专利名称：向母牛提供生物可利用甲硫氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及向母牛提供生物可利用甲硫氨酸的方法，包括给予母牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸及其盐的羟基类似物的酯。本发明还涉及改善乳牛生产的牛奶的方法，具体说该方法包括向乳牛提供甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸及其盐的羟基类似物的酯。
蛋白质是奶牛饲料中的主要营养成分。但事实上奶牛不需要蛋白质，它们需要特定的氨基酸，这些氨基酸是构成它们自身蛋白质的基本成分。
已知甲硫氨酸是一种限制性氨基酸且对产奶特别重要，因为认为甲硫氨酸水平的良好平衡将导致有效的产奶水平。还认为甲硫氨酸水平的增加将增加产奶量。
最好能维持或提高甲硫氨酸的水平。可直接将甲硫氨酸加入母牛的饲料中。然而这种游离形式的氨基酸将被瘤胃中的细菌迅速降解，结果只有极小部分的甲硫氨酸能进入血流。已作了许多尝试来克服此问题，通常将甲硫氨酸以保护或修饰形式掺入饲料，以使此化合物通过瘤胃而不受破坏。然后从保护或修饰形式释放出的甲硫氨酸进入小肠，吸收入血流中。用于该特殊目的研究最广泛的一种化合物是甲硫氨酸的羟基类似物，称为2—羟基—4(甲硫)丁酸，通常称为HMB。
1999年2月4日出版的WO99/04647公开了一种通过添加甲硫氨酸羟基类似物的饲料而将甲硫氨酸引入瘤胃的方法。该专利申请声称在通过瘤胃过程中，羟基类似物基本不受瘤胃降解的破坏，从而至少20％，较佳地是至少40％羟基类似物能通过小肠吸收进入血流中。该专利申请涉及到羟基类似物、其盐、酯、酰胺和寡聚物“绕过瘤胃被吸收”，并声称这是一种将甲硫氨酸引入奶牛血流效果改进的方法。此文献公开的化合物所声称的优点是能绕过瘤胃在小肠中吸收。
也有许多关于甲硫氨酸羟基类似物效果的出版物，Charles Schwab的出版物(在1998年5月会议上提供)评论了所有这些出版物，结论如下认为甲硫氨酸的羟基类似物只有以60g以上/天/奶牛的剂量，较佳地以90g以上/天/奶牛的剂量给予，才能绕过瘤胃被小肠吸收。在较低的剂量时，该作者认为甲硫氨酸的羟基类似物看来大多被瘤胃中的微生物消耗了。
测定甲硫氨酸羟基类似物吸收的最佳方法是测定血液中的生物利用率。生物利用率是将血液中存在的甲硫氨酸水平与掺入饲料中化合物的甲硫氨酸的量相比得到的。这种测定考虑了羟基类似物通过瘤胃的情况、消化输送过程中各自吸收部位的吸收程度和羟基类似物酶促转化成甲硫氨酸的程度。该文说道当剂量为每天每只母牛50g量甲硫氨酸时，用聚合物保护了甲硫氨酸抗瘤胃降解，特别是以商品名SmartamineTM出售的产品，共90％绕过了瘤胃；而羟基类似物的生物可利用率仅为3％。
J Dairy在1988，71第3292到3301页一文中公开了将甲硫氨酸羟基类似物的甲酯或乙酯掺入母牛的饲料，试图增加牛奶的质量。该研究结果表明这些酯迅速转化成甲硫氨酸的羟基类似物，随后在奶牛的瘤胃中被降解。具体说，在瘤胃液中培育6小时后，羟基类似物的甲酯和乙酯仅分别残留1.8％和3％。这分别相当于34％和85％的甲硫氨酸和甲硫氨酸羟基类似物。
现在我们发现与上述现有技术相比，某些甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸羟基类似物对母牛有良好效果。我们惊人地发现，与本领域先前所知的相比，一些化合物能更高效和更迅速地将甲硫氨酸引入瘤胃血流。我们还发现这些特定的化合物不会通过瘤胃旁路进入血流和肠吸收，而是通过瘤胃壁吸收。我们还发现将这种特殊的酯类化合物掺入奶牛的饲料中，结果理想地改善了牛奶的产量。
本发明提供了一种向奶牛供给生物可利用甲硫氨酸的方法，该方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
对于本发明的目的而言，母牛指牛，即称为肉用母牛和奶牛。
具体地说，本发明提供一种给予母牛生物可利用甲硫氨酸的方法，该方法包括给予母牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的分支烷基酯和/或甲硫氨酸羟基类似物的分支烷基酯。
