专利名称：用于改变纤维长度和/或植物高度的核酸构建体和方法
技术领域：
更具体地，本发明涉及通过调控编码细胞壁关联激酶(wall-associated kinase)(WAK)的基因的表达改变具有工业价值的植物中的纤维长度
和/或植物高度。
背景技术：
对木制品和木材来源的产品的持续增长的需要构成了 一个全球 范围的问题。据估计，现在世界森林采伐量早已达到了最大的可持 续速率。因此，存在着对更多的木本植物的急迫需要，以及开发提 高林业植物的农业性状(如更高的植物高度。更大的生物质产量和更 长的木质部纤维长度)的方法的需要。例如，纤维均匀度和强度是大 多数工业应用的共同要求。在制浆中，强度特性部分地由纤维长度 确定。长的纤维由于其强度和结合性能而对于高强度纸的生产、提 高纸浆产量和减少碱消耗量等方面是理想的。
我们可以举出桉(五wca(yp,w力树作为说明木本植物重要性的例 子，桉树是全球用于造纸工业的纤维的最大来源(Bamber， 1985, 4pp"a 38: 210-216)。据估计， 一千万至一千五百万/>项的土地种植 有按杉于。Verhaegen和Plomion, 1996, C ewome 39: 1051-1061。才耍杉于的
主要优点是其非常高的生长率和在大范围条件下生长的能力，在热 带和温带条件下都能生长。但是，与其它来源(如松树)的纤维相比，桉树纤维具有一项缺点，就是其长度显著较短。因此，由桉树纸浆 制成的纸通常强度较弱且通常需要用其它来源的较长纤维进行强 化，乂人而增加了生产成本。
纤维长度受到细胞延长(一种由内膨压和细胞壁的机械强度之间 的相互作用引起的过程)的内源性调节的控制，但其机理和所涉及的
基因还没有完全弄清楚。
木质部纤维细胞产生自位于维管形成层内的早已大量相当延长
的纺锤状原始细胞。它们通过其径向壁的扩展而增大其直径，且另 外通过侵入性顶端生长产生纤维细胞延长，这导致细胞长度高达数
4咅的增力口。 Gray画Mitsumune等，2004,尸/aw,尸/^Wo/. 135: 1552-1564。
在顶端生长细胞中，膨胀发生在细胞表面的小的区域内，这导 致管状的、细长的细胞。例如，杨树纤维在木质部的径向膨胀带中 侵入性地延长，当完全分化时其长度平均达到其原始细胞长度的 150%。 Hussey等，2006， ^國.版尸/福娠/. 57: 109-125; Mellerowicz等，2001,户/awf Afo/.47: 239-274。
纤维细胞的快速膨胀可能通过膨压对细胞壁施加的推压和细胞 壁的松弛的协同作用而实现。在棉纤维中，细胞延长阶段接着膨压 的显著上升，这源于观察到的苹果酸盐、糖和K+(主要的渗压剂 (osmoticum))的积聚，因此导致水的内流和纤维细胞内高膨压的产 生。Ruan等，2004,户/a^P/y^o/. 136: 4104-4113。
液泡转化酶可以在膨压维持和细胞壁膨胀中具有重要作用。最 近用拟南芥(Jra6zWo/a^ Aa/^"a)进行的工作表明细胞壁关联激酶 (WAK)可能调节液泡转化酶，因此在WAK和液泡转化酶之间建立了 跨区室的联系。Kohorn等，2006,尸/g^46: 307-316。
在拟南芥中，WAK由五个紧密连接且高度相似的基因进行编码， 并在叶、分生组织和发生膨胀的细胞中表达。Wagner和Kohorn， 2001, 尸/a"fCe// 13: 303-318。
存在T-DNA插入WAK2基因中的突变的拟南芥苗比野生型的植 物显著较矮，根比胚轴受到更大的影响。Kohora等，2006, P/"W,46: 307-316。
这些突变植物显示出液泡转化酶活性降低62%,且作者提出 WAK2对作为调整溶质浓度的机制和膨压调节的一个要素的液泡转 化酶的转录进行调控，因此提供了 WAK调节细胞膨胀的一种可能的机制。
在拟南芥中可诱导的反义WAK2的表达导致WAK蛋白水平的 50%的下降，产生细胞延长的后续损失，并因此产生矮生植物。当反 义WAK4基因用于降低总WAK蛋白水平时也报道了类似的结果。 Wagner和Kohorn， 2001, PtoC"/ 13: 303-318; Lally等，2001,尸to Ce// 13: 1317-1331。
