示设备用于自动筛选测试药剂(例如，小分子)文库的用途。可修正 这些美国专利中所揭示的方法以使用细胞来确定测试药剂是否调节Ror分子的表达或 活性，这些细胞诸如成骨细胞(初级成骨细胞；人类成骨细胞，诸如TE-85、 U20S、 SaOS-2或HOB;大鼠成骨细胞，诸如UMR 106或ROS 17/2.8;小鼠成骨细胞，诸如 MC3T3或其他类似细胞)、非成骨细胞(COS-7和其他类似细胞)、干细胞(间充质干 细胞、胚胎干细胞)、祖细胞或含有Ror核苷酸序列的工程化细胞。在其它实施例中， 执行基于酶检定(例如，激酶检定)的检定。
然后，可进一步测试经鉴别适用于调节Ror蛋白活性的测试药剂。在某些实施例中， 在其它基于细胞的检定或非基于细胞的检定中测试药剂。可在多种疾病的动物模型(包 括多种骨疾病和病症的动物模型)中测试化合物。举例来说，可在骨折、骨质疏松、骨 癌、骨流失等的动物模型中测试药剂。
本发明以引用的方式并入分子和细胞生物学领域内熟知的方法和技术。这些技术包 括(但不限于)以下公开案中所述的技术欧德里沃(Old,R.W.)和斯布普里莫斯(S. B. Primrose),基因操作的原理基因工程介绍(Principles of Gene Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering)(第3版，1985)，布拉克威尔科学出版社(Blackwell Scientific Publication),波士顿(Boston),微生物学研究(Studies in Microbiology);第 2巻:第409页(ISBN 0隱632-01318-4);山姆布鲁克杰(Sambrook, J.)等人编，分子克 隆实验手册(Molecular Cloning: A Laboratory Manual),(第2版，1989),冷泉港实验 室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约(NY.),第1-3巻(ISBN 0-87969-309-6);米勒杰赫(Miller, J. H.)和米皮卡罗斯(M. P. Calos)编，哺乳动物细 胞的基因转移载体(1987),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press), 纽约(NY.)，第169页(ISBN 0-87969-198-0)。
实例
进一步在以下实例中界定本发明，其中除非另有说明，否则所有份数和百分比都以 重量计且度为摄氏度。应了解，这些实例虽然指示本发明的优选实施例，但其仅以说明 的方式给出。根据上述讨论、实施例和这些实例，所属领域的技术人员将容易地了解， 在本质上不脱离本发明的新颖教示和不脱离本发明精神和范畴的情况下，例示性实施例 可能存在多种修正。此外，可对本发明进行多种改变和修正以使本发明适应多种用途和 情形。因此，所有这些修正打算包括在下文权利要求书中所界定的本发明范畴内。
本文中所提及的专利、申请案、测试方法和公开案以全文引用的方式并入本文中。
一般方法
材料和组织培养
除非另有注解，否则组织培养试剂都购自英杰公司(Invitrogen Corporation)(卡尔 斯巴德，加利福尼亚州(Carlsbad, CA));其它试剂和化学品购自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)(圣路易，密苏里州(St. Louis, MO))或英杰。重组人类Ror2的GST 标记的胞液域是获自英杰且GST标记的重组人类14-3-3(3是来自生物分子国际公司 (Biomol International, LP)(普利茅斯米廷，宾夕法尼亚州(Plymouth Meeting, PA))。 抗Flag M2小鼠单克隆抗体、抗Flag M2亲和琼脂糖和抗|3-肌动蛋白小鼠单克隆抗体是 获自西格玛(Sigma);抗人类Ror2山羊多克隆抗体购自安迪生物(R&D Systems)(明 尼阿波利斯，明尼苏达州(Minneapolis, MN));抗14-3-3卩和抗His兔子多克隆抗体是 来自圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)(圣克鲁兹，加利福 尼亚州(Santa Cruz, CA))。非接合和琼脂糖接合抗磷酸化酪氨酸抗体(4G10)获自 Upstate细胞信号转导方案公司(Upstate Cell Signaling Solutions)(夏洛茨维尔，弗吉尼 亚州(Charlottesville, VA));固定磷酸化酪氨酸抗体P-Tyr-100是来自细胞信号转导技 术公司(Cell Signaling Technologies)(贝弗利，马萨诸塞州(Beverly, MA));且蛋白A 琼脂糖和谷胱甘肽琼脂糖购自安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)(白金汉 郡，英国(Buckinghamshire, England))。辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP) 接合二级抗体是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(Santa Cruz Biotechnology)。
人类间充质干细胞(hMSC)购自卡姆布莱克斯公司(Cambrex,Inc.)(巴尔的摩，马 里兰州(Baltimore MD))且使用hMSC生长培养基(MSCGM,卡姆布莱克斯(Cambrex)) 在37'C下维持于5% C02-95。/。加湿空气培育箱中。将U20S人类骨肉瘤细胞在37'C下 保持于含有10%热失活胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、 1%青霉素-链霉素和2 mM glutaMAX-I的McCoy的5A改良培养基中。