用所述的酯所提供的优于现有技术的优点为这种方法提供的进入血流的甲硫氨酸的量比现有技术提供的甲硫氨酸衍生物的量多。另外，我们惊人地发现采用某些酯能使甲硫氨酸十分迅速地吸收入血流中。本发明的酯衍生物看来不仅能避免瘤胃的降解而且能通过瘤胃壁吸收，惊人地将甲硫氨酸引入血流。这与现有技术相反，现有技术中已知甲硫氨酸的羟基类似物或者在瘤胃中降解或者绕过瘤胃被小肠吸收。
作为现有技术该领域的证据，将甲硫氨酸引入瘤胃血流的研究着重于使用瘤胃旁路化合物作为将甲硫氨酸引入血流的最快和最有效的手段。我们已发现将本发明的酯加到母牛的饲料中，在一些情况中导致50％以上的甲硫氨酸当量直接通过瘤胃壁吸收。母牛通过瘤胃吸收后，这些酯不仅具有高生物利用率，而且它们使甲硫氨酸或生物学上相当的化合物非常迅速地进入血流。这种结果是令人惊奇的和十分出人意料的，因为直至今日都普遍认为只有例如挥发性脂肪酸、氨和二氧化碳等化合物才能通过瘤胃壁吸收。
本发明还寻求提供对母牛状况的改善，采用本发明的酯能导致改善增重、改进繁殖能力、增加活力、和改善肝功能。
通过给予酯而改善肝功能的效果是非常重要的益处。该效果的特点是通过改善极低密度脂蛋白而减少代谢问题。同样也认为减少了血酮病和限制了肝脂肪变性。
给予脂对生殖也有益处。可缩短产犊与繁殖之间的间隔时间。这种作用的特点是提高了授精过程中的受精百分比。
采用特定的脂看来也可刺激瘤胃的发酵，从而产生更多的可消化有机物，并因此获得更多能量。
我们还发现当将本发明的酯给予奶牛时，能改善从其得到的牛奶。
本发明另一方面的内容是提供改善奶牛产生的牛奶的方法，该方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐羟基类似物的酯。
具体地说，本发明提供一种改善奶牛产生的牛奶的方法，该方法包括给予奶牛甲硫氨酸的分支烷基酯或甲硫氨酸羟基类似物的分支烷基酯。
当向奶牛提供本发明的酯时，我们发现在奶牛的日常饲料中添加甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐羟基类似物的酯，令人惊奇地改善了奶牛产生的牛奶的质量。具体说，我们发现将特定的酯掺入奶牛的饲料结果增加了牛奶中的蛋白质含量。
另外，除蛋白质含量外，我们发现给予特殊的甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯能改善产奶的量和牛奶中的脂肪含量。
给予酯后，蛋白质含量的增加经计算通常为每升牛奶0.5到4g蛋白质之间。通常增加的蛋白质是α、β、κ蛋白质，尤其是β和κ蛋白质对奶酪有良好的作用增加了产出的牛奶的口味。
上述目的可全部或部分获得。
本发明涉及向奶牛提供生物可利用甲硫氨酸的方法，该方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐羟基类似物的酯。合适的酯是烷基酯。戊基基团可以是线性的、分支的或环状的，具有1—12个碳原子，较佳地为1—10个碳原子，更佳的是1—4个碳原子。
合适的甲硫氨酸和甲硫氨酸羟基类似物的酯包括甲酯、乙酯、正—丙酯、异丙酯、丁酯即正—丁酯、仲—丁酯、异丁酯和叔丁酯、戊酯和己酯，尤其是正丙酯、异丙酯、正己酯和异己酯。合适的甲硫氨酸的酰胺包括N—酰基甲硫氨酸烷基酯，如烷基N—酰基甲硫氨酸酯。
较佳地，酯是分支或线性烷基酯，尤其是分支烷基酯，如异丙酯和叔丁酯。就甲硫氨酸的酯而言，最优选的是异丙酯和叔丁酯。就甲硫氨酸羟基类似物而言，最优选的是叔丁基和异丙基酯。
具体地说，已发现采用甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯特别有效，通过瘤胃壁的吸收能提供至少50％甲硫氨酸当量进入血流。已发现甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯表现出的甲硫氨酸的生物可利用率大于50％。
另外还发现给予羟基类似物的异丙酯后，血液中迅速出现生物可利用度峰值，表明该酯通过瘤胃壁直接吸收，意味着该酯不是经瘤胃旁路吸收的。
还发现甲硫氨酸叔丁酯通过瘤胃吸收能向奶牛提供约80％甲硫氨酸当量。摄取后不到1小时提供的甲硫氨酸，表现出该酯已非常迅速地进入了血流。
可以合适的方法将该酯给予母牛。较佳地，以饲料添加剂补充该酯，可通过每日常规的饲料给予母牛。喂养母牛的饲料包括浓缩物部分和饲草部分。本发明的另一方面内容是提供包括饲草部分、浓缩物部分和添加剂的饲料，所述的添加剂包括甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐羟基类似物的酯。
