专利名称：：制备l-甲硫氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及高效制备L-甲硫氨酸的微生物和方法。具体地，本发明所涉及的方法中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的。
背景技术：
：当前，全世界甲硫氨酸的年产量是大约500,000吨。甲硫氨酸是禽类家畜词养的首要限制性氨基酸，且因此主要作为饲料补充物而使用。与其他工业氨基酸不同的是，甲硫氨酸几乎完全以化学合成产生的D-和L-甲硫氨酸的外消旋物而使用。由于动物能够代谢甲硫氨酸的两种立体异构体，因此直接饲喂化学方法产生的外消旋混合物是可行的(D'MelloandLewis,EffectofNutritionDeficienciesinAnimals:AminoAcids,Rechgigl(Ed.),CRCHandbookSeriesinNutritionandFood,441-490，1978)。不过，仍然需要以仅产生L-甲硫氨酸的生物技术方法来替代现有的化学生产方法。这是因为低水平补充的L-甲硫氨酸相对于D-甲硫氨酸而言是更好的含硫氨基酸来源(KatzandBaker(1975)Poult.Sci.545:1667-74)。此外，化学方法使用更加危险的化合物且产生大量废液。而高效的生物技术方法可完全避免化学生产的这些缺点。对于其他氨基酸例如谷氨酸，已知可采用发酵方法进行制备。为此，己经证实某些微生物非常适合，如大肠杆菌(Esc/7en'c/H'aco/!')和谷氨酸棒杆菌(Coo^e6ac&Wwwg/wtom/cwm)。通过发酵产生氨基酸还有一个特别的优势，即仅产生L-氨基酸。此外也避免了使用对环境不利的化合物如溶剂等。不过，通过微生物发酵生产甲硫氨酸若要成为化学合成方法的替代方法，其必须满足能够以与化学方法生产相当的成本实现商业规模生产甲硫氨酸的要求。因此，生产L-甲硫氨酸需要通过大规模培养为大量产生并分泌该分子而开发的细菌。方法的改进可涉及发酵措施如搅拌和补充氧气，或营养培养基的组成如发酵过程中糖的浓度，或产物的处理如通过离子交换层析，7或微生物本身的内在产量特性。可采用诱变和突变体选择的方法来改进微生物的产量特性。以此方式可获得对抗代谢物具有抗性的高产菌株或是具有重要调节作用的代谢物的营养缺陷型高产菌株。一些年来也采用重组DNA技术通过扩增个别的氨基酸生物合成基因并研究其对氨基酸产量的作用而改进产生L-氨基酸的微生物菌株。Riickertetal.((2003)JournalofBiotechnology104:213-228)分析了谷氨酸棒杆菌中的L-甲硫氨酸生物合成途径。MetZ(也称为MetY)和MetB的已知功能得到了确认，而MetC(也称为AecD)被证实是胱硫醚-卩-裂合酶。此外，该研究还鉴定了MetE和MetH，它们催化将L-同型半胱氨酸转化为L-甲硫氨酸。WO02/097096使用了来自棒状细菌的编码McbR阻抑物基因(也称为MetD)的核苷酸序列以及使用其中该McbR阻抑物基因被弱化的细菌来制备氨基酸的方法。根据WO02/097096，转录调节物McbR的弱化提高了棒状细菌中L-甲硫氨酸的产量。WO02/097096还披露，除了弱化McbR阻抑物基因以外，增强或过表达编码胱硫醚-y-合酶的MetB基因对制备L-甲硫氨酸是优选的。筛选为生产特定分子而改进的菌株是好使且困难的过程。因此，仍然亟需能够高效产生L-甲硫氨酸和/或L-甲硫氨酸含量显著提高的可用于获得甲硫氨酸化合物的微生物。
发明内容本发明的一个目的是提供在微生物中高效生产L-甲硫氨酸的方法。本发明的另一个目的是提供高效生产L-甲硫氨酸的微生物。本发明的这些目的以及从说明书中可明了的其他目的可通过独立权利要求的技术方案而实现。本发明的其他实施方式由从属权利要求定义。根据本发明的一个方面，提供了在微生物中制备L-甲硫氨酸的方法，其中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的。通过将微生物培养在富含丝氨酸的培养基中可增加微生物可利用的丝氨酸的量。8也可通过对微生物进行遗传学修饰而增加可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量。因此，在本发明的一个实施方式中，提供了在微生物中制备L-甲硫氨酸的方法，其中所述微生物在富含丝氨酸的培养基中培养。在本发明的另一个实施方式中，提供了一种方法，其中所述微生物在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面被遗传学修饰。在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面对微生物进行修饰可包括提高一或多种参与丝氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性、降低一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性、提高一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性和/或降低一或多种参与丝氨酸自细胞中输出的蛋白质的含量和/或生物学活性。根据本发明的方法的另一个实施方式，所述参与丝氨酸合成的酶选自D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)。根据本发明的另一个优选的实施方式，所述参与丝氨酸合成的酶被修饰以降低或防止L-丝氨酸的反馈抑制。根据本发明的方法的另一个实施方式，所述一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。优选地，所述编码参与丝氨酸降解的酶的基因被破坏，且最优选地，所述基因被消除。所述参与丝氨酸降解的酶优选地是sdaA。根据本发明的方法的另一个实施方式，一或多种参与丝氨酸输出的蛋白质的含量和/或生物学活性与野生型生物体相比是降低的，优选地，所述编码所述参与丝氨酸输出的蛋白质的基因被破坏，且最优选地，所述基因被消除。所述参与丝氨酸输出的蛋白质优选地是ThrE。根据本发明的方法的再一个实施方式，一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。所述参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶优选地选自丝氨酸羟甲基转移酶和亚甲基四氢叶酸还原酶。在本发明的优选的实施方式中，除了通过在富含丝氨酸的培养基中培养所述微生物而增加可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量和/或在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面对微生物进行遗传学修饰以外，一或多9种参与甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型生物体相比是升高的。优选地，所述参与甲硫氨酸合成的酶选自高丝氨酸-o-乙酰转移酶(MetA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(O-acetylhomoserinesulfhydrolase)(MetZ)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(cob(I)alamindependentmethioninesynthaseI)(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(cob(I)alaminindependentmethioninesynthaseII)(MetE)、天冬氨酸激酶(lysC)和高丝氨酸脱氢酶(hom)。在本发明的方法的另一个实施方式中，除了通过在富含丝氨酸的培养基中培养所述微生物而增加可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量和/或在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面对微生物进行遗传学修饰以外，一或多种转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性与野生型生物体相比是降低的。优选地，所述转录调节物蛋白是MbcR，其如果存在，可阻抑编码用于合成甲硫氨酸的酶的核酸序列的转录。根据本发明的方法的另一个实施方式，所述微生物选自棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌科、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌和假单胞菌。根据本发明的方法的另一个实施方式，所需的L-甲硫氨酸于培养基或所述微生物的细胞中浓縮。在本发明的另一个方面，提供了从发酵肉汤制备含L-甲硫氨酸的动物词料添加剂的方法，其包括以下步骤-在一方法中使用微生物制备L-甲硫氨酸，所述方法中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的；-自含L-甲硫氨酸的发酵肉汤中除去水；-除去发酵过程中形成的生物量的0至100wt,%，如10-90wt,%、或20-80wt,%、或30-70wt,0/。、或40-60wt,0/。、或约50wt,o/o;禾口-干燥所述发酵肉汤以获得粉状或颗粒状的动物饲料添加剂。在本发明的另一个实施方式中，提供了超量产生L-甲硫氨酸的微生物，其中-一或多种参与丝氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；和/或10-一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的；和/或-一或多种参与丝氨酸输出的蛋白质的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的；和域-一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；且其中-一或多种参与甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多种转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。此外，本发明的另一个方面涉及微生物在生产L-甲硫氨酸中的用途，所述微生物经遗传学修饰后其中丝氨酸的量是升高的，且所述微生物在甲硫氨酸合成方面是遗传学修饰的。图la是微生物如谷氨酸棒杆菌中L-丝氨酸生物合成途径的模型。参与丝氨酸合成的酶为SerA(D-3-磷酸甘油酸脱氢酶)、SerB(磷酸丝氨酸磷酸酶)和SerC(磷酸丝氨酸氨基转移酶)。参与丝氨酸降解的酶为sdaA(丝氨酸脱水酶)。丝氨酸经glyA-shmt(丝氨酸羟甲基转移酶)的活性被转化为甲基供体亚甲基四氢叶酸，该酶催化将亚甲基转移至四氢叶酸。该反应产生的副产品是甘氨酸。图lb是微生物如谷氨酸棒杆菌中L-甲硫氨酸生物合成途径的模型。参与的酶是MetA(高丝氨酸转乙酰酶)、MetB(胱硫醚^-合酶)、MetZ(0-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶)、MetC(胱硫醚-P-裂合酶)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)。具体实施方式详述在详细描述本发明的示例性实施方式之前，先给出以下定义。术语"甲硫氨酸合成效率"描述的是甲硫氨酸的碳产率(carbonyieldofmethionine)。这种效率以碳底物形式进入系统的能量输入的百分比进行计算。除非另有说明，否则在本发明中，该值以百分数表示((甲硫氨酸摩尔数)(碳底物摩尔数)-1x100)。术语"丝氨酸合成效率"描述的是丝氨酸的碳产率。这种效率以碳底物形式迸入系统的能量输入的百分比进行计算。除非另有说明，否则在本发明中，该值以百分数表示((丝氨酸摩尔数)(碳底物摩尔数)"x100)。本发明的优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。例如，选自如下一组的糖可作为特别优选的碳源葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。术语"提高的甲硫氨酸合成效率"涉及培养在富含丝氨酸的培养基中和/或经遗传学修饰且具有更高甲硫氨酸合成效率的微生物与培养在标准条件下的野生型生物体之间的比较。术语"甲硫氨酸的产率"描述的是按照每单位重量细胞量所获得的甲硫氨酸的量而计算出的甲硫氨酸的产率。术语"丝氨酸的产率"描述的是按照每单位重量细胞量所获得的丝氨酸的量而计算出的丝氨酸的产率。术语"甲硫氨酸途径"是本领域所熟知的，其描述的是发生在野生型生物体中并导致生物合成甲硫氨酸的一系列反应。该途径在不同生物体之间可有变化。有关生物体特异性途径的详情可参考教科书和以下网页所列科技文献http:〃www.genome.ip/hegg/metabolism.html。具体地，甲硫氨酸途径在本发明中的意义见图lb。术语"丝氨酸途径"是本领域所熟知的，其描述的是发生在野生型生物体中并导致生物合成丝氨酸的一系列反应。该途径在不同生物体之间可有变化。有关生物体特异性途径的详情可参考教科书和以下网页所列科技文献http:〃www.genome.i。。具体地，丝氨酸途径在本发明中的意义见图la。术语"生物体"或"微生物"在本发明中指的是通常用于生产氨基酸如甲硫氨酸的任何生物体。具体地，术语"生物体"指的是原核细胞、低等真核细胞和植物。一组优选的上述生物体包括放线菌、蓝细菌、蛋白菌、橙色绿曲菌(C/2/orayZe;owawra""acw力、小塔螺属物种1(i^e//"/"/)、嗜盐菌和/或甲烷球菌，优选地是棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌和/或假单胞菌。特别优选的微生物选自谷氨酸棒杆菌、大12肠杆菌、芽孢杆菌属微生物特别是枯草芽孢杆菌05a"7/wM^/to)、和链霉菌属微生物。本发明的生物体也可包括酵母，例如粟酒裂殖酵母(5t/n,zosacc/Mro77^cespom6e)、酉良酒酵母(iSacc/7aramycescerev/w'ae)禾口巴斯德毕赤氏酵母(尸z'c/H'a;aston》。术语"超量产生L-甲硫氨酸的微生物"在本发明中指的是一种微生物，其与培养在标准条件下的野生型微生物相比，产生甲硫氨酸的效率和/或产率和/或量升高至少50%、至少70%、80%或90%、至少100%、至少200%、至少300°/。、400%或500%、至少600%、至少700%或800%、至少900%或至少1000%或更高。优选地，所述微生物选自棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌科、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌和假单胞菌。更优选地，所述微生物是大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌。最优选地，所述微生物是谷氨酸棒杆菌。术语"野生型生物体"或"野生型微生物"涉及未被遗传学修饰的生物体。术语"代谢物"指的是在生物体代谢途径中用作前体、中间物和/或终产物的化合物。此类代谢物不仅可作为化学构建单元，还可对酶或其代谢活性发挥调节活性。从文献可知，此类代谢物可抑制或刺激酶的活性(Stryer，Biochemistry(2002)W.H.Freeman&Company,NewYork,NewYork)。