专利名称：：癌症检测试剂以及在病理学和诊断学及癌细胞死亡中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明的实施方案涉及癌症病理学和治疗，具体地，涉及基于病理学的诊断学和治疗学，它们利用个体化的遗传i普分析(geneticprofiling)。背景当体内细胞功能障碍并且开始不受控制地生长时产生癌症。这些功能障碍由细胞DNA蓝图(blueprint)中的突变引起。因此，尽管早年间癌症诊断关注可疑癌细胞的生长性质和物理外观，但更现代的技术已开始检查细胞的内部运转。不是所有的癌症都由相同的突变引起。对引起癌症的特定突变有作用的一些治疗对具有其它类型突变的癌症不起作用，并且如果不适当地开处方实际上可能产生更多损害。因此，至关重要的是区别不同类型癌症的癌症诊断能力与治疗不同类型癌症的能力适当同步。当前的诊断方法正努力配合新疗法发展的速度。当前癌症诊断方法的另一个问题为需要组织样品进行分析。所有目前成功的癌症诊断方法(除了纯粹的成像)，需要从患者身体取出癌细胞。这些细胞最通常获自组织活检。虽然组织活检有效，但其昂贵、耗时，并且对患者是痛苦的。另外，安排和获得组织活检物，随后分析而需要的时间造成治疗耽误，并且活检过程本身可能将癌细胞释放进入血流中，引起增加的转移。虽然这些手术后检验对于指导患者进一步的治疗仍然有效，但如可预先确定胂瘤的性质，可能更加可行的是在患者经受手术的严酷之前尝试非侵入性治疗，如化疗。即使需要手术，患者仍然可能受益于更详细的手术前诊断。所述诊断可能例如允许手术前用所设计药物治疗以将手术期间从肿瘤移出的癌细胞转移性播散的几率减到最低程度。其还可能提供对于手术技术更大的指导，如肿瘤周围多少组织要除去。目前，基于细胞的最成功的诊断方法中的一些利用非活检样品。例如，PAP涂片寻找细胞的不规则性，但其利用由身体正常脱落的细胞。PAP涂片允许在变为宫颈癌的过程中容易地且非常早期地进行细胞检测，从而每年持续挽救数以千计的生命。由于与活检有关的问题以及更简单方法(如PAP涂片)的成功，医学界已花费数年利用另外的容易获得的样品，即血液，尤其是外周血寻找癌症的诊断法。他们的努力已获得一定的成功。例如，利用血液检验容易地监测前列腺癌的进展或复发。然而，当前的基于血液的癌症诊断法，如前列腺癌检验，仍维持关注特定类型的癌症。仍需要对能利用血液i貪断多种癌症或一^:性癌症的癌症i貪断法。除基于组织的癌症诊断法之外，大多数诊断方法依赖成像技术，从简单的X线至MRI以及核成像，常常利用耙向癌症或耙向组织的造影剂以产生更好的图像。然而，即使最有效的成像技术也无法检测小于大约2-5mm直径的肺瘤。等到肺瘤已达到该大小时，其包含数以千计的细胞。此外，这些精密的成像技术太昂贵，而不能在癌症早期应用，即不能在当患者除了可很容易除去的小肿瘤外没有其它症状时应用。事实上，复杂的成像诊断法最常见用于已具有大原发肿瘤并且疑似具有发展的转移性癌症的患者。检测的小肿瘤实际上是由于癌症已播散而转移产生的。因此，不同于常常包含许多良性细胞的原发肿瘤，检测的小肿瘤包含数以千计的恶性、转移性细胞，每个能在体内别处种植另一个肺瘤。明显地，通过当前成像技术的小转移性肿瘤检测确实是挽救垂危患者的最后的努力。如果这些转移性细胞可更早检测，如当它们首先开始经过血液传递时，则患者可针对其可能患有的所有转移性肺瘤开始接受治疗，尽管那些肿瘤仍然太小而不能通过诊断显象或任何其它的当前技术检测。因此存在对转移性胂瘤的更早诊断或对转移性肺瘤很大增加可能性进行检测的需求。然而现代癌症诊断中的另一个缺点涉及其与治疗联合的能力。虽然可通过组织样品诊断一些常见的突变，并用其指导对患者癌症类型的一定程度上特异性的治疗，但该方法只适用少数癌症类型。目前没有诊断方法能检测各种各样类型的癌症或提供用于治疗许多类型癌症的详细靶。最后，当前的癌症诊断法，尤其那些依赖组织活检的那些，在监测进展或治疗有效性方面非常差。如果治疗医师能知道什么时候所有或相当大数目癌细胞或特定类型的癌细胞已经根除，则可挽回数千美元并且可能甚至是患者的生命。另外，通过其性质，癌细胞能够非常迅速地变化。因此，其甚至可以进一步在治疗期间突变，造成一度有用的药物变成无效的或有害的。基本上，癌细胞可变得对药物耐受，就像细菌变得对抗生素耐受一样。癌症治疗将从能检测显示治疗有效性或患者癌细胞更进一步突变的这些和其它变化的诊断方法大大受益。癌症治疗最通常依赖于单个突变、基因和蛋白。随着一种治疗的有效性逐渐消退，给予另一种治疗。该方法的两个缺点是没有一种治疗能够足够耙向癌细胞从而根除疾病，并且每个癌症受试者具有独特的一组突变或其它异常，这使得任何一种治疗都不能针对癌症患者的整个群体。理想的是强效癌症治疗，其单独针对每个癌症受试者，然后表现出杀死个体的全部或大多数癌细胞，而不影响他们的健康细胞的足够效能。为了实现此目标，必须能够对癌症受试者的遗传、突变个体性进行谱分析，然后迅速与个体化的药物反应，从而攻击适合鉴定的谱的那些细胞。概述本发明的实施方案涉及具有特定序列的短的分离的核酸，其长度是至少17个碱基，称作癌症检测试剂。癌症4企测试剂也包括分离的核酸，其具有与本说明书中公开的任何序列互补的序列。