饲料中合适的酯是如上所述的酯。优选的饲料包括饲草部分、浓缩物部分和甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯。
掺入母牛饲料中的酯量随母牛繁殖到产奶周期各阶段而不同。合适地，添加剂含酯的量以甲硫氨酸当量计为每天每只动物75g以内，较佳地为5—50g，更佳的是10—30g。
可用本领域技术人员熟悉的合适方法来计算所需的酯量。合适地，可用计算机模型来计算该量。
当饲料含有甲硫氨酸羟基类似物的叔丁酯或异丙酯时，浓缩物中存在的酯量为每天每只动物7—65g，更佳的是每天每只动物10—30g。当饲料含有甲硫氨酸的异丙酯或叔丁酯时，饲料宜含有7—65g酯，更佳的是10—30g酯。
本发明的另一方面内容是提供含有一定量上述酯的单位剂量形式，适合于每天每只母牛的剂量。
饲草部分通常包括玉米青贮、牧草青贮、苜蓿青贮和/或干草青贮。浓缩物部分通常包括谷粒，如玉米、小麦、大麦、补充蛋白质源(如粗粉、油菜籽、大豆、玉米面筋)和副产品(如鱼粉、血粉、酒糟)等。
添加剂包括在合适时候与饲草部分和谷物部分混合的酯。酯是液态的，可在制成饲料丸之前与饲草部分和浓缩物部分混合而掺入。另外，也可由畜牧者在喂养母牛之前加入到丸状饲料中。
在形成丸粒之前或之后将酯掺入都是稳定的。具体说，已发现在制成的丸粒中羟基类似物的异丙酯在一段长时间后保持95％以上的稳定性。所以，用本发明的酯作为饲料添加剂能提供甲硫氨酸的稳定来源。
以下将参考优选实施例详细描述本发明。
实施例1甲硫氨酸羟基类似物的酯(a)制备该酯(1)甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯将314.4g(1.88mol)2—羟基—4—甲硫基—丁腈置于装配有急变装置(chicane)的搅拌式夹套反应器中。保持温度在50℃以下，缓慢加入201.3g(1.951mol)95％硫酸。加完酸后，将反应温度维持在45℃ 15分钟。向反应物中加入227.3g异丙醇。随后使反应器的温度以5℃/分钟的速度上升，直至反应器底部温度达到116℃，顶部温度达到75℃。将此反应条件维持5小时。在该过程中除去一些馏出液，用新鲜异丙醇替代。
然后用161.2g(32％)氨水溶液(2.72mol氨)中和反应混合物。得到两相。加入780g水和449.7g二氯甲烷。将产生的两相分开，得到939.1g有机相和1247.4g水相。
蒸馏除去有机产物中的轻组分。增加蒸发浴的温度，并将压力减至约几个毫巴。回收到263.5g蒸馏物。发现甲硫氨酸异丙酯的滴定度大于99％。收率为72％。
(2)甲硫氨酸羟基类似物的甲基、乙基、正—丁基和环己基酯如上所述但用适当的醇来制备这些酯。
(b)生物可利用性以实施例2(b1)所述的方式，给予2只母牛如上制备的以下酯剂量相当于50g甲硫氨酸。
HMB的甲酯 64.8gHMB的乙酯 74.8gHMB的异丙酯80.5gHMB的正—丁酯96gHMB的环己酯97.5g
HMB的仲丁酯79g27小时后测定甲硫氨酸和HMB的浓度。将测定结果作图，计算曲线下的面积以得到生物可利用性的结果。
以SmartamineTM参考品测定生物可利用性。
表1列出了酯的生物可利用性结果。
表1甲硫氨酸羟基类似物(HMB)酯的生物可利用性结果
*测定的浓度以100g血浆含有的mg数；met＝甲硫氨酸实施例2甲硫氨酸酯(a)酯的制备按如下流程制备甲硫氨酸的酯将待酯化的甲硫氨酸和相当于甲硫氨酸为1.2当量的硫酸置于醇(与烷基链的特性相应)中。将产生的混合物回流同时除去水来改变平恒。用氨水中和该化合物以分离酯。蒸馏除去醇。用二氯甲烷提取得到酯，用水洗涤。蒸发掉二氯甲烷。
以下的甲硫氨酸酯可按此流程制备甲硫氨酸甲酯、甲硫氨酸正丙酯、甲硫氨酸正丁酯、甲硫氨酸正己酯、甲硫氨酸正十八烷酯、N—酰基甲硫氨酸乙酯、盐酸甲硫氨酸甲酯、盐酸甲硫氨酸乙酯、甲硫氨酸异丙酯、甲硫氨酸叔丁酯、甲硫氨酸环己酯、甲硫氨酸仲丁酯和甲硫氨酸十二烷基酯。
(b)生物可利用性评估了这些酯的生物可利用性。
(1)甲硫氨酸甲酯和甲硫氨酸正丙酯清晨喂食前(上午745)，将如上制备的56g甲硫氨酸甲酯和72g甲硫氨酸正丙酯(相当于提供50gDL—甲硫氨酸)以现场剂量给予两只母牛。
将给予这两只母牛的饲料分成08.00时和16.00时两等份，包括7kg干草和2kg浓缩物。