质粒和腺病毒
先前已描述人类Ror2-Flag表达质粒的产生(比里德(Billiard)和波汀(Bodine)， 2004年4月14日申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998;比里德(Billiard)等人, 分子内分泌学(MolEndo) 19,90-101,2005)。通过在Ror2-Flag的COOH未端处用编 码6个组氨酸的序列替换Flag表位标签产生Ror2-His构筑体。Ror2的胞液域的GST 融合物(GST-Ror2c)是通过将人类Ror2细胞内域(编码氨基酸428-944)插入pGEX-4T-2 载体(安玛西亚(Amersham))中的GST标签之后的框架中而获得。
全长人类14-3-3pcDNA购自开放生物系统(OpenBiosystems)(亨茨维尔，阿拉巴 马州(Huntsville， AL))且亚克隆于pET28a细菌表达载体中。
含有人类柯萨奇腺病毒受体(human coxsackie adenovirus receptor， hCAR)、 Ror2 特异性shRNA和EGFP特异性shRNA的腺病毒获自加拉帕戈公司(Galapagos, Inc.)(梅 赫伦，比利时(Mechelen, Belgium))。已描述Ror2、 Ror2KD和卩-半乳糖苷酶(p-gal) 腺病毒的产生(比里德(Billiard)和波汀(Bodine)， 2004年4月14日申请的美国申 请案U.S.S.N. 10/823,998，其以引用的方式并入本文中)。
颅盖骨器官培养和感染
从4天大的同窝出生小鼠中切除颅盖骨，沿径向缝(sagittal suture)切割且在含有 0.1% BSA的无血清BGJ培养基中培育24小时。然后，将每一半颅盖骨以凹面向下方 式放到12孔板的孔中的不锈钢网格(小部件公司(Small Parts Inc)，迈阿密(Miami), 佛罗里达州(Fl))上。各孔含有lml具有l。/。FBS的BGJ培养基，可不含或含有P-gal 或Ror2腺病毒(3.75 mln病毒颗粒/ L)。将颅盖骨在5% <:02-95%加湿空气培育箱中培 育，且4天后，更换培养基和腺病毒。
在存在腺病毒下培育7天后，在室温下将颅盖骨在10%呈中性且经磷酸盐缓冲的甲 醛中固定72小时，然后在10%存于PBS中的EDTA中脱钙6小时。将各组中的颅盖 骨平行包埋于同一石蜡块中，且用苏木精-曙红对4 nm切片染色。选择一致的骨区域 (离额缝200 pm处)用于组织形态计量学分析(histomorphometric analysis)。简言之， 将200平方微米网格放在每一颅盖骨上且用骨测量系统(Osteomeasure System)(骨测 量公司(Osteometries Inc)，亚特兰大，佐治亚州(Atlanta, GA))测定成骨细胞数目 和总骨面积。将骨表面上的所有细胞作为成骨细胞计数。使用钙诊断试剂盒(Calcium Diagnostics Kit)(西格玛(Sigma))，根据制造商的实验方案测量培养基钙。 病毒感染
以6,000/cn^将人类MSC接种于12孔或6孔板中且使其附着及增殖过夜。以感染 倍率(multiplicity of infection, MOI) = 750在hCAR (MOI = 750)存在下，使用Ror2、 Ror2KD或卩-gal腺病毒在0.4 ml/cm2 MSCGM中使细胞感染24小时以提高感染效率。 24小时后，以PBS洗涤细胞一次且添加MSCGM、补充有0.05 mM抗坏血酸和10 mM 卩-甘油磷酸酯的MSCGM或含有成脂补充物(PT-3004,卡姆布莱克斯(Cambrex))的 MSCGM。指示时，向培养基中添加lOOnM地塞米松(dex)和/或所指示的抗体。对于 shRNA感染，以6,000/cn^将细胞接种于12孔或6孔板中且使其附着及增殖3天。以 每个细胞4,000个病毒颗粒(以原始接种密度计)在hCAR (MOI = 750)存在下，使用
编码Ror2特异性shRNA或EGFP特异性shRNA的腺病毒在0.4 ml/cm2 MSCGM中使 细胞感染72小时。72小时后，以PBS洗涤细胞一次，且添加MSCGM或补充有0.05 mM 抗坏血酸、lOmMp-甘油磷酸酯的MSCGM。指示时，添加100 nM dex和/或特异性抗 体。每隔5天，用新鲜培养基替换整个培养基或一半培养基。
以75，000/cm2将U20S细胞接种于6孔板中且随后在MOI = 100下用Ror2、Ror2KD 或卩-gal腺病毒感染24小时。使感染进行24小时且再过24小时后收集细胞提取物。
茜素红-S组织化学染色
在12孔板上通过茜素红-S组织化学染色来确定由hMSC所导致的矿物化结节的形 成。在室温下用70%(v/v)乙醇固定细胞和基质，用去离子水洗涤且在室温下用40 mM 茜素红-S (pH 4.2)染色10分钟。用去离子水洗涤染色基质且拍照。为定量茜素红-S 染色的水平，用1毫升/孔的10% (w/v)西吡氯铵洗脱染料。在562 nm下用微板读取 器定量洗脱样品中的茜素红-S (对照0-800 tiM染料的标准曲线)。
油红O组织化学染色
在12孔板上通过油红0组织化学染色来监测hMSC中的脂肪生成。在室温下用10% 中性缓冲福尔马林(formalin)固定细胞，用PBS洗涤且在室温下用60%异丙醇中的18 mg/mL油红0 (pH7)染色10分钟。用PBS洗涤染色细胞且拍照。
RNA分离和实时PCR分析