本发明的实施方案也涉及在癌症诊断学，特别是基于病理学的诊断学中使用这些核酸的方法。其它方法涉及癌症^r测试剂的抗癌用途，例如杀死癌细力包、i秀导身体杀死癌细胞，或阻碍癌细胞生长，特别是通过诱导癌细胞的耙向的死亡。尽管在很多实施方案中将使用一种以上的癌症检测试剂，在某些实6施方案中，使用的"癌症检测试剂"可能实际上仅仅是单个分离的核酸。此外，本说明书中使用的"受试者"可以包括整个动物，如人、器官、组织、肺瘤、血液、一组细胞，或甚至单个细月包。癌症一全测试剂可以单独或组合用于确定受试者的癌症i普(cancerprofile)。这些癌症^f全测试剂可以用在多种来自受试者的样品上，包括传统胂瘤活4企物以及外周血或其它血液。癌症才企测试剂可以用于才全测癌症、确定癌症分期，或监测癌症或其治疗的过程。此外，采用癌症检测试剂进行的测试可以用于提供癌症谱，其显示存在于受试者内的一个或多个转移性癌细胞中的一些突变或异常。受试者中特定癌症检测试剂或癌症检测试剂的组合的存在或缺乏，可以表明应该或不应该给受试者施用各种疗法，包括含有或基于癌症治疗试剂的疗法。可以基于例如上文描述的诊断结果，选择癌症检测试剂的抗癌用途。但是，也可以基于完全或部分不依赖于采用癌症检测试剂的检测的其它临床指标采用抗癌用途。抗癌用途可以包括基于由癌症检测试剂编码的肽的抗体治疗或基于核酸的治疗。抗癌用途可以与诊断性监测结合，所述诊断性监测用于检测受试者中新癌症检测试剂的出现，或受试者中旧癌症才全测试剂的消失。所述出现和消失可保证癌症一全测试剂的相应改变或给受试者施用其它疗法。抗癌用途可以包括诱导受试者中靶向的癌症细胞死亡。靶向的细胞死亡的诱导可以体外或体内发生。耙向的细胞死亡的体外诱导可以是诊断方法或组合的i貪断和治疗方法的一部分。在整个动物受试者中，抗癌方法可以导致一个或多个胂瘤大小的减少，增加其它抗癌试剂起作用的时间，或破坏癌细胞，特别是少量细胞，如可能在手术后保留或形成用常规技术不能检测到的d、转移灶的那些细胞。即使通过一些治疗不能到达肺瘤，血液中的转移细胞可以一皮破坏，阻碍癌症未来的播散。因此，本发明的某些实施方案可以满足以下目的，并且提供以下优点仅仅采用受试者的血样构建受试者癌症的个体的、遗传性癌症语；利用个体的、遗传性癌症谱作为用于规定存在的癌症治疗的先驱；利用个体的、遗传性癌症谱来促进新的、个体化的、癌症细胞耙向治疗的发展。附图简述参照以下详述，结合附图，可以更好地理解本发明，所述附图举例说明了本发明的多种实施方案。图1举例说明了片全测癌症片全测试剂的方法。图2举例说明了各个癌症检测试剂和癌症类型之间的关联。图3举例说明了采用癌症检测试剂进行PCR缩减(PCRReduction)的方法。图4举例i兌明了血液测试和癌症i普分析的方法。详述本发明的实施方案涉及由具有相应于癌症相关突变的序列的短的分离核酸组成的癌症才全测试剂。癌症才企测试剂可以包括具有与突变mRNA的序列相同的序列和互补序列的核酸。但是，两条互补核酸链都不是本发明的所有方面所必须的。在一些方面，将仅仅使用互补核酸中的一个或另一个。用作每种应用的特异性癌症检测试剂的合适核酸链是本领域技术人员可以明确的。这些癌症检测试剂可以用于诊断转移性癌症，特别是基于病理学的诊断，包括最初的i貪断以及治疗和疾病进展监测，并且也包括监测革巴向的癌细力包死亡。采用私有软件和来自公共数据库的信息分离癌症检测试剂序列，所述数据库记录关于癌症和健康细胞和组织的遗传信息。具体地，采用私有软件和超级计算机，将来自癌细胞系的mRNA数据的随机部分与可以从所有健康细胞系获得的所有mRNA数据进行比较，如图l所图示。得到的数据库称作癌症检测试剂序列超集合(hyperset),其含有数十万种癌症检测试剂(长度是17聚体或更长)的序列，根据每种癌症类型分组为超集合。超集合中每种癌症检测试剂在相应于超集合的癌症类型的癌细胞系中至少发现一次。在超集合中存在冗余，因为癌症检测试剂序列出现在很多不同癌症类型的超集合中。总癌症超集合中的癌症检测试剂序列的总数可以增加。随着新癌症出现，可以产生新的癌症检测试剂。基于目前可以获得的数据，已知单个类型的癌症的超集合可以含有数万种癌症检测试剂。用于分离含有癌症4企测试剂的mRNA分子的细胞系来源于患有癌症的人受试者。因此，可以将这些细胞系计数为癌症检测试剂在人类中的过去的出现。这产生了用于将每种癌症检测试剂出现的可能性排序的简单方法，该方法基于其在癌细胞系中过去的出现率。癌症检测试剂通常是小的，因此，不适合基因组作图。但是，可以对含有未分离的癌症才全测试剂的mRNA分子作图。以此方式，可以确定哪些基因与每种癌症检测试剂相关。很多基因可以与每种癌症试剂相关-基因的数目通常与含有每种癌症检测试剂的独特mRNA分子的数目成正比。有时，数百种mRNA分子含有癌症检测试剂，产生4艮多作图的基因。这在表l中是明显的。表l列出了癌症才企测试剂和一些相关的癌症，以及一些其它相关信息，如PCR退火温度和基因/染色体定位信息。这些癌症检测试剂可能包括SNPs,-f旦也包括适于诊断和耙向的癌症细胞死亡用途的更长突变。尽管艮多癌症检测试剂序列位于没有目前已知的与癌症的相关性的基因中，一些检测试剂位于已知在癌症中重要的基因中。