现在也知道，细胞壁关联激酶包含可以连接到细胞壁的果胶分 子上的细胞外域、跨越质膜且具有胞质丝氨酸/苏氨酸激酶域。He等， 1999，尸/^mfAfo/.39: 1189-1196。
当纤维在两末端发生显著延长(侵入性顶端生长)时，胞间层的性 质限制了这一类型的细胞生长。发育的木质细胞的胞间层富含果胶， 且侵入性顶端生长需要胞间层的分解。参见Berthold等，WO 2006/068603。
通过其果胶连结，WAK有可能感知细胞壁环境中的变化，因此 提供了 一种将细胞壁感知与溶质代谢的调节联系起来的分子机制， 已知其随后参与生长细胞的膨压维持和细胞膨胀。这种信息对于细 胞膨胀或膨压的调节可能是相当有用的。Huang等，2007, Fw"c"o"a/ 户/"W Ao/ogy, 34: 499-507。
纤维的特性受到 一组复杂的遗传因素的控制并且不容易釆用经 典育种方法育种。通过传统的林木育种，获得某些纤维特性的改良 是可能的。例如，已经培育出比亲本树种具有更长的纤维的杨树种 间三倍体杂交种。Aziz等,1996, Wood and pulp properties of aspen and its hybrids. JM/WiVoc.尸咖7zg Co啡削ce. P.437-443。还有，考虑到 传统林木育种的缺陷，如由于其长的世代周期导致的緩慢进展和产 生具有理想性状的植物的难度，基因技术的发展可以显著缩短产生植物的新品种所需要的时间并使得能够在特定的树种中更紧密地以 林业和制浆工业需要的性状为目标。
发明内容
在一个方面中，本发明提供包含与木质部优先启动子可操作地
连接的WAK多核苷酸序列的核酸构建体，该启动子引起所述WAK 多核苷酸序列的超表达。在一个实施方式中，所述木质部优先启动 子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和 C4H基因启动子。在另一个实施方式中，转基因植物包含所述核酸 构建体，且该植物与同种的非转基因植物相比具有纤维长度和/或高
度的增加。在进一步的实施方式中，所述植物是双子叶植物、单子 叶植物、棵子植物或阔叶树。本发明进一步包括转基因植物的后代， 以及由转基因植物制备的木浆和木纤维。
在另 一方面中，本发明提供增加纤维长度和/或植物高度的方法，
的WAK多核苷酸序列的核酸构建体，该木质部优先启动子引起所述 WAK多核苷酸序列的超表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所 述植物细胞；和(c)选择与同种的非转基因植物相比具有增加的纤维 长度和/或植物高度的转基因植物。
图1示意性地说明包含驱动本发明的细胞壁关联激酶核苷酸序 列表达的形成层/木质部优先启动子的本发明的植物表达质粒载体 pALELLYX画WAK。
图2显示了用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转 化的几种转基因家系和相应的对照非转基因植物的纤维长度。星号 表示统计学显著较高的平均纤维长度值(P0.05, t检验)。
图3显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化 的Tl转基因植物(51B家系)的两种基因型的纤维长度。星号表示统计学显著较高的平均纤维长度值(P0.05, t检验)。
图4显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化 的Tl转基因植物(47B家系)的两种基因型的纤维长度。星号表示统 计学显著较高的平均纤维长度值(P0.05, t检验)。
图5显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化 的Tl转基因植物(51B家系)的三种基因型的植物高度。星号表示统 计学显著较高的平均植物高度值(P0.05 ， t检验)。
具体实施例方式
本发明涉及植物纤维长度和/或增大植物高度的基因操作的方法。
植物细胞壁是赋予各细胞稳定外形的高强度纤维网络。为增大， 细胞选择性地松弛这一 网络，使得它能够顺从由细胞膨压产生的膨 胀力。随着细胞膨胀，存在着对膨压的补偿调节的更大的需要，这 取决于细胞溶质代谢。