使用RNeasy试剂盒(凯杰(Qiagen)，巴伦西亚，加利福尼亚州(Valencia, CA))， 按照制造商的说明书分离总细胞RNA且使用ABI PRISM 7700序列检测系统(ABI PRISM 7700 S叫uence Detection System )(美国应用生物系统公司 (Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州(Foster City, CA))使其经受实时RT-PCR分析。 将所有mRNA水平标准化为看家基因(housekeeping gene)亲环素B的水平。人类 C/EBPa和PPARy的引物和探针购自美国应用生物系统公司(Applied Biosystems);人 类亲环素B的引物和探针如下5'-CACCAACGGCTCCCAGTT-3'(正向弓l物，438-455， SEQIDNO: 1)、 5'-AACACCACATGCTTGCCATCT陽3'(反向弓l物，486-506, SEQ ID NO: 2)和5'陽TTCATCACGACAGTCAAGACAGCCTGG-3'(探针，457-483， SEQIDNO: 3)。
瞬时转染
对于Ror2质粒转染，以约80%汇合密度(confluent density)接种U20S细胞且24 小时后使用Fugene6转染试剂(罗氏应用科学(Roche Applied Science),印第安纳波利 斯，印第安纳州(Indianapolis, IN))按照制造商的说明书用每19.6 cm2 11吗总质粒 DNA转染。对于siRNA转染，以52,000个细胞/平方厘米将U20S细胞放置在6孔板
上，24小时后使用10 nl Lipofectamine 2000试剂按照制造商的说明书用25 nM Ror2 siRNA或非特异性siRNA (两者都来自达哈玛康公司(Dharmacon Inc.)，拉斐特，加利 福尼亚州(Lafayette, CO))转染。
免疫沉淀法和西方免疫印迹法
将细胞溶解于补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(西格玛(Sigma))的溶解缓冲 液(150 mM NaCl， 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)， 1 mM EDTA， 1。/o曲拉通X100(Triton X100)) 中，且通过在4'C下在10，000Xg下离心10分钟使提取物澄清。对于Flag免疫沉淀法， 在4。C下在转动下将1 mg总细胞溶解产物与30 ^ M2 Flag亲和琼脂糖(西格玛 (Sigma)) —起培育1小时。通过离心收集珠粒且以含有350 mMNaCl的溶解缓冲液洗 涤3次且以溶解缓冲液洗涤3次。对于14-3-3P沉淀，在4'C下将15 pl 14-3-3(3抗体与 30 ^蛋白A琼脂糖一起在lml溶解缓冲液培育过夜，且通过离心收集珠粒且以溶解缓 冲液洗涤，之后添加1 mg总细胞溶解产物。在4'C下在轻度转动下进行结合反应2小 时且收集珠粒且如关于Flag沉淀所述进行洗涤。对于磷酸化酪氨酸沉淀，向100 pi G410 珠粒中添加1 mg (对于检测过表达的蛋白质来说)或1.5 mg (对于检测内源性蛋白质 来说)细胞提取物且在4'C下使其附着3小时。此时，向混合物中添加P-Tyr-100固定 抗体(100^1)历时另外3小时。通过离心收集所有珠粒且如关于Flag沉淀所述进行洗 涤。在所有免疫沉淀反应结束时，将珠粒在30-50 ^12xLDS-PAGE缓冲液中与还原齐l」(英 杰(Invitrogen)) —起煮沸，且由SDS-PAGE分离溶解的蛋白质。将凝胶转移到0.45 pm 硝化纤维素膜上，之后用各特异性抗体检测。
对于无沉淀的免疫印迹，在变性和还原条件下由SDS-PAGE拆分指示量的总细胞 溶解产物，之后将其转移到0.45 pm硝化纤维素膜上且用各特异性抗体检测。
GST混测(pool-down)和活体外激酶检定
使用艾普斯外(Expressway )活体外蛋白质合成系统(英杰(Invitrogen))，按照 制造商的说明书在50 ^反应中自14-3-3(3-pET28a活体外翻译14-3-3卩。将pGEX-4T-2 或pGEX-4T-2 (仅编码GST)中的GST-Ror2c转型为大肠杆菌的BL21 (DE3)菌株。 使培养物生长到A咖为0.7且通过添加异丙基-l-硫基-(3-D-吡喃半乳糖苷(西格玛 (Sigma);最终浓度为lmM)并培育4小时进行诱导以表达重组蛋白。通过离心收集细 菌小球，以PBS洗涤且使其再悬浮于30ml补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(西格 玛(Sigma))的PBS中。通过以16,000磅/平方英寸(p.s丄)穿过弗氏细胞压碎器(French Pressure Cell Press)(光谱仪器(Spectronic Instruments)，罗彻斯特，纽约(Rochester, NY))两次使细胞溶解，且通过离心移出细菌碎片。在4。C下将所产生的GST-Ror2c或
GST蛋白与谷胱甘肽琼脂糖一起培育4小时。洗涤珠粒，使其再悬浮于1 mlPBS中， 且在4'C下添加整个50iall4-3-3卩活体外翻译反应历时4小时。在此培育结束时，将珠 粒以PBS洗涤3次，在2XLDS-PAGE缓冲液中与还原剂(英杰(Invitrogen)) —起煮 沸，且由SDS-PAGE分离溶解蛋白质。将凝胶转移到0.45pm硝化纤维素膜上，之后用 各特异性抗体检测。
对于活体外激酶检定，将6.5 pg纯化的重组人类GST-14-3-3p(生物分子(Biomo1)) 再悬浮于25 pl添加有或未添加0.9 pg纯化的重组人类GST-R2c (英杰(Invitrogen)) 的激酶反应缓冲液(10 mM MgCl2， 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 1 mM 二硫苏糖醇 (dithiotriethol， DTT)， 1 mM MATP)中。在37。C下使激酶反应进行30分钟且通过在 lxLDS缓冲液中与还原剂(英杰(Invitrogen)) —起煮沸来停止。由SDS-PAGE拆分蛋 白质，将其转移到0.45pm硝化纤维素膜上且用磷酸化酪氨酸抗体检测。接着，剥离所 述膜且用14-3-3(3抗体再探测以验证同等负载。