在本发明中，术语"外代谢物(extemalmetabolite)"包括底物例如葡萄糖、硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、氨、氧氧气、丝氨酸等等。在某些实施方式中，(外)代谢物包含所谓的Cl-代谢物类。该类代谢物可起到甲基供体的作用，其包括例如甲酸、甲醛、甲醇、甲硫醇、二甲基二硫化物等化合物。术语"产物"包括甲硫氨酸、生物量、co2、等等。氨基酸包含所有蛋白质的基本结构单元，因此对于生物体内正常的细胞功能是必需的。术语"氨基酸"是本领域已知的。蛋白源氨基酸(proteinogenicaminoacid)有20种，它们是蛋白质的结构单元，在蛋白质中通过肽键相连接，而非蛋白源氨基酸正常情况下不存在于蛋白质中(见Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,Vol.A2,pages57-97，VCH,Weinheim(1985))。氨基酸可以是D-或L-光学构型的，不过L-氨基酸通常是天然存在的蛋白质中的唯一类型。20种蛋白源氨基酸在原核细胞和真核细胞中的生物合成和降解途径己经得到清楚地表征(例如参见Stryer,L.Biochemistry,5thedition(2002))。必需氨基酸，即组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸，由于其生物合成复杂，因此需要从营养中获得，但它们可通过简单的生物合成途径被容易地转化为ll种非必需氨基酸，即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸。高等底物的确能够合成这些氨基酸中的一部分，但饮食中必须提供必需氮基酸，这样才能进行正常的蛋白质合成。除了它们在蛋白质生物合成中的功能，这些氨基酸本身也是令人感兴趣的化合物，其中许多己经用于食品业、饲料业、化学品、化妆品、农业和制药业。赖氨酸不仅在人类中是重要的营养氨基酸，在单胃动物如禽类和猪中也是如此。谷氨酸最常见的是用作调味剂，与天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸一样，广泛用于食品业。甘氨酸、L-甲硫氨酸和色氨酸均用于制药业。谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸用于制药业和化妆品工业。苏氨酸、色氨酸和D/L-甲硫氨酸是常见的饲料添加剂(Leuchtenberger，W.(1996)，Aminoacids-technicalproductionanduse,p.466-502inRehmetal.(editors)Biotechnology,Vol.6,Chapter14a，VCH:Weinheim)。此外，已经发现这些氨基酸可用作前体，用于合成合成的氨基酸和蛋白质，如N-乙酰半胱氨酸、S-羧甲基-L-半胱氨酸、(S)-5-羟色氨酸及其他，见Ullmann'sEncyclopaediaofIndustrialChemistry,Vol.A2，p.57-97，VCH:Weinheim,1985。天然氨基酸在能够产生这些天然氨基酸的生物体例如细菌中的生物合成已经被充分表征(有关细菌氨基酸的生物合成及其调控的综述可参见UmbargerH.E.(1978)Ann.Rev.Biochem.47:533-606)。通过对拧檬酸循环的中间体a-酮戊二酸的还原性胺化可合成谷氨酸。随后可自谷氨酸分别产生谷氨酰胺、脯氨酸和精氨酸。丝氨酸的生物合成经过三个步骤，由3-磷酸甘油酸(糖酵解的中间体)开始，经过氧化、转氨作用和水解步骤后得到丝氨酸。半胱氨酸和甘氨酸均自丝氨酸产生前者是通过同型半胱氨酸与丝氨酸的縮合，而后者是通过在由丝氨酸羟甲基转移酶催化的反应中将侧链p-碳原子转移给四氢叶酸。苯丙氨酸和酪氨酸是自糖酵解和戊糖磷酸途径的前体赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸合成的，其中在生物合成途径的9个步骤中，两者的不同仅在合成预苯酸(prephenate)之后的最后两个步骤。色氨酸也产生自这两种最初的分子，但其合成途径包括ll个步骤。也可自苯丙氨酸合成酪氨酸，该反应由苯丙氨酸羟化酶催化。丙氨酸、缬氨酸和亮氨酸均为丙酮酸(糖酵解的终产物)的生物合成产物。天冬氨酸是从柠檬酸循环的中间体草酰乙酸形成的。天冬酰胺、甲硫氨酸、苏氨酸和赖氨酸分别通过转化天冬氨酸而产生。异亮氨酸可自苏氨酸形成。组氨酸是经过一种复杂的9个步骤的途径而自5-磷酸核糖-l-焦磷酸酯(一种活化的糖)产生的。氨基酸如超过细胞合成蛋白质所需的量则不能被储存，而是降解产生中间体，用于细胞的主要代谢途径(综述见Stryer,L.，Biochemistry,5thedition(2002),Chapter23"ProteinTurnover:Aminoaciddegradationandtheureacycle")。尽管细胞能够将过量的氨基酸转化为有用的代谢中间体，但就能量、前体分子以及氨基酸合成所需的酶而言，产生氨基酸的代价是很高的。因此，氨基酸的生物合成受到反馈抑制(其中特定氨基酸的存在减慢或完全阻止该氨基酸本身的产生)并不出乎意料(有关氨基酸生物合成途径的反馈机制的综述见Stryer,L.，Biochemistry,5thedition(2002),Chapter24:"Biosynthesisofaminoacids")。因此，任何特定氨基酸的产量均受到细胞中该氨基酸的量的限制。革兰氏阳性土壤细菌谷氨酸棒杆菌被广泛用于工业生产不同的氨基酸。赖氨酸和谷氨酸是主要的工业产品，其生物合成已经被研究多年，与此不同的是，有关调节甲硫氨酸生物合成途径的知识十分有限。至少其途径中的关键酶仍是未知的(见图lb)。高丝氨酸是通过由天冬氨酸激酶(lysC)、P-天冬氨酸半醛脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶(hom)催化的3个连续的反应而自天冬氨酸产生的。谷氨酸棒杆菌通过高丝氨酸-O-乙酰转移酶(MetA)(EC2.3丄31)的乙酰化作用活化高丝氨酸。还己知转硫作用和直接巯基化均用于产生同型半胱氨酸(Hwang,B.J.etal(2002)J.Bacteriol.184(5):1277-86)。转硫作用由胱硫醚个合酶(MetB)(EC2.5丄48)催化(Hwang，B.J.etal.(1999)Mo1Cells93:300-8)。在该反应中，半胱氨酸和O-15乙酰基-高丝氨酸结合为胱硫醚，后者被胱硫醚-P-裂合酶(MetC，其也称为AecD)(EC4.4.1.8)(Kim，J.W.etal(2001)MolCells112:220-5;Ruckertetal.(2003)，见上)水解为同型半胱氨酸、丙酮酸和氨。在直接巯基化中，O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ，其也称为MetY)(EC2.5.1.49)(Ruckertetal.(2003)，见上)将O-乙酰高丝氨酸和硫化物转化为同型半胱氨酸和醋酸。最后，谷氨酸棒杆菌具有两种将同型半胱氨酸S-甲基化的酶，产生甲硫氨酸(Lee，H.S.andHwang，B.J.(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.625-6:459-67;Ruckertetal.，2003，见上)，这两种酶是钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)(EC2丄U3)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)(EC2丄U4)。前者使用5-甲基四氢叶酸而后者使用5-甲基四氢蝶酰三-L-谷氨酸(5-1116&)^6&311)^1"(^161>0>^1^丄-glutamate)作为甲基供体。最近，发现了一种推定的TetR-家族转录调节物蛋白(Reyetal.(2003)JournalofBiotechnology103:51-65)。该调节物被发现可阻抑一些编码甲硫氨酸和硫代谢的酶的基因的转录。基因敲出该调节物蛋白导致以下基因的表达增加编码高丝氨酸脱氢酶的hom、编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的metZ、编码S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合酶(EC2.5丄6)的metK、编码半胱氨酸合酶(EC2.5丄47)的cysK、编码推定的NADPH-依赖性亚硫酸盐还原酶的cysl、以及编码推定的链烷磺酸盐单加氧酶的ssuD。Reyetal.(MolecularMicrobiology(2005)56:871-887)还发现metB基因在mcbR阴性株中被显著诱导。丝氨酸自糖酵解中间体3-磷酸甘油酸合成，后者首先经3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA;EC:1丄1.95)的作用被氧化为磷酸羟基丙酮酸。第二步，由磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC;EC:2.6丄52)催化的对磷酸羟基丙酮酸的转氨作用形成磷酸丝氨酸，后者随后被磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB;EC:3丄3.3)脱磷酸化，得到L-丝氨酸。L-丝氨酸可被丝氨酸脱水酶sdaA(EC:4.3丄17)转化为丙酮酸，以及被丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT;EC2丄2.1)转化为甘氨酸和亚甲基四氢叶酸(见图la)。亚甲基四氢叶酸可通过亚甲基四氢叶酸还原酶metF(EC1.5丄20)的活性被转化为甲基四氢叶酸。现已出乎意料地发现，增加可被微生物代谢所利用的丝氨酸的量可导致该微生物内L-甲硫氨酸的产量增加。本发明基于如下发现，即增加提供给微生物的丝氨酸的量可导致甲硫氨酸的合成增加，且因此L-甲硫氨酸的合成效率和/或产率得以提高。可通过将微生物培养在富含丝氨酸的培养基中而增加可供微生物代谢所利用的丝氨酸的。或者或另外地，可对微生物的参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面进行遗传学修饰。如果将在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面进行了遗传学修饰的微生物培养于富含丝氨酸的培养基中，这可对甲硫氨酸的产率造成更大的影响。术语"代谢"意欲包括细胞内发生的并导致分子合成和降解的所有生化反应。术语"增加丝氨酸的量"指的是能够被微生物利用用于合成生物分子的丝氨酸的量与培养在标准培养条件下的野生型微生物相比增加至少10%、至少20%、至少30°/。、优选地至少40°/。、优选地至少50%、更优选地至少60°/。和70%、甚至更优选地至少80%和90°/。、特别优选地至少100%、110%和120%、和最优选地至少160°/。、200%和250%。细胞内丝氨酸的量可通过Wittmannetal.((2004)Anal.Biochem.327(1):135-139)所述的方法确定。术语"标准条件"指的是在不富含丝氨酸的标准培养基中培养微生物。培养的温度、pH和时间可以变化，如下所述。各种微生物的标准培养条件可参考教科书，例如SambrookandRussdl，MolecularCloning—Alaboratorymanual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress,3rdedition(2001)。例如，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株常规生长在MB或LB和BHI肉汤中(Follettie,M.T.etal.(1993)J.Bacteriol.175:4096-4103,DifcoBectonDickinson)。大肠杆菌的常用标准基本培养基(minimalmedia)是M9和改良的MCGC(Yoshihamaetal.(1985)J.Bacteriol.162:591-507;Liebletal.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210.)。其他用于培养细菌的合适的标准培养基包括NZCYM、SOB、TB、CG12!/2和YT。本发明所述的"标准培养基"意欲包括所有适合用于培养本发明的微生物的培养基。富集培养基和基本培养基均包括优选的基本培养基。本发明所述的标准培养基不包括已经添加了或要添加一或多种氨基酸的培养基。"基本培养基"是仅含有供野生型细胞生长的基本必需品的培养基，如无机盐、碳源和水。与之不同的是，"富集培养基"用于满足特定微生物的所有生长需求，即除了基本培养基的内容以外，还含有例如生长因子。可按照如下所述的量将抗生素添加至标准培养基中(微克/毫升)氨苄青霉素，50;卡那霉素,25;萘啶酸，25，以便筛选转化的菌株。遗传学修饰的棒状杆菌通常培养在合成的或天然的生长培养基中。用于棒状杆菌的多种生长培养基是已知的且能够容易地获得(Liebetal.(1989)Appl.Microbiol.Biotechnol.，32:205-210;vonderOstenetal.(1998)BiotechnologyLetters11:11-16;Liebl(1992)"TheGenusCorynebacterium,in:TheProcaryotes,VolumeII，Balows，A.etal.，eds.Springer-Verlag)。谷氨酸棒杆菌载体的实例可参见HandbookofCorynebacterium(Eggeling，L.Bott，M.,eds.，CRCpressUSA2005)。合适的培养基包括一或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和微量元素。优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。例如，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素可作为很好的碳源。也可以通过复杂化合物例如糖蜜或糖精制过程的其他副产品来提供糖。补充不同碳源的混合物也是有利的。其他可能的碳源是醇和有机酸，例如甲醇、乙醇、乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物。示例性的氮源包括氨气或氨盐，如NH4Cl或(NH4)2S04、NH4OH、硝酸盐、尿素、氨基酸或复合氮源，如玉米浸液、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等等。可使用不同硫源实现超量生产甲硫氨酸。可使用硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐以及更多还原的硫源如H2S和硫化物以及衍生物。也可使用有机硫源如甲硫醇、巯基乙酸盐、硫氰酸盐、硫脲、含硫氨基酸如半胱氨酸、以及其他含硫化合物来实现甲硫氨酸的高效生产。甲酸和/或甲硫醇与其他C1源如甲醛、甲醇和二甲基二硫化物一样，也可作为补充物。可加入到培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰锌、铜和铁的盐酸盐、磷酸盐或硫酸盐。可在培养基中加入螯合化合物以保持溶液中金属离子。特别有用的螯合化合物包括二羟基苯酚类如儿茶酚或原儿茶酸(protocatechuate)，或有机酸如柠檬酸。培养基通常还含有其他生长因子如维生素或生长促进剂，这些的实例包括生物素、核黄素、硫胺18素、叶酸、烟酸、泛酸盐和维生素B6。