细胞壁关联激酶(WAK)可以通过其与果胶的连结感知细胞壁膨 胀，从而如上面所概述的提供将这些信号转导到调节溶质变化的系 统的机制。但是，先前在WAK上的工作并没有预示着植物中组织特 异性方式的WAK基因的超表达导致纤维长度的显著变化以及植物 高度的显著变化。该结果开启了改变对植物纤维、林业、制浆和造 纸工业极重要的性状的途径。
因此，按照本发明的一个方面，提供了通过控制细胞壁关联激 酶的活性改变植物组织中，如木质被子植物木质部的纤维细胞、棵 子植物木质部的管胞细胞和棉籽的纤维细胞中的纤维长度的方法。 按照本发明的这 一 方面，植物细胞或整个植林用细胞壁关联激酶编 码序列遗传工程化，该序列在被子植物的木质纤维细胞、棵子植物 的木质管胞或棉籽的纤维细胞中表达时引起细胞长度的增加。
本发明中使用的所有技术术语为生物化学、分子生物学和农学 中常用的术语，且可以被本发明所属领域的普通技术人员理解。那些技术术语可以在以下材料中找到MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第三版，vol. 1-3，编者Sambrook和 Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,编者 Ausubel等,Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988 (具有定期更新)；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,第五版，vol. l画2，编者 Ausubel等，John Wiley & Sons， Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. l画2，编者Green等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1997。涉及植物生 物学技术的方法学在本文中进行描述并在专著中详细说明，如 METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL,编者Maliga等，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y" 1995 。在例如Innis等，PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego， 1990及Dieffenbach和Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2003中描述了各种使用 PCR的技术。PCR-引物对可通过已知技术，如使用为该目的设计的 计算机程序(例如Primer, Version 0.5， 1991， Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)乂人已^口序列获4寻。例^口， 在 Beaucage和Caruthers, 1981, r"ra.22: 1859-1862和Matteucci 和Camthers， 1981，/.爿肌C&附.<Soc. 103: 3185中描述了核酸化学合
成的方法o 』
如在Sambrook等，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL,第二版(1989)， Cold Spring Harbor Laboratory Press中所
描述的进行限制性酶消化、磷酸化、连接和转化。除非另外说明， 所有用于细菌细胞的生长和维持的试剂和材料都从AldrichChemicals (Milwaukee, WI) 、 DIFCO Laboratories (Detroit, MI)、 Invitrogen (Gaithersburg, MD)或Sigma Chemical Company (St. Louis, MO)获得。
术语"编码"和"译码"指的是基因通过转录和翻译的机制向 细胞提供信息的过程，由此一 系列氨基酸可组装成特定的氨基酸序 列以产生活性酶。由于造传密码的简并性，DNA序列中的特定石威基 变化不改变蛋白质的氨基酸序列。因此可以理解，对蛋白质的功能 特性不产生实质影响的编码细胞壁关联激酶的DNA序列的改变是 可预想的。