统计分析
数据以平均值士SE形式呈现。使用单因素方差分析(one-way ANOVA)或学生t 检验(Student's T-test)来确定统计显著性。当P〈0.05时，认为结果在统计上不同。 实例1
内源性Ror2在hMSC分化中发挥作用
我们先前已展示在hMSC的成骨分化过程中Ror2表达增加(比里德(Billiard)等 人，2004年4月14日申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998;比里德(Billiard) 等人,分子内分泌学(MolEndo) 19,90-101,2005，其各自以引用的方式并入本文中)。 为评定hMSC分化过程中Ror2表达的升高是否是成骨细胞生成的关健，当Ror2表达受 抑制时我们执行dex诱导的分化。为此目的，用含有Ror2特异性shRNA的腺病毒感染 hMSC，当与EGFP特异性对照shRNA相比时，Ror2特异性shRNA实际上强烈抑制dex 诱导的Ror2蛋白表达的升高(图1A)。用Ror2 shRNA感染几乎完全废除dex诱导基 质矿物化的能力(图1B和图1C)，从而提示Ror2的升高至少部分介导dex诱导的hMSC 的成骨细胞分化。
实例2
Ror2过表达抑制hMSC的成脂分化
我们先前也已展示Ror2过表达起始使MSC定型为成骨细胞品系且促进成骨细胞生 成的早期与晚期分化(比里德(Billiard)等人，2004年4月14日申请的美国专利申请 案U.S.S.N. 10/823,998;其以引用的方式并入本文中)。现在，我们评定Ror2对通过在
含吲哚美辛(indomethacin)和含IBMX的成脂混合物中进行培育所诱导的hMSC的替 换走向(脂肪生成)的作用。用编码野生型Ror2或激酶域突变体(Ror2KD)(各含有 COOH未端flag表位标签)的腺病毒感染人类MSC。在Ror2KD中，用异白胺酸替换 位置504 (推定的ATP结合域)、507和509处的三个赖氨酸以使得酪氨酸激酶活性显 著降低(日笠(Hikasa)等人，发展(Development) 129, 5227-5239, 2002;比里德(Billiard) 等人，2004年4月14日申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998;比里德(Billiard) 等人，分子内分泌学(MolEndo) ， 19,卯-101,2005)。对于对照物，在相同腺病毒本底 中用卩-半乳糖苷酶(卩-gal)表达盒感染hMSC。 Ror2与Ror2KD突变体都抑制主要成 脂转录因子CCAAT/强化子结合蛋白a (CCAAT/enhancer-bindingproteina， C/EBPa)和 过氧物酶体增生齐U活化受体Y (peroxisome proliferator陽activated receptor y， PPARy)的 表达(图2A)，且使得hMSC形成油红O阳性脂质产生性脂肪细胞的能力明显下降(图 2B)。结合我们先前的结果(比里德(Billiard)等人，2004年4月14日申请的美国专 利申请案U.S.S.N. 10/823,998;其以引用的方式并入本文中)，这些数据指示Ror2通过 移动转录因子的平衡使其偏向成骨细胞生成来改变MSC的细胞走向。 实例3
Ror2增加小鼠颅盖骨的总骨面积
接着，我们测试Ror2对hMSC分化的活体外作用是否翻译成离体器官培养物中的 骨形成的增加。将4天大的同窝出生小鼠的颅盖骨保留不感染或用P-gal或Ror2腺病毒 感染。在腺病毒存在下培养7天后，将骨用苏木精-曙红染色且使用成骨测量系统使相 容的200 ^!112切片(离额缝200 pm处)经受组织形态计量学分析。在对照未感染条件 下，200 ^m^颅盖骨切片含有5171 ±235 pn^的骨面积和84士6.5个成骨细胞。用Ror2 病毒感染引起总骨面积增加50%,而不影响成骨细胞数目，这指示Ror2活化成骨细胞 以产生更多骨基质(图3)。
实例4
14-3-3B是第一个鉴别的Ror2激酶受质
我们先前已报导由质谱鉴别U20S骨肉瘤细胞中的9种潜在Ror2结合因子(比里 德(Billiard)等人，2004年4月14日申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998;其 以引用的方式并入本文中)。在这些因子中，已展示14-3-3蛋白在细胞周期进程和分化 中发挥作用(麦金托什(Mackintosh),生物化学杂志(BiochemJ) 381,329-342,2004) 且我们选择14-3-3(3用于后续研究。我们首先证实使用免疫沉淀技术由质谱观察到的相 互作用。
用p-gal、 Ror2或Ror2KD腺病毒感染U20S细胞，且分离总细胞蛋白质且使其经 受在抗Flag亲和琼脂糖上进行的免疫沉淀，接着经受用抗14-3-3卩抗体进行的免疫印迹 法(图4A，上图)。在对照条件(p-gal感染细胞)下，极少量14-3-3P沉淀，{旦Ror2 过表达之后出现大量共沉淀。与Ror2KD突变体的复合物形成甚至更强，这指示激酶活 性导致复合物解离。沉淀的同等水平已通过用抗Flag抗体进行的免疫印迹法加以验证 (图4A，下图)。14-3-3|3与Ror2之间的相互作用已通过使14-3-3p沉淀于14-3-3p特异 性抗体上进一步得到证实且通过抗Flag免疫印迹法验证复合物中Ror2的存在(图4B)。