生长因子和盐常产生自复杂培养基组分如酵母提取物、糖蜜、玉米浸液等等。培养基化合物的确切组成很大程度上取决于即将进行的实验并需要根据各种具体情况分别确定。有关培养基优化的信息可参见教科书"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach(eds.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRLPress(1997)pp.53-73，ISBN0199635773)。也可以选择商品化的生长培养基，如标准1(Merck)或BHI(脑心脏输注，DIFCO)或其他。所有培养基组分均应该是灭菌的，可通过加热(1.5巴，121°C，20分钟)或过滤除菌。这些组分可一起灭菌或者在必要时分别灭菌。制备用于细菌培养的标准培养基通常不涉及添加单独的氨基酸。而在用于标准培养条件下的富集培养基中则添加氨基酸的混合物，例如蛋白胨或胰蛋白胨。因此，通过向如上所述的标准培养基中额外添加确定浓度的纯丝氨酸，可得到本发明的富含丝氨酸的培养基。优选地，添加到所述培养基中的丝氨酸的浓度为O.lmM至100mM，优选地为1至50mM，更优选地为5mM至20mM，且最优选地，丝氨酸的浓度为10mM。也可以向连续补料发酵过程中补入丝氨酸的储存液，以使得丝氨酸的当前浓度维持在O.lmM至10mM之间，优选地在0.1mM至5mM之间，且最优选地在0.1mM至1mM之间。也可通过在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面对微生物进行遗传学修饰而增加可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量。术语"遗传学修饰"在本发明中指的是微生物已经通过基因工程技术进行了修饰，从而使表达的一或多种蛋白质的量发生改变，这些蛋白质既可以是天然存在于野生型生物体的、也可以是天然情况下不存在于野生型微生物中的蛋白质，或者表达的蛋白质与野生型微生物的蛋白质相比具有改变的活性。术语"丝氨酸代谢"意欲包含所有导致丝氨酸合成和丝氨酸降解的反应。术语"丝氨酸转运"指的是通丝氨酸过特定的转运蛋白而输入到细胞内或输出到细胞外。至于增加或降低蛋白质的含量或量和/或生物学活性，可采用本领域已知的所有用于增加或降低宿主(例如上述的生物体)内蛋白质的量和/或活性19的方法。可通过表达外源形式的相应蛋白质而增加蛋白质的量。此外，可通过影响启动子和/或增强子元件的活性和/或在转录、翻译或翻译后水平调节相应蛋白质的活性的其他调节活性如磷酸化、异戊烯化等来增加内源性蛋白质的表达。除了简单地增加一或多种蛋白质的量，还可利用携带特定突变的酶来提高蛋白质的活性，所述突变使得所述酶的活性升高。此类突变可以，例如，灭活酶中负责反馈抑制的那部分。通过例如在这些酶中引入非保守性突变，酶不再受到反馈调节，且因此在产生较多分子的时候酶的活性仍不被下调。可以将突变引入内源性的所述酶中，或可以过量表达相应的突变形式的外源性酶。此类突变可包括点突变、缺失或插入。点突变可以是保守性的(一种氨基酸被具有类似生物化学性质的另一种氨基酸取代)或非保守性(一种氨基酸被生物化学性质不相似的另一种氨基酸取代)。此外，缺失部分可包括仅仅两或三个氨基酸直至相应蛋白质的完整结构域。可自文献中找到使得D-3-磷酸甘油酸脱氢酶不受L-丝氨酸反馈调节的合适的突变实例，例如参见Belletal.(2002)Eur.J.Biochem.269:4176-4184;Al-Rabieeetal.(1996)J.Biol.Chem.271(38):23235-23238;Peters-Wendischetal.(2005)Appl.Environ.Microbiol.71(11):7139-7144。通过引用将这些文章并入本申请。因此，可通过不同的途径来增加蛋白质的量和域活性，例如通过关闭转录、翻译或蛋白水平的抑制调节机制，或通过使得编码这些蛋白质的核酸的基因表达比野生型增加，例如通过诱导内源性基因或者通过引入编码所述蛋白质的核酸分子。在一个实施方式中，通过使编码酶例如SerA[EC:1丄1.95]、SerB[EC:3丄3.3]和SerC[EC:2.6.1.52]、SHMT[EC1.2.1.2]、metF[EC1.5丄20]的核酸的基因表达增加，或者通过使编码蛋白质例如sdaA[EC:4.3丄17]禾口ThrE的核酸的基因表达降低，可分别实现与野生型相比酶活性或量的增加。可自相应的数据库获得编码这些蛋白质的核酸序列，例如NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL(http:〃www.embl.org)、Expasy(http:〃www.expasy.org/)、KEGG(http:〃www.genome.ad.jp/kegg/kegg:,html)等等。表l给出了一些实例。20表l<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>PMT1431，DR1291,PMT9312一1452,TTC0586，Msp_1145,Atlgl7745,TTHA0952,PMM1354，At4g34200，RB6248,PMN2A—0926,CJE0970，Cj0891c,Pear—0417,CMC149C,At3gl9480,aq_1905,jhp0984,HP0397,PH1387,PAB0514,TK1966,C31C9.2,PF1394,Cag—1377,TM1顿，Afli2g04490,CG6287-PA,rrnAC1762,AGR_pAT—578,PF0319,Atu5399,PAB2374,OB2286,Adeh—1858,BLi03698,BL03435,TK0683,PH0597,Reut—B3530,GK1954,ABC0220,MK0320,DSY0969，BP0155,Bxe_B1896,BB4474,BPP4001,STH3215，OB2844，CAC0015，RPC—3076，rrnAC2056，RPC一1162,AGR_pAT—470,Atu5328,PP3376:PAE3320,Bdl461,Pfl—2987,Rmet—4234,CNA07520,GK2965,MS1743,VV11546,LA1911,m謂21,MS0068,lp一0785,l固70'VV285I,ebA6869，RPA2975,Tcr—0627，LIC11992,TTE1946,MAI334,LMOG365—0095,Sde—3388,lmo0078,LmjF03.0030,SH0752,Rmet一4537，orfl9.5263,VP2593,BCE1535,RPD—2卯6,CPE0054,OB2357,b117965,BAS1325,BA_1955,GBAAl434,BAl434,Reut_B4747，PFL—2717,PA2263,YPTB3189,YP3611,y3301,YPO0914,GOX0218,ACL032C,RSP—3407,VC2481,BT9727—1298,BCZK1299,BMEII0813,BTH—12298,Reut一B4615,ECA3905，YPTB3910，YP3988,YPO4078,RPB—2550,BruAb2一0769,BRA0453，BAB2—0783,Pfl一2卯4，plu3605,PAE1038，DSY1673,Sden一3097，NTHI0596，SERP1888,blr4558,Rfer—1867,YE腿1W，BC1415,Pear—0629,VF2106,y4096,SPCC4G3.01，SE1879，SAR2389,BB4731，Psyc—0369，TK0551,SC03478,Csal—1770，XCV18卯,Bc印18194—A5027,PM1671,SAOUHSC_02577，SAUSA300—2254,SACOL2296,SAS2196,MW2224,BLi03415,BL02138，Mfla一0724，PSPT05294,XOO3260,XC—1568,XCC2550,SAB2178，SAV2305,SA2098,PSPPH_4885,XCV2876,SH2023,Adeh—2960,BURPS1710b_2286，BPSL1577,Pcryo一0410，NE1688,YPTB1320,YP1303,t2980,STY3218,Mbar—A2220,Psyr_4852，HI0465,y2896,YP01288,STM3062，SPA2933，YIL074C,SERP0516,Bxe一A1982,XAC2724,SC3003,BB1050,Afo5g05500,SSP0606，SG2009,SE0622,XCC1825,SBO—2700,PF0370，SBO—3080,SSO_3065，S3098,SF2898,UTI89_C3299,c3494,ECs3784,Z4251,JW2880,b2913,SRU—0653，SAB0796，SAR0892,Bd2892,ACIAD3302,Saci—1368,SSP1845,Bcepl8194一A4216,Psyr—1043,Csal—0273,PPA2251,DVU0339,PFL—5911,SDY一3169，DDB0230052,SAS0800，MW0812,IL2104,PA4626,XC一2364，SAUSA300—0834,SACOL0932，SAV0930,SA0791,Bpro—1736,SMc01622,amb0136,PSPPH—1099,X002143,XAC画:PAB1008,RB6394,LBA0942，MCA1407,23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>MT3127,Rv3042c,SCO1808,SAV6470,TfU—0136,CT0173,Psyr—0557,PSPT04957,PP4909,Sde—1075,HCH—05403，Plut—1948,PSPPH—0550,PA4960,ACIAD3567，Pfl一0506:Pcar—2283,BF2389,BF2300,RB8037,Cag—0409,PFL—0551,PG0653,BT0832,CMI086C,Csal一2542,Acid345一2803,AF2138:Lxxl1750,Rmet—1368,Psyc—1857，AO090020000345,Afti3g06550,SPBC3H7.07c,Pcryo—2146,SMU.1269,stul519,strl519，Reut一A1357,PBPRA0635,Mfla—1890,Rru一A0465,ACL130C，Daro—1962，VV2674,VP2431,YGR208W,Bxe—A2331,VV11730,RScl640,blr6505，VF0509,CMQ250C,IL1876,Nwi—2345，Bcepl8194_A5077，L0085,Z5989,NMB0981,SBO—4451，SSO—4538，S469I,SF4420，ECs5346:JW4351,b4388，SDY一4649，UTI89—C5159,c5473，SAK—0710,gbs0605,SAG0625,MJ1594,ECA0465,BL1792,RPB—3347,NMA1179,GOX1085,RSP—1350,Tcr—1620,SC4423,orfl9.5838，NG01468,YPTB0586,YP3740,y3738,YPO0442,STM4578,SPA4388,t4617,STY4925,RPA2029,VC2345,ZMOl137,CC2097,PPA2051,ebA6034,BURPS1710b一2322,BPSL1543，BMA1313,MTH1626,CV3516,CPS—1107,RHE—CH02794,AGR—C—3697,Atu2040,RPD—2096,NmuIA0636,BTH—12264,Msp—1096,BB3819,BPP3368,MK0121,SP03353,BP0863,PM1657,<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>BCZK2969，PSPPH—3666,CAC0014,CMT252C,GOX1446，RPC—4107,CV2301，BCI一0252，Psyr—3646，AF1417,MM2911,BC3249，BH1188，RPA4309，b117402，DDB0230053,BAS3079,BA—3823,RPB一1314,HI1167,Nmul一A2190,STH3178,L0083,Daro—0984,Pfl一4077,PP1768，HD1382,253.麵01,LSL一0091，ECA2594,PTO0371,Mbar一A1294,BH03780,PFL—4313,PSPT01746,GBAA3321,BA3321，Bfl383,BQ027卯，Mfla一1687,y2784，YP01389，CNL05470,RPD3906,YPTB1414,MA2304,SRU—2207,Daro一1231,RSc0903,ELI—01955,HP0736,Rfer—1570,PA3167,plul619，MJ0959,ST0602,BG12673,FTT0560c,MS1573,jhp0673,FTL_1018，LIC10315,LA0366，lppl373,RB6246,BLi01082,BL05093,NE0333，F26H9.5，DPI933,Noc_0172,HCH—04982,PM0837,PMT9312—0035，ebA卯7，Rmet—0715,Reut一A2576,lpgl418，PBPRA2455,VF0899，strl529，Adeh—2994，BTH一I1966,lpl1369,MM0246,Mbar一A2080,Bcepl8194一A4155,Csal—2167，DR1350,gbsl621,BURPS1710b—2651,BPEN—394，rrnAC1999,Mhun一2475,Cj0326,Tmden—0073,BPSL2219:Pcryo一1434,YP1204，MTH1601,GK0649,Tcr—1192,Psyc—1036，PBPRA3292,stul529,SYN一00124,STM0977，SPA1821,MA1816,SC0931，t1957,STY0977,TK1548,CJE0371,BMA1625,Dgeo一l114,X002388,SS02597,BURPS1710b—2998,BMA0433,VV11425,UTI89—C0978,c1045,MK0633,HH0909,ACIAD2647,ABC1531,MCA1420，SSO—0908,S0966,SF0902,BPSL2519,WGLp486,bbp289,SBO—2193,AO090023000099,Bxe—A0976,IL1359,SDY—2354,ECs0990，Z1253,JW0890,b0卯7，VV21664,Syncc9605—0044,VP2714,VP1247,XC_2645,XCC1589,SMal495,BTH—I1634,PSHAal422，VCI159，cbdb一A581，STH8，VVA0476,SPAC1F12.07,PAB1801,WS0024,VV2958,TTHA0582,CT0070,PM画035,NMA1894,VV1451,VV12813,VPA0235，BU312,At4g35630，TTC1813，RHE一PB00131,NMB1640,CPS—2190,XAC1648,TTC0213,Bpro一1793,Sden—0404，XF2326，At2gl7630,PH1308,MMP0391，DET0600,Tbd_2509,VF