这些基因通常代表SNPs、隐匿剪接和其它遗传缺陷。癌症检测试剂可能对于很多基因和很多癌症是共有的。这并不表示每种癌症4全测试剂将存在于每种癌症细月包系或癌症受试者中。考虑到产生公共数据的方式，将预期癌症检测试剂和癌细胞系之间共有性的较多机会和一致性，或缺乏所述机会和一致性。预期每个癌症受试者具有含一个子集的癌症检测试剂的mRNA,其构成个体癌症谱，并且鉴定哪些基因可以在该个体中突变。但是，可能的是，采用足够大的受试者库，在不同受试者之间可能观察到相同的癌症谱，然而不能预期所述库中的每个受试者都具有相同的癌症傳。癌症中的个体化程度不是明确理解的。但是，个体性似乎与癌症类型相关，如图2所示。癌症检测试剂超集合可能构成癌症细胞专有的长度为17聚体或更长的所有mRNA分子。然后，每种癌症类型具有相应的癌症检测试剂超集合，并且每个癌症受试者具有癌症检测试剂子集，所述子集对于他们的个体癌症谱是同义的。由于表1显示了癌症检测试剂的超集合，人们不应该预期在单个癌症受试者发现所有这些癌症检测试剂，尽管这并不是不可能的。相反，表l的检测试剂或其组合可以用于产生特定受试者的癌症的癌症谱。通过引入大量癌症检测试剂，可以建立更完整的癌症谱。此外，关于受试者的mRNA中不存在哪些检测试剂序列的了解，对于诊断，包括预后，以及癌症进展和治疗监测是非常有用的。例如，它可以用于选择受试者的治疗。在各种实施方案中，可以用l种或更多、5种或更多、IO种或更多、20种或更多、50种或更多、IOO种或更多、500种或更多，或1000种或更多不同的癌症片企测试剂产生癌症i普。用于建立癌症i普的癌症冲全测试剂可以基于特定标准选择，例如癌症中出现的总体频率，或以前在特定癌症类型中的出现。癌症4全测试剂可以用于测试实际患者的肿瘤或血液组织。例如，可以用PCR、^微阵列或芯片4支术进^t测试。一旦发现癌症片全测试剂存在于患者中，可以选择那些试剂，用于治疗患者或指导治疗。基于PCR的样品分析提供了检测受试者癌症中癌症检测试剂存在的有力的和迅速的手段。采用基于癌症检测试剂的扩增引物的PCR分析使得能够用小量起始材料进行分析，并且使得能够同时检测多种癌症检测试剂。采用基于癌症检测试剂序列的单个PCR引物的线性PCR扩增使得能够进行基因表达水平的定量。传统PCR扩增位于5'和3，引物之间的一组核酸区域。由于采用5，和3，引物这两者，新建立的核酸链可以在下一轮中作为模板。所有引物和PCR条件在扩增时不是相同有效的，因此，一些引物相对于其它引物，以更高速度产生新模板。该效果与新链作为模板的能力组合，导致当使用不同的引物时，具有扩增序列的各个核酸链的数目具有显著差异。该差异与引物和PCR-条件效率而不是最初样品中可获得的模板链的实际数目相关。采用改进类型的PCR,在本文中称作"PCR缩减"，可以获得给定样品中含有不同癌症检测试剂序列的mRNA分子数目的更准确比4支。采用该方法，仅仅提供5，引物。这些引物能够与最初的模板核酸杂交，但不与作为PCR过程的一部分而产生的任何链杂交，因为所述链含有与5，引物相同而不是互补的序列。由于仅有最初的模板核酸可以作为PCR反应的模板，因此引物或PCR效率导致的不同癌症检测试剂序列拷贝数目的差异不是那么明显。拷贝数目与最初模板的实际数目具有紧密得多的关联。在PCR缩减中，直到聚合酶从模板链掉下时才发生聚合。这容易在5，引物后留下拖尾端(trailingend)。这些拖尾端某种程度上长度不同，但通常所有都在引物的几百个碱基对内终止。因此，通过在凝胶上电泳为单个、但略^^糊的条带，可以分辨所有PCR反应产物。PCR缩减方法的一个实例示于图3。尽管单独扩增癌症检测试剂可能在本发明的一些实施方案中是有用的，但在上文描述的PCR缩减技术中，拖尾端使得能够进行容易的基于凝胶的检测，而用单独的小的癌症检测试剂不能容易地实现所述检测。如果样品中不存在癌症检测试剂序列，则引物不具有沖莫板，并且在电泳后在预期的位置不出现条带。另一方面，如果存在癌症^f企测试剂序列，则存在模糊的条带。可以用常规技术分析该条带的强度，从而估计含有每种检测试剂序列的样品中的相对模板丰度。癌症组织样品和活检物通常来自单个肺瘤，即使当存在多个肺瘤时也是如此。在癌症的早期阶段，大多数癌细胞都是亲本胂瘤的子代，并且通常与肿瘤中的细胞具有相同的突变。但是，转移性癌细胞通常具有不同的突变。此外，转移性肿瘤即使最初是相似的，也遵循不同的发育途径，并且可能随时间积累不同的额外突变。最终，公知的是^f艮多癌症治疗导致癌细胞的进一步突变。因此，癌症较晚阶段中的癌细胞通常与早期阶段的那些不具有相同的突变。突变的变异在同一个体的转移性肿瘤中也是常见的。由于肿瘤倾向于具有个体突变，认为从单个肿瘤采集的受试者组织样品不太可能含有受试者癌症的所有癌症突变。因此，采用常规方法获得的受试者身体中所有或大多数突变的谱通常需要来自多个肿瘤的样品。相反，在本发明的实施方案中，采用血液作为样品，在单个样品中可以检测所有或大多数突变，因为血液含有来自多个胂瘤的细胞。此外，血样可能甚至含有来自用常规技术检测不到的小的转移性肿瘤的细胞。通常可以设计本发明的癌症4企测试剂，用于检测癌细月包而不是特定肿瘤所专有的突变。