在本说明书中，"表达"表示由基因编码的蛋白质产物的产生。 可选择地或另外地，"表达"表示由编码DNA分子发生的细胞内过 程(包括转录和翻译)的组合以产生多肽。"超表达"指的是特定基因 序列的表达，其中转基因生物体中mRNA或多肽的产生超过非转基 因生物体中的产生水平。
术语"异源核酸"指的是通过人的努力引入到细胞(或细胞的原 型)中的核酸、DNA或RNA。这种外源的核酸可以是其所引入的细 胞中天然发现的序列的副本或其片段。
相反，术语"内源核酸"指的是存在于待遗传工程化的植物或 生物体中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、 RNA、 mRNA或cDNA。 内源序列是待遗传工程化的植物或生物体"本身的"序列，即待遗 传工程化的植物或生物体原产的序列。
术语"同源序列"指的是由于共同祖先和序列保守性而类似的 多核普酸或多肽序列。
术语"功能性同源物"指的是由于共同祖先和序列保守性而类 似且在催化、细胞或生物体水平上具有相同或类似的功能的多核苷 酸或多肽序列。
细胞壁关联激酶序列
在本说明书中，术语"细胞壁关联激酶多核苷酸序列"表示编码细胞壁关联激酶多肽的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、 RNA、 mRNA或cDNA分子，细胞壁关联激酶多肽的超表达改变纤维长度 和/或植物高度。DNA或RNA可以是双链或单链的。单链DNA可以 是编码链，也称为有义链，或者可以是非编码链，也称为反义链。 说明这一类别的是包含从拟南芥鉴别的SEQIDNO: 1、 3、 5、 7和 9且可以用于增加纤维长度和/或植物高度的多核苷酸分子。
适用于本发明的细胞壁关联激酶多核苷酸序列可以从特征为存 在WAK基因的极大数量的生物体中鉴别出来。虽然本发明中公开了 前述核苷酸序列，但它们并不对本发明构成限制。因此，WAK序列 可以进行鉴别并通过序列比较进行功能性解释。技术人员可以轻易 使用向公众提供的序列分析程序和参数在合适的数据库(如GenBank) 中鉴别功能相关的WAK序列。或者，采用基于本发明公开的DNA 或蛋白质序列的合适杂交探针或引物筛查cDNA文库或基因组文库 应导致功能相关的WAK序列(功能性同源物)的鉴别。本领域中还理 解的是，具有较低的同 一 性水平的序列也可以借助于简并的寡核苷 酸和基于PCR的方法进行分离。尽管本发明的多核苷酸是从拟南芥 分离的，来自其它植物的功能性同源物也可用于产生具有增加的纤 维长度和/或植物高度的植物。可以从中分离WAK基因的植物品种 的例子包括双子叶植物，例如葫芦科(Cucurbitaceae)、 茄科 (Solanaceae)、 十字花一牛(Brassicaceae)、虫莱开j花牙牛(Papilionaceae)长口紫 花苜蓿(alfalfa)和虽工豆(P7g"a wwgw/cw/齒)、锦葵科(Malvaceae)、 菊科 (Asteraceae)、金虎尾牙牛(Malpighiaceae)如杨属(Popw/w力、斗兆金4良一牛 (Myrtaceae)如4姿属，和单子叶才直物，例如禾本一牛(Gramineae), 包4舌 水稻、小麦、甘蔗、大麦和玉米。
在本说明书中，术语"细胞壁关联激酶多核苷酸序列"、"WAK 多核苷酸序列"和"WAK DNA序列"也指具有能够在严格条件下 与本发明公开的任何序列杂交且能够编码具有与包含本发明公开的 SEQIDNO: 2、 4、 6、 8或10氨基酸序列的蛋白质等同的WAK活 性的多肽的核苷酸序列的任何核酸分子。该术语还包括与SEQ IDNO: 1、 SEQIDNO: 3、 SEQIDNO: 5、 SEQIDNO: 7或SEQ ID NO: 9交叉杂交的序列，优选具有与SEQ ID NO: 1、 3、 5、 7和9 的一种或多种至少65%的同源性或同一性的序列。本发明的核苷酸 序列可以编码与本发明公开的SEQIDNO: 2、 4、 6、 8或10中任何 一种的预计基因产物同源的蛋白质。另外，本发明的核苷酸序列包 括编码具有与本发明公开的SEQIDNO: 2、 4、 6、 8或10中任何一 种的氨基酸序列至少55%，优选至少60%,更优选至少70%,更优 选至少80%,更优选至少90%和最优选至少95%的序列同一性的氨 基酸序列的WAK多肽的序列。遗传密码的简并性使多核苷酸的核苷 酸序列中的大多数变异成为可能，同时保持所编码的氨基酸序列。