为评定Ror2是否引起14-3-3|3磷酸化，我们用抗磷酸化酪氨酸抗体再探测图4A中 的印迹。这一抗体鉴别在与14-3-3J3相同的分子量下迁移且仅存在于表达野生型Ror2 而不是P-gal或激酶非活性突变体的细胞中的磷酸化蛋白(图4A，中图)。这提示Ror2 直接或间接使14-3-3卩在酪氨酸残基处磷酸化。这一假设通过使U20S提取物中的所有 酪氨酸磷酸化蛋白免疫沉淀于抗磷酸化酪氨酸抗体上且在Ror2过表达后观察到磷酸 -14-3-33的量显著增加而得到证实(图4C)。
为测试内源性Ror2是否介导图4C中所观察到的14-3-3|3的本底磷酸化，我们由 Ror2特异性siRNA抑制U20S细胞中的Ror2表达。如图5A中所示，当与零乱对照siRNA 相比时，用Ror2特异性siRNA转染达成Ror2蛋白表达的几乎完全抑制。Ror2表达的 降低不会对U20S细胞中的14-3-3p蛋白的量产生影响，但引起其酪氨酸磷酸化的显著 下调(图5E)。与图4C相比，14-3-3p本底磷酸化程度的明显增加由于此处所使用的较 长曝光时间而产生。
为评定Ror2与14-3-3P的结合和14-3-3卩的磷酸化是否是直接的，我们用重组纯化 蛋白质执行活体外实验。对于结合实验，将人类Ror2的胞液域的GST融合物 (GST-Ror2c)表达于细菌细胞中，使其沉淀于谷胱甘肽琼脂糖上且与活体外翻译的 14-3-3p—起培育。如图6A中所示，14-3-3(3结合于GST-Ror2c，而不是结合于单独的 GST，这指示14-3-3p直接结合Ror2的胞液域。因为活体外翻译的14-3-3p含有与激酶 检定不相容的艾普斯外(ExpresswayTM)蛋白合成缓冲液，所以我们购买纯化的重组 GST标记的14-3-3(3且用纯化的重组GST-Ror2c (英杰(Invitrogen))执行活体外激酶 检定。如图6B中所示，Ror2c磷酸化14-3-3卩与其自身，从而证实14-3-3卩是Ror2酪 氨酸激酶的直接受质。
实例5
Ror2特异性抗体使Ror2受体二聚合且活化Ror2受体
己展示数种受体酪氨酸激酶由抗体二聚合且活化(斯帕加伦(Spaargaren)等人，生
物化学杂志(J. Biol. Chem.) ，266,1733-1739,1991;福(Fuh)等人，科学(Science) 256， 1677-1680, 1992;其各自以引用的方式并入本文中)。因此，我们测试针对人类Ror2 的整个细胞外域培养的Ror2特异性抗体使Ror2受体酪氨酸激酶二聚合且活化Ror2受 体酪氨酸激酶的能力。为评定二聚合，将Flag标记和His标记的Ror2受体构筑体表达 于U20S细胞中，且在37'C下用Ror2特异性山羊多克隆IgG (针对人类Ror2的细胞外 域培养，安迪生物(R&D Systems), AF2064)或用非特异性山羊IgG对照物(安迪生 物(R&D Systems))处理细胞历时1小时。培育后，提取总细胞蛋白质，使其沉淀于 抗Flag亲和琼脂糖上且使其经受用抗His抗体进行的免疫印迹法。如图7A的上图中所 示，在非特异性IgG处理的对照条件下，His标记与Flag标记的Ror2受体之间存在一 些缔合，这指示Ror2在过表达于U20S细胞中后形成同源二聚体。此同源二聚体的形 成在用Ror2抗体处理后急剧增强，证实这一抗体可使Ror2受体二聚合。试验设计由抗 Flag抗体在不存在Ror2-Flag的情况下未能免疫沉淀Ror2-His且抗His抗体不识别 Ror2-Flag蛋白的事实所验证(图7A，上图)。Ror2-Flag沉淀的同等水平由用抗Flag 抗体进行的免疫印迹法所验证(图7A，下图)。
为阐述抗体是否活化Ror2酪氨酸激酶，我们在37'C下用Ror2特异性抗体或IgG 对照物处理U20S细胞历时1小时，分离总细胞蛋白质提取物且使所有酪氨酸磷酸化蛋 白沉淀于磷酸化酪氨酸抗体上。图7B说明用抗Ror2抗体处理达成Ror2激酶的显著自 动磷酸化以及其受质14-3-3P蛋白的磷酸化。这些数据提供抗Ror2抗体使Ror2酪氨酸 激酶受体二聚合且活化Ror2酪氨酸激酶受体的强有力证据。
实例6
Ror2特异性活化抗体促进hMSC矿物化
接着，我们试问抗体诱导的Ror2 二聚合和活化是否将对hMSC的成骨分化产生功 能性结果。因为除非hMSC分化为成骨表型，否则其并不表达Ror2 (比里德(Billiard) 和波汀(Bodine), 2004年4月14曰申请的美国专利申请案U.S.S.N. 10/823,998;比里 德(Billiard)等人，分子内分泌学(MolEndo) 19,90-101,2005;其各自以引用的方式 并入本文中)，所以我们通过用成骨混合物(补充有0.05mM抗坏血酸、10mM(3-甘油 磷酸酯和100 nM dex的MSCGM)处理来诱导Ror2表达且添加递增量的Ror2特异性 山羊IgG或非特异性山羊IgG。培育9天后，用茜素红-S组织化学染色来评定矿物化基 质形成的程度。如图8中所示，抗Ror2抗体剂量依赖性增加hMSC中钙化基质形成的 程度。除在100pg/ml最高剂量下观察到轻微抑制外，非特异性山羊IgG在所有测试浓 度下都不对基质矿物化产生影响。为清楚起见，图8中仅展示非特异性IgG的一个剂量
(50 ng/ml)。针对人类Rorl的总细胞外域培养的山羊多克隆抗体(安迪生物(R&D Systems), AF2000)也不起作用(图8)。抗Ror2抗体作用是通过Ror2受体介导，因 为当Ror2在hMSC中的表达受Ror2特异性shRNA抑制时，这一作用消失(图9A)。 此外，抗Ror2抗体即使在不存在dex的情况下也诱导钙化基质形成，只要通过腺病毒 感染诱导细胞表达Ror2即可(图9B)。因此，Ror2特异性抗体可使Ror2受体二聚合 且活化Ror2受体且促进间充质干细胞中Ror2介导的钙化基质形成，这提示活化Ror2 抗体可向骨质疏松和其它骨疾病提供有效治疗。 实例7
14-3-3B的抑制增强hMSC矿物化