已经显示，癌症4企测试剂可以;险测在血液中循环的细胞中的癌症突变。因此，可以预期肿瘤组织样品和来自同一受试者的血样之间的PCR缩减测试可以显示血液中数目增加的突变。实际上，来自单独的组织样品的任何癌症谱都可能比不上血样，因为组织癌症语实ii际上是来自单个活检肿瘤，而不是受试者总体癌症的谱。癌症;f企测试剂代表了一类特殊的癌症突变_即具有癌细胞专有的核酸内容的突变。如果不存在所述专有性，则突变将不认为是癌症检测试剂，如图1所示。选择癌症检测试剂的该条件产生了在检测癌细胞遗传学差异中有用的试剂。没有所述差异，则很难或不可能耙向癌细胞同时避免健康细胞。这是用于诊断和治疗癌症的重要标准。可以用血样和本文描述的方法建立其它受试者的癌症谱。图4说明了一种所述示例性方法的步骤。在大多数情况下，可以在从受试者获得血样后几小时到几天内获得癌症谱。由于大多数癌症检测试剂与一组基因相关，人们可以迅速确定哪组基因在受试者的癌症中以癌细胞专有的方式突变。任何随后的治疗都可以利用该遗传信息进行特异性癌细胞靶向。遗憾的是，大多数现有疗法不具有该类輩巴向能力。因此，本发明的血液测试也可以是新疗法的先驱测试，所述疗法可以利用癌症4企测试剂进行特异性癌细胞靶向。在本发明的非限制性实施方案中，癌症检测试剂可以是反义寡核苷酸序列。该反义序列可以与癌细胞的转录组中一个或几个基因的5，非翻译序列、3，非翻译序列或编码序列的至少一部分互补。相应于癌症检测试剂的寡核苷酸序列可以有足够的长度，以便与靶细胞特异性相互作用(杂交)，但不是长到寡核苷酸不能区分单碱基差异。例如，为了得到特异性，寡核苷酸的长度可以是至少6个核苷酸。也可以使用更长的序列。在特定实施方案中，癌症才企测试剂的长度可以是17个核苷酸。序列的最大长度将依赖于其杂交特异性的保持，这又依赖于试剂的G-C含量、解链温度(Tm)和其它因素，并且可以通过计算或实验，例如，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",VolumeI,Ausubeletal.,eds.JohnWiley:NewYorkNY,pp.2.10.1-2.10.16，首先在1989出版，但每年更新)中所述的用于检测核酸分子杂交的严格条件，或通过利用免费软件如Osprey(NucleicAcidsResearch32(17):el33)或EMBOSS(http:〃www.uk.embnet.org/Software/EMBOSS)而容易地确定。本发明的实施方案提供了在受试者中诊断癌症，所述受试者包括但不限于人、家养宠物，包括但不限于猫、狗、仓鼠等、运动和畜牧动物，包括但不限于马、牛、羊等。本发明的实施方案进一步提供了将癌症检测试剂用于来源于分离的细胞或分离自需要进行疾病状态诊断分析的受试者的样品的材料中。本发明的其它实施方案包括将癌症检测试剂用于完整细胞或组织，以进行原位4全测和诊断。采用寡核苷酸探针在原位条件下进行特定基因表达的检测是本领域公知的。经典地，寡核苷酸探针用修饰的核香酸进行了5，或3，末端标记，或3，加尾，所述修饰的核苦酸连接了"标记"，所述标记可以在探针与其靶杂交后被检测到。采用末端标记，将单个修饰ddNTP(其掺入了标记)酶促添加到分子的5，或3，末端，或在探针合成过程中添加。3，加尾涉及用酶，即末端转移酶(TdT)添加尾(依赖于使用的方法，平均长度为5-50个核苷酸的修饰的dNTPs)。另一方面，已经将一些非放射性标记成功用于原位杂交，所述标记包括生物素、地高辛和地高辛配基(DIG)、碱性磷酸酶和荧光标记、荧光素(FITC)、德克萨斯红和罗丹明。本发明包括所有上述探针标记和通过原位杂交进行检测的方法。癌症检测试剂可以是DNA或RNA分子，或其任何修饰或组合。癌症检测试剂可以包含除了磷酸二酯键之外的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸二曱酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯或磷酸酯键，导致稳定性增加。也可以通过在合成过程中将3，-脱氧胸苷或2，-取代的核苷酸(用例如烷基取代)掺入寡核苷酸，或通过提供作为苯基异脲衍生物的寡核苷酸，或通过将其它分子，如氨基吖啶或聚赖氨酸连接于寡核苷酸的3，末端，而增加寡核苷酸稳定性。包含本发明的癌症检测试剂的RNA和/或DNA核苦酸的修饰也可以存在于整个寡核苦酸中或存在于寡核苦酸的选定区域中，例如5，和/或3'末端。可以通过本领域已知的任何方法，包括标准化学合成、组成寡核苷酸的连接和编码寡核苷酸的DNA的转录，来制备癌症纟企测试剂。本发明在一个实施方案中提供了生物组织的筛选，所述生物组织将要从一个动物物种的成员转移到另一个成员，包括但不限于从一个人受试者到另一个人受试者。所述生物组织的非限制性实例包括血液、血浆、皮肤、骨髓和主要器官，如心脏、肝、肺、肾等。一些实施方案提供了在转移到另一个体前，测试血液或组织样品中恶性细胞的存在。目前，在输血或移植前在生物材料上进行了;f艮多测试。进行这些测试以确保不含病原体的材料和/或组织相容性。目前还没有充分关注供体组织是否含有具有恶性潜能的细胞，或来自未检测的癌症的明显恶性的细胞。