这里的短语"严格条件"意味着本领域熟知的参数。当单链多 核苷酸基于多种良好表征的物理化学力(如氢键、溶剂排斥和碱基堆 积)结合时发生杂交。杂交的严格性反映了所涉及的核酸的序列同一 性程度，从而严格性越高，两条多核苷酸链越相似。严格性受到多 种因素的影响，包括存在于杂交液和洗涤液中的温度、盐浓度和组 成、有机和非有机添加剂、溶剂等，及孵育(和次数)。本领域普通技 术人员可以轻易地通过改变杂交反应和洗涤处理过程中的温度、杂 交反应和洗涤处理过程中的盐浓度等等选择这些条件。
对于具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交，在Southern 或Northern印迹分析的滤膜上，"严格"杂交条件的例子是在限定 的离子强度和pH下低于特定序列的热解链温度(Tm) 5。C-20。C的温 度。Tm是在限定的离子强度和pH下50%的目标序列与完美匹配的 探针杂交的温度。在严格条件下杂交的核酸分子通常与基于完整 cDNA或所选择的部分的探针杂交。更优选地，这里的"严格条件" 指的是本领域中熟知的参数，例如65。C下在3.5 x SSC、1 xDenhardt's 液、25mM磷酸钠緩冲液(pH7.0)、 0.5% SDS和2mM EDTA中杂交 18小时，随后在65。C下在2 x SSC和0.1% SDS中对滤膜进行四次 的20分钟洗涤，并在0.5 x SSC和0.1% SDS或者0.3 x SSC和0.1% SDS中进行最多20分钟的最终洗涤以达到更高的严格性，且O.l xSSC和0.1。/。SDS用于甚至更高的严格性。可以使用其它条件替代， 只要严格性的程度等于本发明中使用0.5 x SSC的最终洗涤提供的程 度。对于较低相关同源物的鉴别，洗涤可以在较低温度(例如，50°C) 下进行。 一般，严格性通过升高洗涤温度和/或降低SSC的浓度而提 高。
另外，合适的细胞壁关联激酶序列的类别包括由具有一个或多 个缺失、置换、插入或添加的石威基的SEQ ID NO: 1或3或5或7 或9的变异体构成的核酸分子，该变异体编码在超表达时导致纤维 长度和/或植物高度改变的多肽。这里所称的"具有一个或多个缺失、 置换、插入或添加的碱基的碱基序列"为本领域普通技术人员广泛 已知，甚至在通常具有生理活性的蛋白质的氨基酸序列具有一个或 多个置换、缺失、插入^添加的氨基酸时保持生理活性。僻如，聚A 尾或者5，或3'末端非翻译区域可以被删除，且碱基可以被删除到氨 基酸被删除的程度。碱基也可以被置换，只要不导致移码。碱基也 可以被"添加"到氨基酸被添加的程度。但是，任何这类修饰不导 致生理活性的丧失是非常重要的。在该环境中的修饰DNA可以通过 改变本发明的DNA石威基序列而获得，从而例如，在特定位置的氨基 酸通过定点诱变纟皮置换、删除、插入或添加。Zoller & Smith， 1982， M/c/^cjczWAm. 10: 6487-6500。因此，术语"变异体，，是与特定基 因或蛋白质的标准的或给定的核苷酸或氨基酸序列偏离的核苷酸或 氨基酸序列。变异体可以具有"保守的"改变，其中置换的氨基酸 具有类似的结构或化学性质，例如亮氨酸被异亮氨酸取代。变异体 可以具有"非保守的，，改变，例如甘氨酸被色氨酸取代。类似的小 变异也可以包括氨基酸缺失或插入，或者包括两者。确定哪些氨基 酸残基可以被置换、插入或删除的指引可以使用本领域中公知的计 算机程序，如Vector NTI Suite (InforMax, MD)软件找到。"变异体" 还可以指"改组的基因(shuffled gene)",例如在美国专利6506603、 6132970、 6165793和6117679中描述的。
获得WAK DNA序列的进一步途径是通过，例如使用合适的cDNA序列作为模板从合适的碱基从头合成。 核酸构建体