为测试14-3-3P是否在成骨分化中发挥作用，我们在不存在和存在Ror2过表达的 情况下抑制14-3-3p表达。为此目的，用14-3-3(3特异性shRNA感染hMSC，当与零乱 对照shRNA相比时，14-3-3|3特异性shRNA实际上强烈下调内源性蛋白表达(图10A)。 当用两种含有零乱shRNA和卩-半乳糖苷酶的对照病毒感染hMSC时，我们观察到低程 度的基质矿物化(图10B)，这提示其自身的双重感染在hMSC培养物中介导轻度骨生 成。如先前所观察(比里德(Billiard)等人，2004年4月14日申请的美国专利申请案 U.S.S.N. 10/823，998)，用Ror2腺病毒感染强有力地促进矿物化基质的形成。出乎我们 意料之外，14-3-3P的下调也大大增加矿物化程度(图10B)。 Ror2过表达和14-3-3卩抑 制一起诱导比仅一个所诱导的基质矿物化强烈的基质矿物化(图10B)。这是提示 14-3-3(3骨架蛋白对hMSC的成骨分化起抑制作用的第一个证据。
实例8
抗体诱导的Ror2活化和14-3-3B抑制促进离体颅盖培养物中的新骨形成 接着，我们测试Ror2活化和14-3-3P抑制的活体外作用是否翻译成离体器官培养 物中骨形成的增加。用含有零乱shRNA或14-3-3P特异性shRNA的腺病毒以5X107 个病毒颗粒/毫升感染4天大的同窝出生小鼠的颅盖骨；且48小时后，在15吗/ml钙黄 绿素存在下用12吗/ml抗Ror2抗体或非特异性IgG处理。用腺病毒和抗体培养7天后， 用苏木精-曙红将骨染色，且使用Bioquant-NOVA MR 5.50.8 (纳什维尔，田纳西州 (Nashville, TN))使相容300 pm伸长(离额缝450 pm处)经受组织形态计量学分析。 在零乱shRNA感染和IgG处理的对照条件下，600 pm长度的颅盖骨含有9394±1333 pri^骨面积和39.5±7.4个成骨细胞。特异性shRNA对14-3-3P的抑制引起总骨面积增 加60%且使成骨细胞数目增加50%，指示14-3-3(3蛋白抑制成骨细胞数和/或活性(图 11)。用抗Ror2抗体处理颅盖骨导致成骨细胞数目增加85%且导致总骨面积增加50%,
再一次提示活化Ror2抗体可向骨质疏松和其它骨疾病提供有效治疗。然而，使14-3-3P shRNA感染与Ror2抗体处理组合并不会产生叠加效应，与仅任一处理相比，其导致甚 至略小的反应(图11)。因为在我们的实验中，所观察到的50-80%的增加未达到这一 检定系统的饱和度，所以尝试推测Ror2与14-3-3P以相同通路控制成骨细胞分化和/或 功能。
实例9
开发用于Ror2活性的高通量、高灵敏度检定
如图12A中所示，所述检定利用经充分表征的TrkB受体信号转导通路。TrkB受 体通过配位体诱导的引起Erk磷酸化且刺激靶基因启动子中的cAMP反应元件(CRE) 的均二聚合活化。产生由与TrkB的跨膜域和细胞内域(aa 432-822)融合的Ror2细胞 外域(aa 1-407)组成的嵌合受体。我们假设当使用此嵌合体时，引起Ror2二聚合的药 剂将活化TrkB信号转导通路且使得CRE启动子活性增加。为检验这一假设，将嵌合受 体稳定转染于获自曹成恩博士 (Dr. SeongeunCho)(韦思研究中心，普林斯顿，新泽西 州(Wyeth Research, Princeton, NJ))的过表达CRE-荧光素酶质粒的HEK293A细胞 (HEK-CRE)中。使用ECM 600电穿孔仪(BTX，圣地亚哥，加利福尼亚州(SanDiego, CA))将pcDNA3.1(+)-hygro中的Ror2-TrkB嵌合体电穿孔于HEK-CRE细胞中，且使 细胞与350吗/ml潮霉素一起生长直到形成分离的潮霉素抗性细胞集落。将所述集落胰 蛋白酶化且在96孔板上每孔转移一个。使集落与350 ng/ml潮霉素一起在37'C下生长， 且由西方免疫印迹法和免疫细胞化学法评定Ror2-TrkB表达的水平。用先前已展示使 Ror2 二聚合的抗Ror2抗体(参见实例5)处理表达Ror2-TrkB嵌合体的HEK-CRE细 胞。如图12中所示，当与用非特异性IgG处理的细胞相比时，Ror2特异性抗体引起所 观察到的荧光素酶活性的稳定剂量依赖性增加。因此，我们已研发一种测量药剂(包括 但不限于小分子、肽、蛋白质或抗体)诱导Ror2二聚合和活化的能力的高通量且高灵 敏度的快速检定。
权利要求
1. 一种治疗或预防骨相关病症的方法，其包含向患有骨相关病症的个体投与治疗有效量的能够活化Ror2蛋白的药剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述骨相关病症与骨流失相关联。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述病症选自由以下各病组成的群组骨质疏 松、骨癌、关节炎、佝偻病、骨折、牙周病、节段性骨缺损、溶骨性骨疾病、原 发性和继发性甲状旁腺功能亢进、帕哲病(Paget's disease)、骨软化和骨肥厚。
4. 根据权利要求l所述的方法，其中所述个体为人类。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂引起Ror2蛋白二聚合。
6. 根据权利要求l所述的方法，其中所述药剂为小分子。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂为蛋白质。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂包含针对Ror2蛋白的抗体。
9. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂包含针对Ror2蛋白的单克隆抗体。
10. 根据权利要求l所述的方法，其中所述药剂为针对Ror2的人类或人化单克隆抗体。