普遍意见是来自患有癌症的供体的恶性细胞由于移植物排斥而不会导致疾病转移到受体。最近对该概念进行了质疑，并且越来越多的证据表明恶性肺瘤在个体间转移(DingliandNowak,2006Nature433:35-36和其中引用的参考文献)。通过使用免疫抑制药物与器官移植的组合，也增强了转移的可能性。因此，需要测试生物材料的恶性潜能。恶性细胞存在的测试受到缺乏迅速和可靠的篩选的限制，所述筛选同时测试多个标记物的存在，并且可以用小量测试材料进行。本发明的实施方案提供了在血液或其它组织或器官样品中测试小量恶性细胞存在的途径。候选供体材料的测试可以通过本领域已知的一些方法中的任意一种方法进行，其非限制性实例描述于上文的章节中。利用本发明的癌症检测试剂来确定供体材料是否含有恶性细胞的方法包括但不限于诸如PCR、微阵列分析、原位杂交等方法。在特定实施方案中，可以用测试来筛选血库中的血液。本发明的癌症检测试剂可以用于多种抗癌用途，其中它们杀死癌细胞，谦导身体杀死癌细胞，或抑制癌细胞生长。通过癌症检测试剂、彼此的组合，或与其它疗法的组合，可以实现这些效果。例如，可以用癌症4企测试剂以多种方式i秀导癌细l包的革巴向的细月包死亡。首先，如果它们与已知的或后来开发的关于存在的癌症治疗或新癌症治疗，如化疗或放疗的信息相关，则它们可以用于指导这些治疗中的哪一些可以用于受试者。但是，本发明的检测试剂也可以用于开发靶向检测试剂核酸序列或它们编码的肽的新试剂。这些新试剂可以用于诱导把向的癌细胞死亡。由于本发明的癌症检测试剂不存在于健康细胞转录组中，它们代表用于诱导癌细胞死亡的癌症特异性靶。例如，尽管一些癌症片企测试剂可以翻译为主要位于细月包内的肽，一些包埋在通常编码细胞外或膜蛋白的序列中。所述序列是本领域公知的，并且认为预测蛋白及其部分的可能的细胞定位。因此，特别对于具有细胞外区域的蛋白，预期施用癌症检测试剂编码的肽的特异性抗体会谦导细胞死亡。由于仅仅癌细胞具有这些肽，仅仅癌细胞一皮抗体把向和杀死。与本发明结合使用的抗体可以包括单克隆抗体和多克隆抗体，非人、人和人源化抗体，及其任何功能性片段。除了基于蛋白的治疗，本发明的癌症检测试剂序列提供了基于mRNA或基于其它核酸的干预的特别有前景的耙。由于癌症检测试剂是14通过与健康细胞的转录组比较而分离的，基于mRNA的治疗应该对健康细胞没有影响，因为它们将缺乏任何受到治疗影响的mRNA。具体地，可以用核酸，包括癌症检测试剂序列实现基于mRNA的治疗。公知的是，当mRNA被细胞内的互补核酸结合时，随后各种细胞机制可以防止该mRNA转录为蛋白。这些机制中的一些，如基于反义的机制，似乎依赖于互补链与mRNA的重复结合。其它机制，如siRNA或RNAi,似乎诱导多得多的长期持续改变，这些改变将防止甚至从未改变的、单链形式翻译为被耙向的mRNA。在本发明的特定实施方案中，通过癌细胞中质粒DNA的转录而产生siRNA。采用选定的癌症4全测试剂，可以建立质粒，以允许该转录活性。存在于受试者的癌症谱中的针对一些癌症检测试剂的质粒集合也可以建立。建立质粒后，它们可以放置在适于送递到癌细胞的转染培养基中。已知一些细胞将摄取并表达棵质粒。但是，也可以采用送递载体，如脂质体或缺失的病毒载体。由于预期质粒对正常健康细胞没有影响，不需要靶向的送递。在本发明的一些实施方案中，可能包括增加送递载体的有效性，例如，通过增加其扩散到组织中而增加所述有效性的额外试剂。配制用于送递的质粒随后可以在来自癌症受试者的血液中测试。适当地起作用的质粒应该以輩巴向的方式杀死血液中的癌细胞。通过分析血液中的mRNA,可以容易地-险证该活性(在足够的时间段后，以允许在死亡之前，降解已经在癌细月包中产生的mRNA，通常l小时内)。可以通过肉眼和其它分析-睑证对正常细胞破坏的缺乏。在动物^t型，如灵长类动物中测试，也可以证实健康细胞不受质粒影响。质粒标记物或癌症检测试剂本身可能有助于证实体内细胞摄取和/或转录。然后，可以通过药学可接受的方式配制选择用于送递给受试者中的癌细胞的质粒，并且施用于受试者。所述施用可以包括注射到肺瘤中或注射到血流中。送递方法可以受到癌症类型和位置，以及受试者的其它需要和质粒试剂的制剂的影响。尽管单个癌症检测试剂可以用于在本发明的诱导癌细胞死亡的方法中耙向多种基因或基因产物，在一些实施方案中，可以靶向多种癌症检测试剂，以产生强效。如果给具有多个肺瘤的受试者施用，耙向一种以上癌症检测试剂的组合试剂也可以是特别有用的。受试者的肺瘤可能已经分化，使得每个肿瘤不包含任何一种癌症检测试剂序列。掺入耙向多种癌症检测试剂序列的试剂可以使得这些分化的癌细胞能够被更有效杀死。所述组合的方法对于用常规方法可能不能检测的新或小胂瘤可能是特别有用的，但当本发明的诊断方法用于建立癌症谱时含有可检测的癌症4企测试剂。因此，根据三步法，可以用本发明的选定的方法实现靶向的癌细胞死亡。首先，可以给受试者建立癌症谱。其次，可以建立靶向的癌细胞死亡试剂，并且在受试者血液或其它组织样品上测试。第三，可以给受试者施用该试剂，导致该受试者中癌细胞的耙向的死亡。该方法可以在少至3周中实现。持续监测可以允许检测受试者中任何癌症检测试剂的消失，以及任何新癌症检测试剂的出现。