本发明包括包含一种或多种本发明的核酸序列的重组构建体。 该构建体通常包含沿正或反方向插入核酸序列的载体，如质粒、粘 粒、噬菌体、病毒(例如，植物病毒)、细菌人工染色体(BAC)、酵母 人工染色体(YAC)等等。众多的合适载体是已知的且可商购得到，因 此不需要在此反复说明。
重组核酸构建体可以使用标准技术制得。例如，用于转录的核 苷酸序列可以通过用限制性内切酶处理包含所述序列的载体以切出 适当的片段而获得。用于转录的核苷酸序列还可以通过退火和结合 合成的寡核苷酸或通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用合成的寡核 苷酸以在各末端得到合适的限制性位点而产生。然后核苷酸序列克 隆到包含合适的调控元件(如上游启动子和下游终止子序列)的载体 中。通常，植物转化载体包括一个或多个在5，和3'调控序列的转录 控制下的克隆植物编码序列(基因组的或cDNA)及一个可选择的标 志。这类植物转化载体通常还包含启动子、转录启动开始位点、RNA 加工信号(如剪接信号序列)、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。 还可以存在增强子和导向序列。
本发明提供很可能引起转化的植物中纤维长度和植物高度改变 的核酸分子。本发明的一个重要方面是其中细胞壁关联激酶编码核 苷酸序列与一个或多个启动子可操作地连接的核酸构建体的用途， 该启动子以组成型方式或在特定的细胞类型、器官或组织中驱动细 胞壁关联激酶编码序列的表达，从而与非转基因植物的纤维长度相 比改变转化植物的纤维长度。
可用于表达适用于本发明的细胞壁关联激酶序列的合适组成型 植物启动子包括，但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉 米和杨属聚泛素启动子，其在大多数植物组织中赋予组成型的高水 平表达(参见，例如WO 2007/00611、美国专利5510474号、Odell
1等，脂訓,1985, 313: 810-812)、胭脂氨酸合酶(nopaline synthase)启 动子(An等，1988， Plant Physiol. 88: 547-552)、来自玄参花叶病毒的 FMV启动子(美国专利5378619号)和章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等， 1989， P/滅Ce〃 1: 977-984)。
也可以选择启动子以使得表达在植物发育的确定时间点、或者 由外部影响因素确定的时间点、或者以组织特异性的或组织优先的
纤;-:木质部纤维:或额外木质纤维-特异性的或-伊:先的启动子)。 示例性的棉纤维-特异性的或-优先的启动子包括，例如棉
CFACT1基因启动子(美国专利6995256号)、E6基因启动子(美国专 利6096950号；John等，1996, P/aW mo/. Bz'o/. 30: 297-306; John等， 1996, /Voc. A^/.爿c^/. 93: 12768-12773); H6基因启动子(John 等，1995,尸/a",尸—W. 108: 669-676); GhTUBl基因启动子(Li等， 2002, 尸—o/. 130: 666-674)和FbL2A (Rinehart等，1996,尸/滅 尸一o/. 112: 1331-1341和John等，1996,尸匿.胸/.爿cac/. 园93: 12768-12773)。
维管系统-优先的或-特异性的启动子，如木质部优先启动子，可 以用于影响本发明中的核酸分子的表达，具体来说在维管組织中， 特别是在木质部组织中。，因此，"木质部-优先的"意思是本发明的 核酸分子在木质部中比在任何其它植物组织中更活跃。所选择的启 动子应引起按照本发明的细胞壁关联激酶的超表达，从而改变细胞 木质部的长度、改变宿主植物的高度或者同时改变两者。
合适的启动子的例子是，但不限于木质部优先的微管蛋白(TUB) 基因启动子、咖啡酸3-0-甲基转移酶基因启动子(COMT)、蔗糖合成 酶基因启动子(SuSy)和木质部优先香豆酸-4-羟基化酶(C4H)基因启 动子。其它合适的木质部优先启动子在国际专利申请WO 2005/096805中公开，该文献通过引用引入本申请。