在将酯给予动物的当天的09.00、10.00、11.00、13.00和15.00时和在给予酯的前一天和后两天的09.00、12.00和15.00时经颈静脉穿刺采集血样。
3000转/分钟离心血液10分钟，从血液分离各样品的血浆。将样品储存在冰箱内。按Moore和Stein的标准流程进行甲硫氨酸的分析。
按常规AUC方法将得到的结果作图，计算曲线下的面积以得到各酯的得到的生物可利用性。
表2列出了这些酯的生物可利用性结果。
(2)甲硫氨酸正己酯、甲硫氨酸正丁酯、甲硫氨酸正十八烷基酯、N—乙烯甲硫氨酸乙酯如上所述，将现场剂量的以下酯(相当于50g甲硫氨酸)给予两只母牛(如b1所述方式)。
甲硫氨酸正己酯 79g甲硫氨酸正丁酯 86g甲硫氨酸正十八烷基酯227gN—乙酰甲硫氨酸乙酯 75g将给予这两只母牛的饲料分成08.00时和16.00时两等份，包括7kg干草和2kg浓缩物(包括41％大麦、37％脱水甜菜浆、5％糖蜜、2％尿素和15％大豆48)。
按如下流程给予母牛这些酯
表2列出了这些酯的生物可利用性结果。
(3)盐酸甲硫氨酸乙酯用72g如上所述制备的盐酸甲硫氨酸乙酯重复流程(b1)。
如(b2)给予母牛日饲料。
按以下流程给予母牛酯
在与(b1)相同的时间采集血样。
表2列出了这些酯的生物可利用性结果。
(4)甲硫氨酸十二烷基酯和甲硫氨酸异丙酯将如上所述制备的106.5g甲硫氨酸十二烷基酯和64.1g甲硫氨酸异丙酯(相当于50gDL—甲硫氨酸)如(b1)所述给予两只母牛。
按以下流程给予母牛酯
与(b1)相同的方案采集血样。
表2列出了这些酯的生物可利用性结果。
(5)甲硫氨酸环己酯、盐酸甲硫氨酸甲酯、和甲硫氨酸仲丁酯将如上所述制备的酯的现场剂量(相当于50g甲硫氨酸)，以(b1)所述的方式给予两只母牛甲硫氨酸环己酯 112g盐酸甲硫氨酸甲酯73g甲硫氨酸仲丁酯 72g表2列出了这些酯的生物可利用性结果。
表2甲硫氨酸酯的生物可利用性结果
*测定的浓度以100g血浆含有的mg数；met＝甲硫氨酸实施例3动力学对于甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯，测定了血流中甲硫氨酸和HMB可利用性的动力学，并与甲硫氨酸羟基类似物(非本发明的化合物)的相比较。
重复实施例2的流程，其中将羟基类似物的异丙酯(69g)和羟基类似物(AlimetTM—57g)给予四只母牛。分析母牛血浆中的甲硫氨酸和HMB水平，下表3和4列出了结果。
从这些结果中可看出甲硫氨酸羟基类似物异丙酯比HMB本身更迅速地将甲硫氨酸和HMB提供到血流中，表明该酯是通过瘤胃壁吸收的。
表3甲硫氨酸的血浆浓度(mg/100g血浆)
表4HMB的血浆浓度(mg/100g血浆)
实施例4产奶实施例(a)甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯和甲硫氨酸的异丙酯将甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯给予16只奶牛为时8星期。每日给予每只动物玉米青贮和添加剂，以满足100％需要和115％PDIE(小肠中可消化蛋白质)的需要。每日添加剂包括4.3kg高能量浓缩物(包括19.8％大麦、21.1％小麦、37.5％甜菜浆、2.3％动物脂肪、1.1％盐、0.6％碳酸钙和1.1％碳酸氢钠)、2.2kg晒过的大豆饼、1kg常规大豆饼、240g尿素和300g维生素和矿物质添加剂。
将奶牛分成3组来实施本发明的方法，将以下添加剂掺入常规饲料，从而向每只动物每天提供12.5g生物可利用的甲硫氨酸。
—处理11kg大豆饼—处理21kg大豆饼和20g聚合物包被的甲硫氨酸(对比实例)—处理31kg大豆饼，补充有3％HMBI异丙酯(相当于含有57％甲硫氨酸)—处理41kg大豆饼，补充有2.5％甲硫氨酸异丙酯(相当于含有76％甲硫氨酸)。
按如下流程给予母牛这些添加剂时间分期
*每组4只母牛下表5列出了对产出的牛奶的分析结果。
表5产奶结果
从这些结果可以看出，将甲硫氨酸的异丙酯和甲硫氨酸羟基类似物的异丙酯添加到牛奶的饲料中，能使牛奶的脂肪含量和蛋白质含量更高。
实施例5肝功能和繁殖能力重复实施例4的流程，观察对母牛肝功能和繁殖能力的影响。在接受酯的母牛中观察到有实质性改善。
实施例6产奶用含其他酯(酯的选择证明了实施例1和2中得到的结果)的饲料重复实施例4的流程，表明用本发明的酯和含这些酯的饲料改善了奶牛血液中甲硫氨酸的生物可利用度。还得到改良的牛奶。