因此，可以随后改变给受试者施用的药剂或药剂组合。表l包括癌症4企测试剂序列。癌症4企测试剂也可以具有与表1中的序列互补的序列。表1中列出的癌症检测序列代表反向互补链。基于癌症中的总体出现或基因中的出现率选择表1中列出的序列。出现率("In.")表明序列位于各个癌症中的次数。每个序列与一个标识符相关，所述标识符相应于发现所述序列的至少一种癌症类型。对于一些序列，也指出了其它癌症类型、基因或染色体，以及分离出所述癌症检测试剂的文库。对于一些序列，也包括了预测的解链温度(Tm)。表1-癌症检测序列SEQ.ID.NO.序列TACGGGTGACTGTGCCAT19AAATGCATCAAAGTTGC17GCAGGTCAGTTCCACCA17TGTGATGAGCTGTCTCA17In.标识符和U癌症][基因(染色体)][文库]}Tm卯巢—68295_4635{[乳^][未^][+NIH_MGC—87}([卵巢][未知][+NIH_MGC—66]}{[卩巢][未知][+NIH_MGC—9]}{[结肠/直肠][未知][+NIH_MGC—65]}{[肺][未知][+NIH—MGC—68]}{[肺][未知][+NIH—MGC_18]}{[^][未5口〗[+NIH—MGC—69]}{[宫颈][未知][+NIH_MGC_12}{[脑][未知][+NIH—MGC—19}{[脑][未知][+NIH一MGC一47]){[脑][未;][+56NIH_MGC_96]}{[皮肤][未知][+NIH_MGC_20]}{[淋巴][未知][+NIH—MGC_85]}{[睾丸][未知][+NIH—MGC—92]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[神经胶^瘤][泉知][+NCI—CGAP—Brn67]}{[细胞瘤][未知][+NIH_MGC—98]}([肉瘤][l知][+NIH_MGC_71}{[月f瘤][未知][+NIH_MGC_88]}肺」40950一11879乳腺—128252—11961{pl^"[NSPCl(2)~][+NIH_MGC_87]}{[卵巢][GAPD(12)][+NIH_MGC—66]}{[卯巢][GAPD(12)LOC389849(X)][NIH_MGC—66]}{[卵巢][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_109]}{[结肠/直肠][GAPD(12)LOC389849(X)〗[十NIH_MGC—15]}{[前歹'J腺][GAPD(12)][+NIH_MGC_40]}{[月亩][GAPD(12)LOC389849(X)[十NCI—CGAP_Brn64]}{[月运〗[GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—19]}{[月亩][GAPD(12)][+NIH=MGC=47]}54U月卤][GAPD(12)LOC389849(X)][NIH—MGC—47]}{[肾上腺][GAPD(12)~][+NIH—MGC—84]}{[皮肤]〖GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH—MGC_72]}{[皮肤][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_20〗}{[肌肉][未知][+NIH—MGC—17]}{[月台盘][GAPD(12)][+NIH—MGC_21]}{[肝][GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH_MGC—卯〗}{[肝][GAPD(12)][+NIH_MGC—100}{[肉瘤[GAPD(12)][+NCI—CGAP_Alvl]}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC—46]}肺_97380一1525{结S/直肠][K-ALPHA-1(12)][+NIH_MGC_15]}{[前列腺I[未知][+50NIH—MGC_60]}"][未知][+NIH_MGC_7]}{[宫颈][^"知〗[+NIH—MGC_12]}([皮肤][lGTTGTTAGGATCCAGTC16TGTTAGATCAGTCCAGA16ACTCCTATAGGAACTTG15知][+NIH_MGC—62]}{皮肤[未知][+NIH—MGC_20]}{[皮肤][l知][+NIH_MGC—49]}{[肾][未知][+NIH_MGC_14]}{[胰腺][K-ALPHA-1(12)]+NIH一MGC一l10]}{[胰腺][未知][+NIH—MGC_39〗}{[胰^][瓜知][+NIH—MGC—70]}{[肌肉[未知][+NIH—MGC_17]}{[淋巴][知][+NIH_MGC_8]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[神经胶^瘤][未知][+NCI_CGAP—Brn67]}{[肉瘤][未知][+NIH_