0339,TTHA0173,NP2578A，VCA0604，Saci一0249,NG01283,VC0392,SMU.1656sdaA丝氨酸脱水酶NCgl1583NCgl0939谷氨酸棒杆菌ThrE苏氨酸和丝氨酸输出载体蛋白AAK61331谷氨酸棒杆菌SHMT丝氨酸羟甲基转移酶Q93PM7,BA000035,Q8FQR1,Q6NI47,Q4JU69,Q5YQ76,Q73WG1，Q4ME8,053441,P59953,Q6ADF0,Q9X794,Q概Zl,Q82JI0，086565,Q47MD6，Q4NM56,ORF,Q4NGB0,BX251412，053615,P66806,Q7U2X3，Q24MM6,Q2ZEP1，Q65而5，Q426V7,Q5KUI2,Q2RFW7，Q3A934，谷氨酸棒杆菌等28Q3CJJ0,Q8R887,Q8Y4B2,Q4EPI3,Q71WN9，Q6窗l，Q927V4,P39148,Q5HE87,Q2YUJ1,Q9K6G4,Q7SIB6,Q2FF15,Q5WB66,Q4CID1,Q2BG18,Q40L42，Q3AN03,Q8YMW8,066776,Q1YIN1,Q41G88，Q74CR5,Q3GAC7,Q3MBD8,Q2DMQ8,Q7U9J7,Q39V87，Q630T3,Q72XD7,Q2D1V8,Q6HAW9,AE017221,Q5SI56,Q72IH2,Q814V2,Q5画B0，Q8XJ32，AE017225,Q81JY4,Q3WZQ2,CP000360,Q5NN85,Q3AW18,Q4L7Z4，Q3A4L9,Q26LA5,Q7V4U3,Q6FA66,Q2S9R4,Q3G5N8，Q2SFI7,Q3N8U1，Q6N693,Q82UP9，Q2JT50,Q31CS4,Q5P7P1,Q9HTE9,Q3KDV1，Q26XG3,Q3SGX5,Q5FNK4,Q2ILI1，S30382,Q2YD58,Q4BPZ9，Q2LQM6,Q5N2P9,Q376I5,Q46HB6，P50435，Q37NB6,Q7ND67,Q72CT0,Q2WMW5,Q2CH39,Q7VDS8，Q8U7Y5,Q88AD1，085718,Q48CP3,Q2JI36，Q8DH33,Q7V335,Q214H7Q6MLK1,Q3QXZ6,Q2DFI0,Q9WZH9,CP000283,Q37FB0,Q3N0F7，Q4ZM83,Q44AR5,Q8EM73，Q1WTR3,Q2CP12,Q3SRV3,Q3CCS2,Q2W4T2,Q35IU4,Q2IWS4，Q2CQJ5,Q4J3C4,Q49Z60,CT573326,Q4C6H0,Q3IZN2,Q607U4,P24060，Q4BQS8，Q41LQ8,Q7UQN2，Q2YN95,Q2RTB8，Q3P773，Q46RR4，Ser,Q47IH1，Q3JGP5,CT573326,Q21函，Q3F809,Q2T437,Q3F764，Q88R12,S15203,29<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>Q9A8J6，Q7W400，Q3YZ04,Q32D21，Q5F8C0，Q4AMK6,Q6D246,Q3R828,E82743,Q9PET2，Q3P6F8，Q9XAY7,Q3NK51,Q3Z9B9,Q6G3L3,Q88Q27,Q1Z正9，Q31FS6，P56990，Q9XB01，Q3DHL3Q6LU17，Q7W1I6,H82258,Q9KTG1,Q8E5C6，Q57LF7,Q3IRX5,Q3K122,Q7WPH6,AP008231,Q1YU48,Q3D8P3,Q8DPZ0,Q97R16,Q46A52,Q6F211,Q1PZE1,Q8L372,B48427,Q2KV15,Q1RGX5,Q43K52,Q3VUL2,Q3II23,Q1ZPS2,Q2NAR9，Q8DU67,Q9CHW7,Q6CZV5，Q3XBK9,H84295,Q4FLT4，QIUZA1,Q8DFC9,Q74LC1，Q488N6,Q2C6B3,Q65T08,Q1Z7P1，F75567,Q9HPY5Q9RYB2,Q1V311,Q87RR2,Q3GI80,Q6G009,Q8ZCR1，Q5QXT4,Q5V3D7,Q2ST43，Q5E706,Q8Z2Z9,Q1XXG3，Q5PBM8,Q6MS85，Q3EFW1,Q7QM11,Q2BUE3，Q48TK6,Q5FMC0,BA000034,Q1U7W2,Q8P122,Q8K7H8,Q99ZP1,Q5M0B4,Q5XC65,Q83BT3,Q2GEI3,Q4QMI9,CP000262,Q84FT0,Q5M4W1，CP000260,Q1QU94,Q4HIU1，P43844,Q40IP4,Q5NFJ3,Q2A498,Q92GH7,Q2GLH3,008370,AY871942,Q68W07,Q4UK96，Q4HBL3，Q30P60，Q26C95，Q38WJ7，Q3YRD1,P59432,Q7P9P7,JQ1016,P57830,P24531,P34894,Q5HW65,Q2X6F1，Q2JFD4,Q2NIT8,Q30R29,CP000238,Q6YR37，Q8A9S7，Q5LD58,Q5FG30,<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>Q5I598,Q6J6A1,Q65UG6,Q60CG9,Q5NLN9,Q1V6F7,Q8PP97,Q47JN9,Q3J4G1,C87514,Q8Y389,Q3P3Q2，Q21NJ7Q87V72,Q4HZN6，Q3QI84，Q1YM37,Q26NU6,Q4J1U0，Q36HT8，Q2D3T4，Q2DGG5,AJ237672,BC053509,CS287591,CS287593,Q3K5D6，Q59GJ6,Q5SNW6,C82045,F81880,P42898,P45208，Q1QR87，Q30YC4,Q1YZZ8,Q2Y5Z3，CQ795570,AM236080，Q6LVH3,Q3QYB9,Q3RDV3,CP000270,Q5F862，D81140,Q60HE5,Q88D51，Q87EA5,Q1R0K0，Q3NPK8，Q4FT38,Q2ZW39，Q3F2W2,S46454,CT573326,Q8EA55,Q1QAS5,Q476T6,Q2G3D0,Q2X8T6,,Q7UNJ7,Q3RB96,Q33Z96，Q4NA26,Q3SFY6,Q44YV3，Q2K697,CQ795568,Q3Q3HO,Q2STU2除了例如通过在培养基中提供增加量的丝氨酸或通过对参与丝氨酸代谢和转运的蛋白质方面对微生物进行遗传学修饰，来增加可供微生物利用的丝氨酸的量，还可对所述微生物进行遗传学修饰，使之表达一或多种参与甲硫氨酸合成的酶。这可进一步提高甲硫氨酸的产率或甲硫氨酸合成效率。这些酶可选自天冬氨酸激酶(lysC)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸-O-乙酰转移酶(MetA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)。可自相应的数据库获得编码这些蛋白质的核酸序列，例如NCBI(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL(http:〃www.embl.org)、Expasy(http:〃www.expasy,org/)、KEGG〖http:〃www.genome.ad,jp/kegg/kegg.html)等等。表2给出了一些参与甲硫氨酸生物合成的酶的具体实例。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>Cj0582,Nmul一A1941,SYN—02781,TTHA0534,CJE0685,BURPS1710b—2677，BPSL2239,BMA1652,RScl171,TTC0166，RPA0604,BTH—11945，Bpro—2860，Rmet—1089,Reut_A1126，RPD—0099,Bxe—A1630,Bcepl8194—A5380,aq_1152,RPB_0077,Rfer一1353，RPC—0514,BH3096,BU02996,BL00324,ambl612,tlrl833,jhpl150,blr0216,Dde一2048，BB1739,BPP2287,BP1913,DVU913，Nwi一0379，ZM01653,Jann—3191,HP1229,Saro—3304,Nham_0472,CBU—1051,slr0657,SPO3035,Sy叩cc7942一讓，BG10350,BruAbl—1850,BAB1—1874，BMEI0189，BT9727一画，syc0544d,BR1871,gill774,BC1748,mll3437，BCEl883，ELI—14545，RSP一1849，BCZK1623,BAS1676,BA—2315，GBAA1811,BA1811,Ava—3642,alr3644,PSHAa0533，AGR—L—1357,Atu4172,linl198,BH04030,PMT9312J740,SMc02438,CYA一1747，RHE一CH03758，lmo1235，LMOf2365—1244,P顧2A一1246，CC0843,Pro1808，BQ03060,PMT0073,Syncc9卯2—0068，GOX0037，CYB一0217Horn高丝氨酸脱氢酶cgl337,NCgl1136,CE1289，DIP1036，jkl352,nfal0490，SAV2918,Mbl326,MT1333，Rvl294，SC05354,MAP2468c,ML1129，Francci3—3725,Tfia—2424，Lxx06870,PPA1258,Moth_1307，BL1274,CHY一1912,DSY1363,GK2964,CAC0998,BLi03414,BL02137，BC5404,STH2739,BCZK5102,BT9727一5085,Gmet一1629,BCE5533，BB1926,BP2784,CTC02355，BG10460，BPP2479,BAS5256，BA—0512，GBAA5654，BA5654，Sy叩cc7942—2090,syc2003—c,Adeh一1638,CYA—1簡，Pear—1451，Mfla—1048,Mfla—0904，TW329,TWT439，BH3422,a114120,Daro一2386，g114295,ebA4952，Ava—0783,Syncc9605—1957,LSL—1519,OB0466，lmo2547，PMT1143，Bpro一2190，SYNW0711,LMOf2365一2520，lin2691,sl簡5，CV0996,RScl327,PMT9312—1062,ABC2942,Bcepl8194—A5155，BURPS1710b—2396，BPSL1477,BMA1385,NMA1395，NMB1228t110277，Syncc9902一0704,GSU1693,Bxe一A2381,MCA0597，NGO0779,CYB一1425,BTH—I2198,BMEI0725,Rmet一1966,Rfer一1912，SMc00293,BruAbl一1275，BAB1—1293,SYN一00890，Reut一A1993,RHE—CH01878,BR1274,aq_1812,TTE2620,ACIAD0264,PFL—1103,stu0469,str0469，Pfl一1027,Psyr一1290，P廳2A—0702,MTH1232,Csal_3010,AGR一C—2919，Atul588，PSPPH一1360,PP1470，NE2369，PSPT01柳，Tcr一1251，BC1964，Nmul一A1551,Saro一0019,m110934,WS0450,sprl219,SP1361,Noc一2454,BT9727一1799,BCZK1782,BCE2051，Tbd一0843,PA3736,DET1206，amb3728,Rru—A2410,LIC10571，LA3638,SMU.965，BAS1825,BA一2468，GBAA1968，BA1968，cbdb—A1123,GOX1517,PMM1051,HCH一01779,RB8510,DVU08卯，Pro1150,Nham—2309,Tmden—1904,Sde—1209,Psyc—0253,ELI—13775,RSP—0403，L0090,Dde—2731，Pcryo—0279,Nwi—1647,lp—0571,BH翻O，SP01734,Jann一2998，blr4362,RPA2504,EF2422,DP1732，LBA1212,RPD—2495,RPC—2816,CC1383,RPB_2966,CJE0145,Cj0149c,Acid345一1481,ZMO0483:Bpro一5333，SAK—1205,gbsll87Jhp0761,SHI579,SAG1120,HP0822,SE1009,SE訓897,SAOUHSC一01320，SAUSA300—1226，SAB1186,SACOL1362,SAS1268,SAR1338,MW1215，SAV1328，SA1164,HH1750,SSP1438,lp一2535，TTE2152,SAR11—1025，DR1278,PFL一3809,Dgeo—0610,Mhun—2292，DSY3981，PP0664,MA2572,ABC1578,Mbar一A1898,TTHA0489,TTC0115，MM2713,Mbur_1087,BH1737,AF0935,MK1554,MTH417,VNG2650G，Msp一0487,ABC0023,rrnAC2408,TK1627,TM0547,MJ1602,NP0302A,BH1253,MMP1702,BCE2626,LmjF07.0260,BCZK2354，BT9727一2388,BAS2433,BA_3119,GBAA2608，BA2608，BC2548，Acid345一4165，CTC00886,ST1519,Saci一1636,APE1144，SSO0657,PF1104，Adeh一3931,PAB0610,PH1075,Cag—0142,PAE2868,YJR139C，XOO1820,Plut一1983,XAC3038,Adeh一1400，XCV3175,PT01417,SCO0420,SRU_0482，XC」253，XCC2855,SO4055,CT2030,SPBC776.03,AO0卯003000721，TVN0385,ABL080W,AO090009000136,CPS—0456,HI0089,orfl9.2951，Sden一0616，UTI89一C4525,AfU3gl1640,MS1703,SBO一3960，SSO一4114，STM4101，SC3992,t3517,STY3768,c4893，ECs4869，Z5495,JW3911,b3940，AN2882.2,ECA4251,C麵129C,NTHI0167，plu4755,ECA3891,YPTB0602,YP3723,y3718,YPO0459,PM0113,S3729,SF4018,SPA3944,Mfla—1298,PSHAa2379，PBPRA0262，X002242,STM0002,SC0002,SPA0002,麵2,STY0002，c0003，SRU一0691，XCC蘭,PD1273,BPEN一115，SDY一3775，VC2684，SDY一0002,SBO—0001，YPTB0106,YP0118,y0303,YPO0116,UTI89一C0002,ECs0002,Z0002,JW0001,b0002，VV3007，VV11365,XC—2389，VP2764,XF2225,SSO—0002,S0002,SF0002除了增加可被微生物代谢所利用的丝氨酸的量之外，增加甲硫氨酸合成的另一途径是降低一或多种参与阻抑那些参与甲硫氨酸合成的基因的转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性。