11. 根据权利要求8、 9或10所述的方法，其中所述抗体具有IgG同种型。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂包含针对Ror2蛋白的抗体片段。
13. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂包含针对Ror2蛋白的Fab片段。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂包含至少两个针对Ror2蛋白的抗体片 段，其中所述抗体片段共价连接在一起。
15. 根据权利要求l所述的方法，其中所述药剂经肠道外投与。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂经静脉内投与。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述药剂经口投与。
18. —种增加成骨细胞分化的方法，其包含使表达Ror2的细胞与能够活化所述Ror2 的药剂接触。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂为蛋白质。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂为小分子。
21. 根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂为抗体。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述药剂为针对Ror2蛋白的抗体。
23. 根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂引起Ror2蛋白二聚合。
24. 根据权利要求18所述的方法，其中所述药剂增加由Ror2蛋白所致的14-3-3p的磷 酸化。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞为人类细胞。
26.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞为干细胞。
27.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞为间充质干细胞。
28.根据权利要求18所述的方法，其中所述接触步骤离体执行。
29.根据权利要求18所述的方法，其中所述接触步骤在活体内执行。
30.一种抑制成脂分化的方法，其包含使细胞与增加Ror2蛋白的表达或活性的药剂接触。
31. —种筛选增加Ror2活性的药剂的方法，其包含以下步骤:使表达Ror2蛋白的细胞与测试药剂接触；和确定Ror2活性是否增加。
32.根据权利要求31所述的方法，其中Ror2为Ror2的细胞域。
33.根据权利要求31所述的方法，其中Ror2为Ror2的激酶域。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述确定步骤包含评定Ror2蛋白的激酶活性。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述评定Ror2蛋白的激酶活性的步骤包含评定Ror2蛋白的磷酸化状态。
36.根据权利要求31所述的方法，其中所述确定步骤包含评定Ror2蛋白或聚核苷酸的表达水平。
37.根据权利要求31所述的方法，其中所述确定步骤包含评定14-3-3卩蛋白的磷酸化状态。
38.根据权利要求31所述的方法，其中所述确定步骤包含测定矿物化基质形成的水平。
39.一种由根据权利要求31所述的方法鉴别的药剂。
40.一种针对Ror2的抗体，其中所述抗体引起Ror2蛋白活化。
41.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体引起Ror2蛋白二聚合。
42.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。
43.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
44.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体为人类抗体。
45.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体为人化抗体。
46.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体具有IgG同种型。
47.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体包含抗体片段。
48.根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体片段为Fab片段。
49. 根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体具有至少两个用于Ror2蛋白的结合 位点。
50. 根据权利要求40所述的抗体，其中所述抗体确切地具有两个用于Ror2蛋白的结 合位点。
51. —种治疗或预防骨相关病症的方法，其包含向患有骨相关病症的个体投与治疗有 效量的能够抑制14-3-3卩活性的药剂。
52. 根据权利要求51所述的方法，其中所述药剂下调14-3-3p表达。
53. 根据权利要求51所述的方法，其中所述药剂为14-3-3(3特异性siRNA或shRNA。
54. —种鉴别促进Ror2蛋白二聚合的药剂的方法，所述方法包含以下步骤提供表达包括Ror2细胞外域和TrkB细胞内域的嵌合受体的细胞，其中所述细 胞包含可操作性连接于cAMP反应元件(CRE)启动子的报告基因构筑体； 使所述细胞与测试药剂接触；和 测定所述细胞中所述报告基因的表达水平。