MGC_46]}([i上腺样瘤][未知][十NIH_MGC_89I}乳腺_128723_13168{[乳森][未知][+NIH—MGC_87I}([卵巢][未知[+NIH_MGC_66〗}{卩巢][未知][+NIH_MGC_9]}{[前列腺][未知][+NIH_MGC_60]}{[肺][未知][+NIH—MGC—18]}{[肾111腺]["^知][+NIH_MGC—84]}{[月几^][^知][+NIH—MGC—17]}{[巴][未知][+NIH_MGC_85]}{[骨/骨髓][未知][+NIH_MGC_86]}{[睾丸][未知][+NIH_MGC_92}{[月台盘][未知][+NIH_MGC_21]}{[肝][未知][+NIH_MGC_%]}{[目艮][未知][+NIH_MGC_67}([神经l交质瘤][未知][十NCI_c5AP_Brn67]}([肉瘤][未知〗[+NIH—MGC—71]}{[乳头状瘤][未知][+NIH—MGC一93D肺—114200—11255{[乳腺][未知][+NIH—MGC—87]}{[卵巢]^1^32363(5)][+NIH—MGC—9]}U肺][未知][+NIH_MGC_68}{[$][A知][+NIH_MGC_7]}{[^"][;4知][+NIH_MGC_18]}{[宫颈][^^知][+NIH—MGC—12]}([皮i][未知][+NIH—MGC—72]}{[胰威][未知][+NIH—MGC—39]}{[肌肉][l知][+NIH—MGC_17]}{[淋巴][未知][+NIH—MGC_85]}{[睾丸][未知][+NIH—MGC—92]}{[胎盘][未知〗[+NIH_MGC—21]}{[肝][未知][+NIH—MGC—90]}{[眼][未知][+NIH—MGC—67]}{[眼]未^〗[+NIH_MGC—16]}{[乳f状瘤][▲知][+NIH_MGC_93]}肺—116399_15887{[乳腺][未_知][+NIH—MGC_87]}{[卵巢[未知1[+NIH—MGC—9]}{[结^/直肠][未知][+NIH—MGC—15]}{[结肠/直肠][未知][+NIH—MGC_65]}{[肺1[未知][+NIH—MGC—68〗}{[肺][未知][+NIH—MGC—7]}{[脑][未^][+Nffl—MGC—19]}{[肾][未知]〖+NIH—MGC—14]}{[胰腺[;^知][+MH_MGC_39]}{[肌1^1[&知][+NIH—MGC—17]}U^巴][未知]+NIH_MGC_85]}{[骨/骨髓][未知][+NIH—MGC_86〗}{[肉瘤〗[未知][+NIH—MGC_46]}{[肾上腺样瘤][未知][+NIH—MGC—89}{[肿瘤][未知〗[+NIH—MGC—88]}ATCACGCCAACAGTTTC15CAGGTCTCCCGTTTCTGCTCCCCAAAGGAACATCCAGGAGATAACCGGTGGCATACGGATGTCCCTGCTGGGTACCAGTCGCAGGTTCAGC1515151414AACACCCAGCCTCGTAC13ACCCAGCCTCGTACCTA13淋巴—50077—1076{[l〖腺][GAPD(12)~][+NIH—MGC_87]}{[肺][GAPD(12)LOC389849(X)][十NIH_MGC_7]}U宫颈][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH—MGC—12]}{[月运][GAPD(12)LOC38^849(X~〗[+NIH_MGC_19]}{[月亩][GAPD(12)~][+NIH_MGC-47]}{[月亩][未知][+NCI—CGAP—Brn64]}{[子宫][GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—44]}{[皮肤][未知][+NIH—MGC_20]}{[A肤][GAPD(12)50LOC389849(X)~][+NIH—MGC_49]}{[淋巴][未知][十NIH_MGC—8]}([淋"^][GAPD(12)LOC389849(X)~][+NIH_MGC_85]}{[月台盘〗[GAPD(12)LOC389849(X)][+NIH—MGC—21]}{[细胞瘤][未知][+NIH—MGC_98]}{[肉瘤][GAPD(12)][+NIH_MGC_71〗}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(X)~][NIH_MGC—71]}{[肉瘤][GAPD(12)LOC389849(XH[+NIH—MGC—46]}淋巴一69924—10602肺_151195一32065卵巢_83345—32595{[乳腺][RPL8(8)][+NIH_MGC_87]}{[卵巢][未知][+NIH_MGC_66]}{[肺][111^8(8)][+NIH—MGC_7]}{[肺][^知][+NIH_MGC_68]}U威][RPL8(8)~][+NIH_MGC_18]}{[宫颈][RPL8(8)~][+NIH—MGC—12]}{[皮肤][111^(8)~][+NIH—MGC—20]}([胰腺][未知][+NIH_MGC_39]}{[肌肉][RPL8(8)~][+54NIH_MGC_17]}{[淋巴][RPL8(8)~][+NI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的普通技术人员可以理解，并且具有本公开内容的优点。