WO02/097096公开了此种阻抑物基因的一个实例，称为McbR或MetD。弱化该转录调节物提高了棒状细菌L-甲硫氨酸的超量。通过将编码表1和减2的酶的核酸引入生物体、优选地谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌，可提高表1和/或2的酶的量和/或活性。原则上，就增加量和/或活性而言，可使用具有表l和2所列蛋白质的酶活性的不同生物体的蛋白质。当真核细胞来源的含有内含子的核酸序列准备在不能剪接相应的mRNA的细胞中表达或者无法使得所述细胞能够剪接相应的mRNA时，可使用已经剪接的核酸序列，如相应的cDNA。本说42明书中提及的所有核酸可以是，例如RNA、DNA或cDNA序列。为了产生更加高效合成甲硫氨酸的生物体，改变酶的量和/或活性并不仅限于表1和2中所列的酶。任何与表1和2的酶同源并在其他生物体中行使同样功能的酶均有可能非常适合于调节量和/或活性，以便通过过表达来影响代谢流量(metabolicflux)。下文给出了同源性和相同性的定义。在本发明的通过培养微生物制备L-甲硫氮酸的一个方法中，将一或多个编码上述功能性或非功能性、反馈调节型或反馈非依赖型酶中之一的核酸序列分别转移至微生物中，例如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌。这种转移导致所述酶的表达增加，并相应地导致更高的代谢流量通过所需反应途径。根据本发明，增加特定生物体内蛋白质的量和/或活性通常包括以下步骤a)产生自5'-3'-方向包含以下核酸序列的载体，优选地为DNA序列-在所述生物体内有功能的启动子序列；-与之可操纵连接的编码表1或2的蛋白质的DNA序列或其功能性等价部分；-在所述生物体内有功能的终止序列；b)将步骤a)的所述载体转移至所述生物体中，并任选地，整合至相应的基因组中。如果将超过一种的编码参与丝氨酸代谢和转运和/或甲硫氨酸合成的蛋白质的核酸序列引入微生物，则这些不同的核酸序列可位于同一个载体或不同载体上。如果它们位于不同的载体上，则这些载体可同时或先后引入到微生物中。本发明范围内的酶功能性等价部分指的是编码表1或2的酶的核酸序列的片段，这些片段的表达所产生的蛋白质仍具有相应的全长蛋白质的酶活性。可通过现有技术的方法确定酶活性(例如参见Choetal.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:8525-8530，其涉及SerB活性的分析方法；Peters-Wendischetal.(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.60:437-441，其涉及SerA活性的分析方法)。根据本发明，非功能性酶的核酸序列和氨基酸序列分别与功能性酶及其功能性等价部分相同，但在某些位点具有核苷酸或氨基酸的点突变、插入或缺失，其作用是所述非功能性酶不能催化相应的反应，或其催化能力非常有限。这些非功能性酶不同于那些仍具有催化相应反应的能力却不再受到反馈调节的酶。非功能性酶还包括在核酸序列水平或氨基酸序列水平携带点突变、插入或缺失的酶，这些酶不具有与所述酶的生理性结合配偶体(如其底物)相互作用的能力或该能力较低。非功能性突变体不能催化衍生出该突变体的野生型酶所能够催化的反应。根据本发明，术语"非功能性酶"不包括那些与相应的功能性酶在氨基酸水平和核酸水平分别不具有基本的序列同源性的基因或蛋白质。因此，不能催化相应反应且与相应的酶不具有基本的序列同源性的蛋白质从定义上讲不是本发明的"非功能性酶"。非功能性酶在本发明中也称为失活的或者无活性的酶。因此，携带上述点突变、插入和/或缺失的本发明的表l和2的非功能性酶的特征在于，其与本发明的表1和2的野生型酶或其功能性等价部分具有基本的序列同源性。当然，也可使用与编码表1或2的蛋白质的核酸序列以及编码其功能性等价蛋白质的核酸序列具有基本序列同源性的核酸分子来实施本发明。根据本发明，基本序列同源性通常被理解为，一DNA分子或蛋白质的核酸序列或氨基酸序列分别与表1或2的蛋白质或其功能性等价部分的核酸序列或氨基酸序列具有至少40%、优选地至少50%、更优选地至少60%、还优选地至少70%、特别优选地至少90%、特别优选地至少95%和最优选地至少98%的相同性。两种蛋白质的相同性被理解为在蛋白质相应全长上的氨基酸相同性，特别是通过借助于使用CLUSTAL方法(Higginsetal.(1989)Comput.Appl.Biosci.5(2):151)的Lasergene软4牛(DNAStar,Inc.,Madison，Wisconsin(USA))进行比较而计算出的相同性。DNA序列的相同性做相对应的理解。如果核酸分子在相同的5'-3'-顺序中具有相同的核苷酸，则这些核酸分子是相同的。上述方法可用于增加编码表1和/或2的功能性或非功能性、反馈调节型或反馈非依赖型酶的DNA序列或其功能性等价部分的表达。本领域人员熟知如何使用上述包含调节序列例如启动子和终止序列的载体。此外，本领域人员熟知如何将步骤a)的载体转移至生物体如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌内，并熟知哪些特性对于载体整合进生物体的基因组是必需的。若要通过转移来自一种生物体(如大肠杆菌)的编码一种特定蛋白质的核酸来增加另一种生物体(如谷氨酸棒杆菌)中该特定蛋白质的含量，则应该根据遗传密码子将由例如来自大肠杆菌的核酸序列所编码的氨基酸序列回译(back-translate)为主要包含哪些因生物体特异性密码子用法而在谷氨酸棒杆菌中更加常用的密码子的核酸序列。可通过使用计算机分析相关生物体的其他已知基因而确定所述密码子用法。根据本发明，增加编码表1或2的蛋白质的核酸的基因表达和活性也可理解为是操纵生物体(特别是谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌)的相应的内源性蛋白质的表达。这可通过例如改变编码这些蛋白质的基因的启动子DNA序列而实现。这种改变引起这些酶的表达率被改变，优选被提高，这可通过缺失或插入DNA序列而实现。此外，可通过调节性蛋白质分别改变和增加内源性基因的表达，所述调节性蛋白质不存在于转化的生物体中，但与这些基因的启动子相互作用。这种调节物可以是由DNA结合结构域和转录活化物结构域组成的嵌合蛋白质，例如参见WO96/06166。增加内源性基因表达的另一种可能方式是上调参与所述内源性基因转录的转录因子，例如通过过表达的方式。过表达转录因子的措施是本领域人员已知的，并己经公开用于在本发明的范围内的表l和2的酶。此外，可通过对内源性基因拷贝的靶向诱变而改变内源性基因的活性。也可通过影响蛋白质的翻译后修饰而改变表1或2的蛋白质的活性。这可以通过例如过表达或基因沉默等措施来调节参与蛋白质的翻译后修饰的酶(如激酶或磷酸酶)的活性而实现。在另一个实施方式中，可以改进酶的功效或破坏其别构调节区域，以便阻止对化合物产生的反馈抑制。类似地，可使降解酶缺失或通过取代、缺失或添加对其进行修饰，使得其对表1中的所需酶的降解活性降低，而不损害细胞的活力。在各种情况中，可以提高一或多种高纯化合物的总体产量或产率。表1和域2的蛋白质和核苷酸分子的此类改变还可提高除甲硫氨酸以外的其他高纯化合物的产生，例如其他含硫化合物如半胱氨酸或谷胱甘肽、其他氨基酸、维生素、辅因子、营养物、核苷酸、核苷、和海藻糖。任何一种化合物的代谢均必然涉及细胞内的其他生物合成和降解途径，而一条途径中的必要的辅因子、中间体、或底物也很可能从另一条此类途径中得到补充或受到限制。因此，通过调节一或多种表l和/或2的蛋白质的活性，除导致甲硫氨酸合成的那些途径之外，还可影响其他高纯化合物生物合成或降解途径活性的产生或效率。也可基于来自另一种不同代谢过程的化合物的细胞内水平来调节酶的表达和功能，且基本生长所需的分子(如氨基酸和核苷酸)的细胞内水平可对大规模培养的微生物的活力产生至关重要的影响。因此，调节表1和/或2的氨基酸合成酶使得它们不再应答于反馈抑制或使得它们的效率或利用率得以提高，可导致更高的代谢流量通过甲硫氨酸生产途径。上述这些用于增加或引入表1和2的蛋白质的量和/或活性的策略并非是限制性的；对这些策略加以改动对本领域人员而言将是显而易见的。对于减少或抑制或降低表1和域2的任何一种蛋白质的量或含量和/或活性，也有各种不同的策略。表1和/或2的内源性酶的表达例如可通过表达特异性结合这些基因的启动子序列的适体而调节。根据适体结合刺激性或阻抑性启动子区域，可增加或降低表1和域2的蛋白质的量以及活性。适体可被设计为能够特异性结合酶本身，并例如通过结合相应的酶的催化中心而降低酶的活性。适体的表达通常是通过基于载体的过表达而实现的(见上)，这一点以及适体的设计和选择均是本领域人员所熟知的(FamuIoketal.(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243:123-36)。此外，可通过本领域人员熟知的各种实验方法来降低表1和/或2的内源性酶的量和活性。这些方法通常被冠以如下名称"基因沉默"、"基因弱化"、"基因破坏"或"基因消除"。例如，可通过将前述的含有反义顺序的编码所述酶或其部分的DNA序列的载体转移至生物体如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中而使得内源性基因的表达沉默。这是基于如下事实，即这种载体在细胞内的转录可产生能够与从内源性基因转录而来的mRNA相杂交的RNA，并由此阻止其翻译。为了表达反义RNA，可选择能够在各种细胞类型中指导反义RNA分子持续表达的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子，或可选择能够指导反义RNA以组成型、组织或细胞类型特异性方式表达的调节序列。反义表达载体的形式可以是重组质粒、噬菌粒或弱化的病毒，其中在高效调节区域的控制下产生反义核酸，其活性可由载体被引入其中的细胞类型决定。对于使用反义基因来调节基因表达的讨论可参见WeintraubH.etai.(1985)TrendsinGenetics1(1):22-25。原则上，反义策略可与核酶方法联合。核酶是具有催化活性的RNA序列，当与反义序列联合时，其催化裂解耙序列(Tanneretal.(1999)FEMSMicrobiolRev.23(3):257-75)。这可增强反义策略的效力。在植物中，可通过RNA干扰或称为共抑制(co-suppression)的方法实现基因沉默。其他的方法是通过将RNA/DNA寡核苷酸引入生物体而在内源性基因中引入无义突变(Zhuetal.(2000)Nat.Biotechnol.18(5):555-558)或通过同源重组方式产生敲除突变体(Hohnetal.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96:8321-8323.)。为了产生同源重组微生物，制备含有编码表1或2的蛋白质的基因的至少一部分的载体，其中已经引入了缺失、添加或取代，由此改变(例如功能性破坏)所述内源性基因。优选地，内源性基因是谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌的基因，但其也可以是来自相关细菌或者甚至是来自酵母或植物的同系物。在一个实施方式中，所述载体被设计为使得在同源重组后，所述内源性基因被功能性破坏，即其不编码功能性的酶。这种载体也称为"敲除"载体。或者，所述载体被设计为使得在同源重组后，所述内源性基因被突变或被改变，但仍然编码功能性的蛋白质(例如可改变上游调节区域以便改变表1或2的内源性酶的表达)。在同源重组载体中，内源性基因中发生改变的部分在其5'和3'端侧翼具有额外的内源性基因的核酸序列，以便在载体携带的内源性基因与(微)生物体的内源性基因之间实现同源重组。所述额外的侧翼内源性核酸序列的长度足以与内源性基因成功进行同源重组。典型地，可在载体中纳入数百碱基至几千碱基的侧翼DNA(5'和3'端均有)(参见例如Thomas,K.R.,andCapecchi,M.R.(1987)Cell51(3):503-512和Schaferetal.(1994)Gene145:69-73，见同源重组载体的说明)。载体被引入微生物(例如通过电穿孔)，然后使用本领域已知的技术选择出其中所引入的基因与编码表1或2的蛋白质的内源性基因已经发生同源重组的细胞。在另一个实施方式中，宿主细胞内编码表1或2的蛋白质的内源性基因被破坏(例如通过同源重组或本领域已知的其他遗传学方法)，以至于不发生其蛋白质产物的表达。在另一个实施方式中，宿主细胞内编码表1或2的蛋白质的内源性基因或引入的基因通过一或多个点突变、缺失或倒位(iiwersion)而被改变，但仍编码功能性酶。仍在另一个实施方式，(微)生物体内编码表1或2的蛋白质内源性基因的一或多个调节区域(例如启动子、阻抑物或诱导物)被改变(例如通过缺失、截短、倒位、或点突变)，使得内源性基因的表达被调节。本领域人员可以理解，可使用本发明的方法容易地制备含有一种以上编码表1和2的蛋白质的基因和蛋白质修饰的宿主细胞，且这样的宿主细胞属于本发明的范围。此外，也可借助于特异性DNA结合元件(例如锌指转录因子类的元件)实现基因表达(但非基因过表达)。此外，可向细胞中引入抑制靶蛋白本身的元件。蛋白质结合元件可以是例如前述的适体(Famuloketal.(1999)CurrTopMicrobiolImmunol.243:123-36)。其在生物体内的表达能够降低表1或2的酶的量和/或活性的其他蛋白质结合元件可选自特异性抗体。可按照标准方案产生单克隆、多克隆、或重组的特异性抗体(GuidetoProteinPurification,Meth.Enzymol.182，pp.663-679(1990)，M.P.Deutscher,ed.)。文献也描述了抗体的表达(Fiedleretal.(1997)Immunotechnology3:205-216;MaynardandGeorgiou(2000)Annu,Rev.Biomed.Eng.2:339-76)。本领域人员熟知上述技术。因此，也熟知用于例如反义方法的核酸构建体必须具有的大小，以及相应的核酸序列必须具有怎样的互补性、同源性或相同性。术语"互补性"描述的是核酸分子与另一核酸分子通过两种互补碱基之间的氢键杂交的能力。本领域人员已知两种核酸分子为了能够彼此杂交并不需要一定具有100%的互补性。能够与另一种核酸序列杂交的核酸序列与所述另一种核酸序列的互补性分别为优选地至少40%、至少50%、至少60%、更优选地至少70%、特别优选地至少80%、更特别优选地至少卯％、尤其优选地至少95%和最优选地至少98或100%。反义序列与内源性mRNA序列的杂交典型地在体内细胞条件下发生或在体外发生。根据本发明，杂交在足以保证发生特异性杂交的严格性条件下在体内或体外进行。严格性体外杂交条件是本领域人员已知的，并可自文献获知(见例如Sambrooketal.，MolecularCloning,3rdedition2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。术语"特异性杂交"指的是如下情况，即在严格性条件下，分子优先与特定核酸序列结合，而该核酸序列是复杂的混合物，如DNA或RNA分子的混合物。因此，术语"严格性条件"指的是，在该条件下，核酸序列优先与互补性靶序列结合，而与其他序列不结合或至少结合程度明显降低。严格性条件取决于一些条件。较长的序列在更高温度发生杂交。通常，选择的严格性条件能够使得在给定的离子强度和给定pH值时，杂交温度比解链温度(Tm)低大约5°C。Tm是(在给定pH值、离子强度和给定核酸浓度条件下)与靶序列互补的分子中的50%与所述靶序列杂交时的温度。