55. 根据权利要求54所述的方法，其中所述报告基因为荧光素酶。
56. 根据权利要求54所述的方法，其中所述细胞包含包括可操作性连接于所述CRE 启动子的编码荧光素酶的基因的质粒。
57. —种蛋白质，其具有以下氨基酸序列MARGSA乙PRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRG丁ASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyavwiaswgfcllvmlfllklarhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdaviigmtkipvienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivlkrelgegafgkvflaecynlcpeqdldlvavktlkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygvcvegdplimvfeymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhfVhrdlatrnclvgenll vkigdfgmsrdvystdyyrvggh加lpirwmppesimyrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqls nneviecitqgrvlqrprtcpqevyelmlgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspv.yldilg (SEQ ID NO: 4); ;或 与SEQIDNO:4至少卯％同源的氨基酸序列。
58. 根据权利要求57所述的蛋白质，其中所述氨基酸序列为MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGNfKTfTATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPL1LMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGG(5MEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyawviaswgfcllvmlfllklarhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdaviigmtkipvienpqyfgitnsqlkpdtfvqhikrhnivlkrelgegafgkvflaecynlcpeqdkilvavktlkdasdnarkdfhreaelltnlqhehivkfygvcvegdplimvfeymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvyIasqhfVhrdlatmclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvggh加lpirwmppesimyrkfttesdvwslgwlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpqevyelmlgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspvyldilg (SEQ ID NO: 4);与SEQ ID NO: 4至少95%同源的氨基酸序列。
59. 根据权利要求57所述的蛋白质，其中所述氨基酸序列为MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFWPLCDARSRAPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRL(JLPKCEALPMPESPDAANC魔IGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRM ELCDVPSCSPRDSSKMGILYlsvyavwiaswgfcllvinlfllklarhskfgmkgpasvisndddsasplhhisngsntpssseggpdaviigmtkipvie叩qyfgitnsqlkpdtfVqhikrhnivlkrelgegafgkvflaecynlcpeqdkilvavktlkdasdnarkdfhreaelhnlqhehivkfygvcvegdplimvfeymkhgdlnkflrahgpdavlmaegnppteltqsqmlhiaqqiaagmvylasqhfVhrdlatmclvgenllvkigdfgmsrdvystdyyrvgghtinlpirwmppesimyrkfttesdvwslgvvlweiftygkqpwyqlsnneviecitqgrvlqrprtcpqevyelmlgcwqrephmrknikgihtllqnlakaspvyldilg (SEQ ID NO: 4).
全文摘要
本发明涉及调节Ror活性(例如，Ror2蛋白活性)和/或14-3-3β来影响骨形成或骨吸收。本发明进一步涉及用于筛选、诊断和研发诸如骨质疏松和骨折等骨相关病症的治疗的组合物和方法。针对Ror2蛋白的抗体和抗体片段尤其适用于引起Ror2蛋白二聚合，从而促使Ror2活化。
文档编号C12Q1/48GK101384619SQ200780005759
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月16日 优先权日2006年2月17日
发明者燕 刘, 朱丽娅·比亚尔 申请人:惠氏公司