本公开内容描写和描述的实施方案仅仅是举例，并且不是公开内容范围的穷举。权利要求1.给患有癌症或怀疑患有癌症的受试者建立癌症谱的方法，包括从来自所述受试者的组织样品分离mRNA；在mRNA中筛选至少一种癌症检测试剂，以确定mRNA中存在或缺乏所述癌症检测试剂，所述癌症检测试剂选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合；和将筛选结果整理在癌症谱中，所述癌症谱表明mRNA中存在或缺乏每种测试的癌症检测试剂。2.权利要求l的方法，其中所述组织样品包括外周血。3.权利要求1的方法，进一步包括在mRNA中筛选至少两种癌症检测试剂，所述癌症检测试剂选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合。4.权利要求1的方法，进一步包括在mRNA中篩选至少IO种癌症检测试剂核酸序列，所述癌症检测试剂核酸序列选自表1的任何寡核普酸及其任意组合。5.权利要求l的方法，进一步包括在mRNA中筛选至少20种癌症检测试剂核酸序列，所述癌症检测试剂核酸序列选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合。6.权利要求1的方法，进一步包括在mRNA中筛选至少50种癌症检测试剂核酸序列，所述癌症检测试剂核酸序列选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合。7.权利要求1的方法，进一步包括在mRNA中筛选至少100种癌症检测试剂核酸序列，所述癌症检测试剂核酸序列选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合。8.诱导癌细胞中靶向的癌细胞死亡的方法，包括给癌细胞施用至少一种革巴向于癌症4企测试剂核酸序列编码的肽的抗体，所述癌症一企测试剂核酸序列选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合。9.权利要求8的方法，进一步包括给位于人受试者中的癌细胞施用抗体。10.权利要求8的方法，进一步包括施用至少两种抗体。11.权利要求8的方法，其中该抗体包括单克隆抗体。12.权利要求8的方法，其中该抗体包括多克隆抗体。13.诱导癌细胞中耙向的癌细胞死亡的方法，包括给癌细胞施用至少一种包括癌症4企测试剂的siRNA分子，所述癌症检测试剂选自表1的任何寡核苷酸及其任意组合，其中施用所述siRNA分子导致含有癌症检测试剂的细胞mRNA的破坏。14.权利要求13的方法，进一步包括给人受试者中的癌细胞施用siRNA分子。15.权利要求13的方法，进一步包括给癌细胞施用质粒，所述质粒编码siRNA分子并且可操作从而在癌细胞中产生siRNA分子。16.权利要求15的方法，进一步包括在送递载体中施用质粒。17.权利要求16的方法，其中所述送递载体包括脂质体。18.癌症检测试剂集合，包含至少两种表1的任何寡核香酸。19.癌症检测试剂集合，包含至少5种表1的任何寡核苷酸。20.癌症检测试剂集合，包含至少10种表1的任何寡核苷酸。21.癌症检测试剂集合，包含至少20种表1的任何寡核香酸。22.癌症检测试剂集合，包含至少50种表1的任何寡核苷酸。23.癌症检测试剂集合，包含至少IOO种表1的任何寡核苷酸。24.;险测样品中的癌症片企测试剂的方法，包4舌使样品与癌症检测试剂接触；并且确定样品中是否存在含有癌症检测试剂的核酸。25.权利要求24的方法，其中用癌症检测试剂的单个引物在样品上进行PCR，以产生PCR产物；并且分析PCR产物，以确定样品中是否存在PCR扩增的、含有癌症检测试剂的核酸。26.权利要求25的方法，其中所述引物包括5，引物。27.权利要求24的方法，其中所述样品包括cDNA。28.权利要求27的方法，进一步包括来源于血液或组织样品的cDNA。29.权利要求25的方法，其中所述分析进一步包括PCR产物的基于大小的电泳分离。30.权利要求25的方法，其中PCR产物包括具有多种长度的多个扩增的DNA分子，每个所述分子都含有引物。全文摘要通过比较癌症mRNAs与健康细胞的转录组，鉴定了癌症检测试剂。这些癌症检测试剂可以用于多种目的，包括癌细胞的诊断和靶向破坏。在诊断应用中，可以分析受试者的外周血或其它组织样品，以建立该受试者的癌症谱。随后可以用该谱指导用已知药剂进行治疗。它也可以用于产生能够以靶向方式杀死受试者的癌细胞的药剂。这些药剂可以包括抗体和siRNA、RNAi或反义RNA。文档编号C12Q1/68GK101448959SQ200780018777公开日2009年6月3日申请日期2007年3月23日优先权日2006年3月23日发明者D·A·诺尔思申请人:天空遗传学公司