典型地，严格性条件包括0.01至1.0M钠离子(或其他盐的离子)之间的盐浓度以及pH值在7.0至8.3之间。对于短分子(例如对于包含10至50个核苷酸之间的分子)，该温度为至少30°C。此外，严格性条件可包括加入去稳定剂，如甲酰胺。典型的杂交和洗涤缓冲液具有如下组成。0.5%SDS5xSSC50mMNaP04,pH6.80.1。/。Na-焦磷酸盐5x登哈特试剂(Denhardt'sreagent)100ng鲑精^杂3^)^^预杂交溶液lxl06cpm/mL探针(5-10min95°C)2ftc51SC:3MNaCl0.3M拧檬酸钠49以HCl调至pH75ftc微特微.5gFicoll5g聚乙烯吡咯垸酮5g牛血清白蛋白加蒸馏水至500mL典型的杂交程序如下-.存透以lxSSC/0.1%SDS洗涤膜30min，65°C:^^^充'至少2h，50-55°C染充，55-60。C过夜洗絲,5min2xSSC/0.1%SDS杂交温度30min2xSSC/0.1%SDS杂交温度30minlxSSC/0.1%SDS杂交温度45min0.2xSSC/0.1%SDS65。C5minO.lxSSC室温术语"有义"和"反义"以及"反义方向(antisenseorientation)"均是本领域人员已知的。此外，本领域人员己知用于反义方法的核酸分子所必须具有的长度，以及它们与其靶序列所必须具有的同源性或互补性。因此，本领域人员也知道用于基因沉默方法的核酸分子所必须具有的长度。以反义为目的，互补性序列长度超过IOO个核苷酸、80个核苷酸、60个核苷酸、40个核苷酸、和20个核苷酸即可以是足够的。更长的核苷酸长度当然也是足够的。上述方法的组合应用也是可以的。根据本发明，如果使用以5'-3'-方向可操纵地连接于在生物体内有活性的启动子的DNA序列，则通常所构建的载体在转移到所述生物体的细胞内之后，可实现编码序列的过表达，或分别引起内源性核酸序列的抑制或竞争和阻断由其表达的蛋白质。也可通过在生物体内过表达非功能性突变体而降低特定酶的活性。因此，不能催化有关反应、但能够结合例如底物或辅因子的非功能性突变体，经过表达后，可与内源性酶竞争并抑制反应。降低宿主细胞内酶的量和/或活性的其他方法是本领域人员已知的。本发明的另一个方面涉及载体，优选地是表达载体，其含有编码表1或2的一种蛋白质的核酸(或其部分)或其组合。在本发明中，术语"载体"指的是核酸分子，其能够转运与其相连接的其他核酸。一种类型的载体是"质粒"，其指的是一种环状双链DNA环，其中可连接额外的DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将额外的DNA区段连接到病毒基因组内。某些载体在所引入的宿主细胞中能够自我复制(例如具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物细胞载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物细胞载体)在引入宿主细胞后整合到宿主基因组中，并随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操纵地连接的基因的表达。此类载体在此称为"表达载体"。通常，重组DNA技术所用的表达载体一般是质粒的形式。在本说明书中，"质粒"和"载体"可互换使用，因为质粒是最为常用的载体形式。不过，本发明也包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们可发挥相同的功能。本发明的重组表达载体可包含编码表1或2的蛋白质之一的核酸，其形式适合于在宿主细胞中表达相应的核酸，这意味着所述重组表达载体包括可操作地连接于待表达核酸序列的一或多个基于进行表达所用的宿主细胞而选择的调节序列。在重组表达载体中，"可操作地连接"指的是感兴趣的核苷酸序列与调节序列连接的方式允许核苷酸序列被表达(例如在体外的转录/翻译系统或术语"调节序列"意欲包括启动子、阻抑物结合位点、活化物结合位点、增强子和其他表达控制元件(如终止子、腺苷酸化信号、或mRNA二级结构的其他元件)。此类调节序列例如可参见Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)。调节序列包括那些在许多宿主细胞类型中指导核苷酸序列组成型表达的调节序列以及那些仅在特定宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列。优选的调节序列例如为，启动子如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、laclq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、arny、SP02、e-Pp-orePL、sod、ef-tu、groE，它们优选地在细菌中使用。额外的调节序列例如为，来自于酵母和真菌的启动子，如ADC1、MFa、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH，来自于植物的启动子，如CaMV/35S、SSU、OCS、lib4、usp、STLSl、B33、nos或遍在蛋白-或菜豆蛋白-启动子。也可以使用人工启动子。本领域人员能够理解，表达载体的设计取决于一些因素，例如所选择的待转化的宿主细胞、蛋白质的期望表达水平等等。本发明的表达载体可被引入到宿主细胞中以便产生由编码表1和/或2的酶的核酸所编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或融合肽。本发明的重组表达载体可被设计用于在原核细胞或真核细胞中表达表l和/或2的酶。例如，表1和/或2的酶的基因可表达于细菌细胞如谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌；昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)；酵母和其他真菌细胞(见Romanos，M.A.etal.(1992)Yeast8:423-488;vandenHondel，C.A.M.J.丄etal.(1991)in:MoreGeneManipulationsinFungi,J.W.Bennet&L.L.Lasure,eds.,p.396-428:AcademicPress:SanDiego;vandenHondel,C.A.M.J.J.&Punt,P.J.(1991)in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,Peberdy,J.F.etal"eds.，p.1-28,CambridgeUniversityPress:Cambridge);藻类和多细胞植物细胞(见Schmidt,R.andWillmitzer，L.(1988)PlantCellR印.(7):583-586)。合适的宿主细胞可进一步参见Goeddel，GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(19卯)。或者，可在体外转录和翻译重组表达载体，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。在原核细胞中表达蛋白质最常见地是使用含有指导融合蛋白或非融合52蛋白的表达的组成型或诱导型启动子而进行。融合载体给插入的核酸序列所编码的蛋白质添加一些氨基酸，通常是在重组蛋白质的氨基端，但也可以在c端或蛋白质内部的合适区域。此类融合载体典型地用于3个目的1)增加重组蛋白质的表达；2)增加重组蛋白质的可溶性；和3)通过提供用于亲和纯化的配体而有助于重组蛋白质的纯化。在融合表达载体中，通常在融合部分与重组蛋白质的连接处引入蛋白酶裂解位点，以便在融合蛋白被纯化后使重组蛋白质与融合部分分离。此类酶及其同种识别序列(cognaterecognitionsequences)包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pQE(Qiagen)、pGEX(PharmaciaBiotechInc;Smith,D.B.andJohnson,K,S.(1988)Gene67:31-40)、pMAL(NewEnglandBioabs，Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，它们分别融合谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、或蛋白A。谷氨酸棒杆菌载体的实例可参见HandbookofCorynebacterium2005Eggeling，L.Bott,M.,eds"CRCpressUSA。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amannetal.(1988)Gene69:301-315)、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、prN-III113-Bl、egtll、pBdCl、和pETlld(Studieretal.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego，California(1990)60-89;Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkISBN0444904018)。来自pTrc载体的耙基因表达依赖于宿主RNA聚合酶自杂交trp-lac融合启动子转录。来自pETlld载体的靶基因表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gnl)介导的自T7gnlO-lac融合启动子的转录。该病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从携带置于lacUV5启动子转录控制下的T7gnl基因的常驻X原噬菌体提供。对于其他种类细菌的转化，可选择合适的载体。例如，已知质粒pIJlOl，pIJ364,pIJ702和pIJ361可用于转化链霉菌，而质粒pUBllO、pC194、或pBD214适合用于转化芽孢杆菌。一些用于将遗传信息转移至棒杆菌内的质粒包括pHM1519、pBLl、pSA77、或pAJ667(Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkIBSN0444904018)。53最大化重组蛋白质表达的一个策略是在对所述重组蛋白质的蛋白酶裂解方面能力受损的宿主细菌中表达该蛋白(Gottesman，S.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185，AcademicPress,SanDiego,California(19卯)119-128)。另一种策略是改变待插入至表达载体内的核酸的核酸序列，使得各种氨基酸的各密码子在选定用于表达的细菌如谷氨酸棒杆菌内是被优先使用的密码子(Wadaetal.(1992)NucleicAcidsRes.20:2111-2118)。可采用标准的DNA合成技术进行本发明的核酸序列的这种改变。在另一个实施方式中，蛋白质表达载体是酵母表达载体。用于在酵母(酿酒酵母)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari，etal,(1987)EmboJ.6:229-234)、2i、pAG-l、Yep6、Yepl3、pEMBLYe23、pMFa(KurjanandHerskowitz(1982)Cell30:933-943)、pJRY88(Schultzetal.(1987)Gene54:113-123)、禾npYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,CA)。用于构建适合用于其他真菌例如丝状真菌中的载体的载体和方法可详见，例如vandenHondel，C.A.M.丄J.&Punt，P.J.(1991)in:AppliedMolecularGeneticsofFungi,J.F.Peberdy,etal.，eds"p.1-28,CambridgeUniversityPress:Cambridge禾卩Pouwelsetal.，eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYork(ISBN0444904018)。在另一个实施方式中，表1和2的蛋白质可在单细胞植物细胞(例如藻类)或来自高等植物的植物细胞(如种子植物例如谷物植物)中表达。植物表达载体的实例可详见，例如Beckeretal.(1992)PlantMol.Biol.20:1195-1197;和Bevan,M.W.(1984)Nucl.Acid.Res.12:8711-8721，并包括pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、禾口pDH51(Pouwelsetal"eds.(1985)CloningVectors.Elsevier:NewYorkISBN0444904018)。用于原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统可参见Sambrook，J.etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual.3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2003的16和17章。在另一个实施方式中，重组表达载体能够指导核酸优先在多细胞生物体的特定细胞类型中表达，如在植物细胞中(例如使用组织特异性调节元件来表达所述核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。本发明的另一方面涉及其中引入了本发明的重组表达载体的生物体或宿主细胞。术语"宿主细胞"和"重组宿主细胞"在此可互换使用。要理解这些术语不仅指特定的所研究的细胞，也指这种细胞的子代或者潜在的子代。由于在传代过程中因突变或者环境影响会出现某些改变，因此子代实际上可以与亲代细胞不完全相同，但其仍包括在这里所用术语的范围内。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，表l和/或2的蛋白质可表达于细菌细胞如谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或植物。其他合适的宿主细胞是本领域人员已知的。可通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核细胞或真核细胞。在本发明中，术语"转化"和"转染"、"接合(conjugation)"和"转导"指的是用于将外来核酸(例如线性DNA或RNA，例如线性化的载体或无载体的基因构建体本身)或载体形式的核酸(例如质粒、噬菌体、噬菌粒、转座子或其他DNA)引入宿主细胞内的多种现有技术中已知的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂染、天然感受态、化合物介导的转移、或电穿孔。合适的转化或转染宿主细胞的方法可参见Sambrook,etal.(MolecularCloning:ALaboratoryManual.3rded"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2003)。