权利要求
1.一种向奶牛提供生物可利用甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将酯作为添加剂掺入饲料。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的酯是具有1—12个碳原子的烷基酯。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的烷基酯具有1—10个碳原子。
5.如权利要求1—4任一所述的方法，其特征在于，所述的烷基酯是甲基、乙基、正—丙基、异—丙基、正—丁基、异—丁基、仲—丁基、叔—丁基、正—戊基、异—戊基、正—己基或异—己基酯。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的酯是具有1—4个碳原子的烷基酯。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的烷基酯是分支的。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酯是异丙基酯。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的酯是甲硫氨酸羟基类似物的异丙基酯。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酯是叔—丁基酯。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的酯是甲硫氨酸叔丁酯。
12.一种向奶牛提供至少50％生物可利用度甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括给予奶牛甲硫氨酸叔丁酯或甲硫氨酸羟基类似物的异丙基酯。
13.一种改善奶牛产生的牛奶的方法，其特征在于，所述的方法包括给予奶牛上述权利要求任一所述的甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的改善包括增加牛奶中的蛋白质含量。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的改善包括增加牛奶中脂肪的含量。
16.一种包括谷物部分、浓缩物部分和添加剂的饲料，其特征在于，所述的添加剂包括甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
17.如权利要求16所述的饲料，其特征在于，所述的添加剂包括的酯的量以甲硫氨酸当量计在75g以内。
18.如权利要求17所述的饲料，其特征在于，所述的酯的量以甲硫氨酸当量计为10到30g。
19.如权利要求16—18任一所述的饲料，其特征在于，所述的酯是甲硫氨酸羟基类似物的异丙基酯。
20.如权利要求19所述的饲料，其特征在于，所述的异丙基酯的量为每天每只奶牛7到65g。
21.如权利要求16—18任一所述的饲料，其特征在于，所述的酯是甲硫氨酸的叔丁基酯。
22.如权利要求21所述的饲料，其特征在于，所述的酯的量是每天每只奶牛7到65g。
23.一种由一定量权利要求3—11任一所述的酯构成的单位剂量形式，适合于每天每只奶牛的剂量。
24.一种改善奶牛状况的方法，其特征在于，所述的方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的酯是权利要求3—11任一所述的酯。
26.如权利要求24或25所述的方法，其特征在于，所述的改善包括改善繁殖能力。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的改善包括改善肝功能。
28.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述的改善包括增加能量。
全文摘要
本发明涉及向奶牛提供生物可利用甲硫氨酸的方法,该方法包括给予奶牛甲硫氨酸或甲硫氨酸酰胺的酯和/或甲硫氨酸或其盐的羟基类似物的酯。
文档编号A61K31/223GK1326322SQ99813267
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月10日 优先权日1998年11月13日
发明者J·C·罗伯特, R·贝内特, G·格罗 申请人:阿方蒂动物营养素股份有限公司