在本发明中，"坎贝尔插入(Campbellin)"指的是初始宿主细胞的转化体，其中通过单次同源重组事件(交换进来事件(cross-inevent))将完整的环状双链DNA分子(例如质粒)整合到染色体中，这有效地导致线性化形式的所述环状DNA分子插入到染色体中与所述环状DNA分子的第一DNA序列同源的第一DNA序列中。该名称来自阿兰'坎贝尔教授(AlanCampbell),其最先提出了这种重组方式。"被坎贝尔插入(Campbelledin)"指的是己经被整合到"坎贝尔插入"转化体的染色体中的线性化的DNA序列。"坎贝尔插入"含有双份的第一同源DNA序列，其中每一拷贝包括并跨越一个拷贝的同源重组交换点。在本发明中，"坎贝尔删除(Campbellout)"指的是来自"坎贝尔插入"转化体的子代细胞，其中在"被坎贝尔插入"DNA的线性化插入体DNA中所含的第二DNA序列与染色体中与所述线性化插入体的第二DNA序列同源的第二DNA序列之间发生了第二同源重组事件(交换出去事件(cross-outevent)),该第二重组事件导致所整合的DNA序列的一部分发生缺失(丢弃)，但重要的是，这还导致所整合的"被坎贝尔插入"DNA的一部分(其可以甚至仅仅为一个碱基)留在染色体中，这样一来，与初始宿主细胞相比，所述"坎贝尔删除"细胞在染色体中便含有一或多个故意的变化(例如，单碱基取代、多碱基取代、插入异源基因或DNA序列、插入额外一或多拷贝的同源基因或修饰的同源基因、或插入包含一种以上的如上所述的实例的DNA序列)。"坎贝尔删除"细胞或菌株通常(但并非必然)是通过针对"被坎贝尔插入"DNA序列的一部分(希望丢弃的那部分)中所含的基因进行反选择而获得的，例如枯草芽孢杆菌^W基因，当细胞培养于存在5%至10%的蔗糖条件下时，该基因的表达对细胞是致死性的。无论是否进行反选择，均可使用任何可筛选表型通过筛选而获得或鉴定出所需的"坎贝尔删除"细胞，所述可筛选表型例如但不限于，集落形态、集落颜色、是否存在抗生素抗性、通过聚合酶链反应检测是否存在给定的DNA序列、是否存在营养缺陷型、是否存在某种酶、集落核酸杂交、抗体筛选等等。术语"坎贝尔插入"和"坎贝尔删除"也可用作不同时态的动词来指代上述的方法或过程。要理解导致"坎贝尔插入"或"坎贝尔删除"的同源重组事件可出现在同源DNA序列内的一系列DNA碱基上，且由于同源序列在该一系列DNA碱基的至少一部分上彼此相同，因此通常不可能精确地指出交换事件的发生之处。换言之，不可能精确地指出哪一序列最初是来自插入的DNA的，而哪一序列最初是来自染色体DNA的。此外，所述第一同源DNA序列和第二同源DNA序列通常由部分非同源性区域间隔开，而正是该非同源性区域仍然留在"坎贝尔删除"细胞的染色体中。实践中，在谷氨酸棒杆菌中，典型的第一和第二同源DNA序列的长度通常为至少约200个碱基对，并可多达数千碱基对。不过，更短或者更长的序列也可用于该过程。例如，第一和第二同源序列的长度可在约500至2000个碱基的范围，并且将第一和第二同源序列设置为大致相同的长度，优选地使它们的差异小于200个碱基对，且最优选地使两者中较短者的碱基对长度至少是较长者长度的70%，将有利于自"坎贝尔插入"获得"坎贝尔删除"。为了鉴定并选择这些整合体，通常将编码选择标记物(如抗生素抗性)的基因随感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记物包括那些赋予药物抗性的标记物，所述药物例如为卡那霉素、氯霉素、四环素、G418、潮霉素和甲氨蝶呤。可将编码选择标记物的核酸分子置于编码表1和/或2的蛋白质的同一载体中引入宿主细胞，或可以将其置于另外的载体中引入。稳定转染了引入的核酸的细胞可通过药物筛选得以鉴定(例如，已经引入了选择标记物基因的细胞能够存活，但其他细胞则会死亡)。在另一个实施方式中，可产生含有如下系统的重组微生物，所述系统能够增强表达选定的和/或引入的基因。在高GC生物体如谷氨酸棒杆菌中改变并增强基因表达的实例可参见WO2005/059144、WO2005/059143和WO2005/059093。在另一个实施方式中，可产生含有如下的选定系统的重组微生物，所述选定系统能够实现所引入的基因的受控表达。例如，将载体中的表1或2的基因置于lac操纵子的控制下，这使得仅当存在IPTG的情况下基因发生表达。此类调控系统是本领域熟知的。在一个实施方式中，本发明的方法还包括自培养基或宿主细胞中分离甲硫氨酸。前面已经描述了适合用于本发明的方法的培养基。如果使用遗传学修饰的微生物，可以使用标准培养基，其可以是富含丝氨酸的。如果使用野生型微生物，其必须培养在富含丝氨酸的培养基中以实现发明的效果。用生长于琼脂板、例如己经在30°C孵育过的CM板(10g/L葡萄糖、2.5g/LNaCl、2g/1尿素、10g/L多蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L肉提取物、22g/L琼脂，以2MNaOH调至pH6.8)上的细胞接种于培养基使得OD600为0.5-1.5。既可通过加入来自CM板的细菌细胞盐水悬液也可通过加入细菌的液体预培养物而实现培养基接种过程。培养温度应该在15。C至45。C范围内。实验过程中的温度可保持恒定或可以改变。培养基的pH可在5至8.5范围内，优选地在7.0附近，并可通过向培养基加入缓冲液而维持pH。用于此目的的抑制示例性缓冲液是磷酸钾缓冲液。合成缓冲物如MOPS、HEPES、ACES等可替代使用或同时使用。也可在生长过程中通过加入NaOH或NHUOH来维持稳定的培养pH值。如果使用复杂培养基成分如酵母提取物，则不必使用额外的缓冲物，因为其中许多复杂化合物具有高缓冲能力。如果使用发酵罐培养微生物，也可用气态氨来控制pH。培养时间通常为数小时至数日。时间的选择是为了使得最大量的产物积聚在肉汤中，但不会使得微生物的聚集密度过高而导致细胞死亡。可在多种容器中实施所述生长实验，例如微滴定板、玻璃管、玻璃瓶或不同体积的玻璃或金属发酵罐。为了筛选大量克隆，微生物应该培养在微滴定板、玻璃管、或摇瓶中，有无挡板均可。优选地，使用100mL摇瓶，其中加入10%(体积比)的所需生长培养基。培养瓶应该在旋转摇床上摇动(幅度25mm)，速度在100rpm至300rpm。可通过保持湿环境而消除蒸发损失；或者，应该对蒸发损失进行数学校正。如果要测试遗传学修饰的克隆，则也应该测试未修饰的对照克隆或者只含有基本质粒而无任何插入体的对照克隆。培养后，通过在保证细菌完好无损的条件下进行离心收集细菌。可通过添加酸或碱来处理发酵后的肉汤以获得合适的pH值，使得甲硫氨酸可结合于由阴离子或阳离子交换基质组成的基质。或者或除前述措施以外，可通过蒸发或者冷却至20-0。C之间的温度而浓缩含有或不含有生物量的肉汤。在这些条件下，发酵肉汤中的甲硫氨酸可结晶，因为在pH值为3至9之间的水中，甲硫氨酸的溶解度很低并依赖于溶剂的温度。或者或除上述措施以外，可通过例如喷雾干燥或其他干燥方法来干燥积聚在肉汤中的含有或不含有生物量的甲硫氨酸。在所有这些情况下，制备出的物质可含有重量比为5-99%的甲硫氨酸、优选地重量比为15-99%的甲硫氨酸、更优选地重量比为30-99%的甲硫氨酸、甚至更优选地重量比为50-99%的甲硫氨酸、以及最优选地重量比为70-99%的甲硫氨酸。尽管在此结合谷氨酸棒杆菌和L-甲硫氨酸的产生描述了本发明，但应该指出的是，本发明也可用于其他微生物以及用于产生其他氨基酸。此外，应该指出的是，"包含"并不排除任何其他元素或步骤，且"一"并不排除复数。此外，应该指出的是，参照上述实施方式之一所描述的特征或步骤也可与上述其他实施方式的其他特征或步骤组合使用。以下通过实施例进一步阐述本发明，这些实施例不能理解为是限制性的。本申请所引用的所有参考文献、专利申请、专利、公开的专利申请、表格、附录以及序列均通过引用并入本申请。58实施例菌抹谷氨酸棒杆菌ATCC13032(野生型)来自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA,USA)。MbcR的敲除突变体是如下构建的谷氨酸棒杆菌M1840是衍生自野生型ATCC13032的AMcbR菌株(Reyetal.,2003，见上)。以质粒pH430(SEQIDNo.l)转化ATCC13032并"被坎贝尔插入"以产生"坎贝尔插入"菌株。"坎贝尔插入"菌株随后"被坎贝尔删除(Campbelledout)"以产生"坎贝尔删除"菌株M1840,其具有McbR基因的缺失。培养基M1840培养在CG121/2基本培养基中。该培养基是通过混合不同储存溶液(溶液l-8)而制备的。溶液l:25.0g葡萄糖力口100mlH2O，高压灭菌溶液2:4.0gKH2PO416.0gK2HPO4以NaOH调节pH至7.0，加695mlH20，高压灭菌溶液3:10.0g(NH4)2SO4以NaOH调节pH至7.0，j^200mlH2O,高压灭菌溶液4:2.5gMgS04x7H20加10mlH2O，过滤溶液5:0.1gCaCl2加10mlH2O，过滤溶液6:0.3g3，4-二羟苯甲酸以NaOH调节pH至12.0，力卩10mlH20，过滤59溶液7:50pi维生素B12(储存液100pg/ml)0.015g硫胺素10pl磷酸吡哆醛(储存液:0.1mg/ml)5ml生物素(储存液1mg/ml)加50mlH20，过滤溶液8:0.5gFeSO4x7H2O0.5gMnS04xH200.1gZnS04x7H20500piCuS04x5H20(储存液0.02g/ml)50pilNiCl2x6H20(储存液0.02g/ml)50)ilNa6Mo7024x2H20(储存液0.02g/ml)以HCl调节pH至l，加50mlH20，过滤通过混合80ml的溶液1、695ml的溶液2、200ml的溶液3、和各1ml的溶液4至8，制备1L的CG12W基本培养基。此外，加入20ml无菌水。对于富含丝氨酸的培养基，在CG12K基本培养基中加入10mM丝氨酸。培养条件细胞培养于板中，30°C。预培养物在含有25mL丰富液体培养基的带挡板的250mL摇瓶中生长过夜。离心(2min,10000g,4。C)收集细胞，以0.9%NaCl洗漆两次，用于接种CG12!/2基本培养基，进行第二预培养。如上所述收集第二预培养物，用作在CG12^基本培养基中进行的主培养的起始物。在对数生长期的后期收集细胞。其他实验在含50mL培养基的带挡板的500mL摇瓶中在旋转摇床上进行(250rpm,30°C,摇动半径2.5cm)。细胞提取和氣基睃走量如前所述提取细胞(Wittmannetal.(2004)Anal.Biochem.327:135-139)。通过HPLC(Agilent1100，Waldbronn，Germany)定量甲硫氨酸。分析前使用分析天平对所有样品以225的a-氨基丁酸水溶液进行1:10稀释。a-氨基丁酸作为定量的内对照。使用荧光检测器(340nm激发波长，450nm发射波长；Agilent,Waldbronn,Germany)检测氨基酸。为此，以o-酞二醛进行柱前衍生化(Roth(1971)Anal.Chem.43:880-882)。结果在基本培养基中加入丝氨酸后，细胞内甲硫氨酸浓度从生长在非富集培养基中细胞的0.42i,g/干物质，升高至生长在富集丝氨酸的培养基中细胞的0.71±().12g/干物质。S叫IDNo.1:>pH430tcg3gctctccaatctccactg鄉tectteatccttccgggg3attcgggcgctt犯atcg3ga城鄉cc3tcEiccttttaataacaatacaatgaataattggaataggtcgacacctttggagcggagccggttaaaattggcagcattcaccgaaagaaaaggagaaccacatgcttgccctaggttggattacatggatcattattggtggtctagctggttggattgcctccaagattaaaggcactgatgctcagcaaggaattttgctgaacatagtcgtcggtattatcggtggtttgttaggcggctggctgcttggaatcttcggagtggatgttgccggtggcggcttgatcttcagcttcatcacatgtctgattggtgctgtcattttgctgacgatcgtgcagttcttcactcggaagaagtaatctgctttaaatccgtagggcctgttgatatttcgatatcaacaggccttttggtcattttggggtggaaaaagcgctagacttgcctgtggattaaaactatacgaaccggtttgtctatattggtgttagacagttcgtcgtatcttgaaacagaccaacccgaaaggacgtggccgaacgtggctgctagctaatccttgatggtggacttgctggatctcgattggtccacaacatcagtcctcttgagacggctcgcgatttggctcggcagttgttgtcggctccacctgcggactactcaatttagtttcttcattttccgaaggggtatcttcgttgggggaggcgtcgataagccccttctttttagctttaacctcagcgcgacgctgctttaagcgctgcatggcggcgcggttcatttcacgttgcgtttcgcgcctcttgttcgcgatttctttgcgggcctgttttgcttcgttgatttcggcagtacgggttttggtgagttccacgtttgttgcgtgaagcgttgaggcgttccatggggtgagaatcatcagggcgcggtttttgcgtcgtgtccacaggaagatgcgcttttctttttgttttgcgcggtagatgtcgcgctgctctaggtggtgcactttgaaatcgtcggtaagtgggtatttgcgttccaaaatgaccatcatgatgattgtttggaggagcgtccacaggttgttgctgacgcgtcatatgactagttcggacctagggatatcgtcgacatcgatgctcttctgcgttaattaacaattgggatcctctagacccgggatttaaatcgctagcgggctgctaaaggaagcggaacacgtagaaagccagtccgcagaaacggtgctgaccccggatgaatgtcagctactgggctatctggacaagggaaaacgcaagcgcaaagagaaagcaggtagcttgcagtgggcttacatggcgatagctagactgggcggttttatggacagcaagcgaaccggaattgccagctggggcgccctctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactggatggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatgattgaacaagatggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggagaggctattcggctatgactgggcacaacagacaatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcgcggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctgccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatgcggcggctgcatacgcttgatccggctacctgcccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagcatcaggggctcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggctacccgtgatattgctgaagagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacggtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttCtg3gcgggactctggggttcg3aatg3ccgacca3gcgacgccca3cctgccatcacg3gatttcgattcc3ccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctgg3gttcttcgccc3cgctEigcggcgcgccggccggcccggtgtg幼ataccgc3c鄉tgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgc3cg犯ccccccgttc3gcccg3ccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtcca3cccggt犯g3cacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaaggccggccgcggccgccatcggcattttcttttgcgtttttatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatgctgtctttgacaacagatgttttcttgcctttgatgttcagcaggaagctcggcgcaaacgttgattgtttgtctgcgtagaatcctctgtttgtcatatagcttgtaatcacgacattgtttcctttcgcttgaggtacagcgaagtgtgagtaagtaaaggttacatcgttaggatcaagatccatttttaacacaaggccagttttgttcagcggcttgtatgggccagttaaagaattagaaacataaccaagcatgtaaatatcgttagacgt3atgccgtc肌tcgtca臓gatccgcggg3gtC3gtg幼caggteccatttgccgttcattttEiaagacgttcgcgcgttcaatttcatctgttactgtgttagatgcaatcagcggtttcatcac加ttcagtgtgtaatcatcgtttagctcaatcataccgagagcgccgtttgctaactcagccgtgcgttttttatcgctttgcagaagtttttgactttcttgacggaagaatgatgtgcttttgccatagtatgctttgttaaataaagattcttcgccttggtagccatcttcagttccagtgtttgcttcaaatactaagtatttgtggcctttatcttctacgtagtgaggatctctcagcgtatggttgtcgcctgagctgtagttgccttcatcgatgaactgctgtacattttgatacgtttttccgtcaccgtcaaagattgatttataatcctctacaccgttgatgttcaaagagctgtctgatgctgatacgttaacttgtgcagttgtcagtgtttgtttgccgtaatgtttaccggagaaatcagtgtagaataaacggatttttccgtcagatgtaaatgtggctgaacctgaccattcttgtgtttggtcttttaggatagaatcatttgcatcgaatttgtcgctgtctttaaagacgcggccagcgtttttccagctgtcaatagaagtttcgccgactttttgatagaacatgtaaatcgatgtgtcatccgcatttttaggatctccggctaatgcaaagacgatgtggtag63<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>权利要求1、在微生物中制备L-甲硫氨酸的方法，包括以下步骤-培养所述微生物，其中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的；和-分离L-甲硫氨酸。2、权利要求1的方法，其中所述微生物在富含丝氨酸的培养基中培养。3、权利要求2的方法，其中添加到所述培养基中的丝氨酸的浓度为O.lmM至lOOmM，优选地为1至50mM，更优选地为5mM至20mM，且最优选地丝氨酸的浓度为10mM。4、前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面被遗传学修饰。5、权利要求4的方法，其中一或多种参与丝氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。6、权利要求4或5的方法，其中所述参与丝氨酸合成的酶选自D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)。7、权利要求5或6的方法，其中所述参与丝氨酸合成的酶被修饰以降低或防止L-丝氨酸的反馈抑制。8、权利要求7的方法，其中所述被反馈抑制的酶是D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)。9、前述权利要求中任一项的方法，其中一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。10、权利要求9的方法，其中编码所述参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的基因被破坏且优选地被消除。11、权利要求9或10的方法，其中所述酶是丝氨酸脱水酶(sdaA)。12、前述权利要求中任一项的方法，其中一或多种参与丝氨酸输出的蛋白质的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。13、权利要求12的方法，其中编码所述参与丝氨酸输出的蛋白质的基因被破坏且优选地被消除。14、权利要求12或13的方法，其中所述蛋白质是ThrE。15、前述权利要求中任一项的方法，其中一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。16、权利要求15的方法，其中所述参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶选自丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)。17、前述权利要求中任一项的方法，其中一或多种参与甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。18、权利要求17的方法，其中所述参与甲硫氨酸合成的酶选自天冬氨酸激酶(lysC)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸-O-乙酰转移酶(MetA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)。19、前述权利要求中任一项的方法，其中一或多种转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。20、权利要求19的方法，其中所述转录调节物蛋白是McbR。21、前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物选自棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌科、沙门氏菌、大肠杆菌C^c/zen'c/^co//)、志贺氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌和假单胞菌。22、权利要求21的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌(C07"e6acten'wwg/wtofwz'cww)、大肠杆菌、或枯草芽孢杆菌(5a"'〃"s23、前述权利要求中任一项的方法，其中L-甲硫氨酸于培养基或所述微生物的细胞中浓縮。24、自发酵肉汤中制备含L-甲硫氨酸的饲料添加剂的方法，包括以下步骤-培养所述微生物，其中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的；-自含L-甲硫氨酸的发酵肉汤中除去水；-除去0至100^.-%的发酵过程中形成的生物量；和-干燥所述发酵肉汤以获得粉状或颗粒状的动物词料添加剂。25、权利要求24的方法，其中所述微生物在富含丝氨酸的培养基中培养。26、权利要求25的方法，其中添加到所述培养基中的丝氨酸的浓度为0.1mM至100mM，优选地为1至50mM，更优选地为5mM至20mM，以及最优选地丝氨酸的浓度为10mM。27、权利要求24至26中任一项的方法，其中所述微生物在参与丝氨酸代谢或转运的蛋白质方面被遗传学修饰。28、权利要求27的方法，其中一或多种参与丝氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。29、权利要求27或28的方法，其中所述参与丝氨酸合成的酶选自D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)。30、权利要求28或29的方法，其中所述参与丝氨酸合成的酶被修饰以降低或防止L-丝氨酸的反馈抑制。31、权利要求30的方法，其中被反馈抑制的酶是D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)。32、权利要求24至31中任一项的方法，其中一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。33、权利要求32的方法，其中编码所述参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的基因被破坏且优选地被消除。34、权利要求32或33的方法，其中所述酶是丝氨酸脱水酶(sdaA)。35、权利要求24至34中任一项的方法，其中一或多种参与丝氨酸输出的蛋白质的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。36、权利要求35的方法，其中编码所述参与丝氨酸输出的蛋白质的基因被破坏且优选地被消除。37、权利要求35或36的方法，其中所述蛋白质是ThrE。38、权利要求24至37中任一项的方法，其中一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。39、权利要求38的方法，其中所述参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶选自丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)。40、权利要求24至39中任一项的方法，其中一或多种参与甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的。41、权利要求40的方法，其中所述参与甲硫氨酸合成的酶选自天冬氨酸激酶(lysC)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸-O-乙酰转移酶(MetA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)。42、权利要求24至41中任一项的方法，其中一或多种转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。43、权利要求42的方法，其中所述转录调节物蛋白是McbR。44、权利要求24至43中任一项的方法，其中所述微生物选自棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌科、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌和假单胞菌。45、权利要求44的方法，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌,或枯草芽孢杆菌。46、超量产生L-甲硫氨酸的微生物，其中-一或多种参与丝氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多种参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的；和减-一或多种参与丝氨酸输出的蛋白质的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的；禾口/或-一或多种参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；且其中-一或多种参与甲硫氨酸合成的酶的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是升高的；和/或-一或多种转录调节物蛋白的含量和/或生物学活性与野生型微生物相比是降低的。47、权利要求46的微生物，其中所述参与丝氨酸合成的酶选自D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)、磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)和磷酸丝氨酸氨基转移酶(SerC)。48、权利要求46或47的微生物，其中所述参与丝氨酸合成的酶被修饰以降低或防止L-丝氨酸的反馈抑制。49、权利要求46至48中任一项的微生物，其中所述参与丝氨酸降解为丙酮酸的酶是sdaA。50、权利要求46至49中任一项的微生物，其中所述参与丝氨酸输出的蛋白质是ThrE。51、权利要求46至50中任一项的微生物，其中所述参与将丝氨酸转化为甲基四氢叶酸的酶选自丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)和亚甲基四氢叶酸还原酶(MetF)。52、权利要求46至51中任一项的微生物，其中所述参与甲硫氨酸合成的酶选自天冬氨酸激酶(lysC)、高丝氨酸脱氢酶(hom)、高丝氨酸-O-乙酰转移酶(MetA)、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetZ)、钴胺素(I)依赖性甲硫氨酸合酶I(MetH)和钴胺素(I)非依赖性甲硫氨酸合酶II(MetE)。53、权利要求46至52中任一项的微生物，其中所述转录调节物蛋白是McbR。54、权利要求46至53中任一项的微生物，其中所述微生物选自棒状细菌、分枝杆菌、链霉菌科、沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、沙雷氏菌和假单胞菌。55、权利要求54的微生物，其中所述微生物是谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌、或枯草芽孢杆菌。56、权利要求46至55中任一项的微生物在生产L-甲硫氨酸中的用途。全文摘要本发明涉及高效制备L-甲硫氨酸的微生物和方法。具体地，本发明所涉及的方法中可被所述微生物的代谢所利用的丝氨酸的量是增加的。文档编号C12P13/12GK101454460SQ200780018641公开日2009年6月10日申请日期2007年5月24日优先权日2006年5月24日发明者A·黑罗尔德,C·克洛普罗格,C·维特曼,E·海因茨勒,H·施罗德,J·佩罗,J·克勒默,M·威廉斯,O·泽尔德,R·优卡姆,T·帕特松,T·赫尔曼申请人:赢创德固赛有限责任公司