也可以使用包括赋予组织特异性或组织优先表达的特定核苷酸 区域的合成启动子，例如赋予木质部优先的表达的较大启动子内调控元件的鉴别。Seguin等，1997，尸to Mo/.肠/. 35: 281-291; To腦-Schuma皿等，1996, P/虚,9: 283-296和Leyva等，1992,尸to CW/4: 263-271。
虽然基因表达率主要由启动子调节，表达的提高也可以通过以 独立于方向的方式提高位置接近的基因的表达水平的增强子序列(如 基因的内含部分)的鉴别和使用实现。在植物中，在基因构建体中启 动子和基因编码序列之间包含一些内含子导致mRNA和蛋白质累积 的增加。已知提高植物中的表达的内含子已在玉米基因中鉴别出来， 例^口hsp70、 tubAl、 Adhl、 Shl、 UbH (Brown和Santino，美国专利 5424412和5859347号；Jeon等，2000，尸&" 尸/zjw'o/. 123: 1005-1014; Callis等,1987， ( e腦Z)ev. 1: 1183-1200; Vasil等,1989,户/a"f P/z，zW. 91: 1575-1579)，且在双子叶植物基因中，如来自矮牵牛花(Petunia) 的rbcS (Dean等,1989， P/赠C"/ 1: 201-208);来自土豆的ST-LS1 (Leon等，1991，尸/福'o/. 95: 968-972)及来自拟南芥的UBQ3 (Norris等，1993，尸/福Mo/.肠/. 21: 895-906)和PATl (Rose和Last, 1997, P/aw" 11: 455-464)。
按照本发明的 一个方面，细胞壁关联激酶序列被引入适用于植 物转化的核酸构建体中。因此，提供包含在植物中有效的转录起始 区域控制下的细胞壁关联激酶序列的核酸构建体，从而该构建体可 以在宿主植物细胞中产生RNA。优选地，转录起始区域是维管或木 质部-优先启动子(如以上所述启动子的任一种)的部分。如上所述， 这种核酸构建体可用于改变植物中的细胞壁关联激酶基因表达。
表达载体还可以包含可选择标志，转化细胞可以通过该可选择 标志在培养中鉴别。该标志可以与异源核酸分子，即与启动子可操 作地连接的基因关联。如本发明中所使用的，术语"标志"指的是 编码允许对包含该标志的植物或细胞进行选择或筛选的性状或基因 型的基因。在植物中，例如标志基因编码抗生素或除草剂抗性。这 能够从未转化或转染的细胞中选择转化的细胞。
合适的可选择标志的例子包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄噤呤-鸟噤呤磷酸核糖基转移酶、
草甘膦和草铵膦抗性及氨基-糖苷3，-0-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉 素和G418抗性)。这些标志可以包括对G418、潮霉素、博来霉素、 卡那霉素和庆大霉素的抗性。构建体还可以包含可选择标志基因
Bar,其赋予对除草剂膦丝菌素(phosphinothricin)类似物如草丁膦铵 的抗性。Thompson等，￡M8(9/. 6: 2519-23 (1987)。其它合适的选择 标志也是已知的。
可以使用可视标志，如绿色荧光蛋白(GFP)。用于基于细胞分裂 的控制鉴别或选择转化的植物的方法也已说明。参见John和Van Mellaert, WO 2000/052168和Fabijansk等，WO 2001/059086。
也可以包括细菌或病毒源的复制序列以允许将载体克隆到细菌 或噬菌体宿主中。优选地，使用广泛宿主范围的原核复制起点。可 以包括用于细菌的可选择标志以允许选择携带需要的构建体的细菌 细胞。合适的原核可选择标志还包括对抗生素(如卡那霉素或四环素) 的抗性。
其它编码另外的功能的DNA序列也可以存在于载体中，如本领 域中已知的。例如，当土 i裏杆菌属(Agrobacterium)为宿主时，可以包 括T-DNA序列以利于后续的向植物染色体中的转移和整合。
用于遗传工程的植物
本发明包括植物，特别是阔叶树中的遗传操作以在维管组织中 通过引入细胞壁关联激酶基因超表达，优选在木质部-优先或木质部-特异性启动子的控制下。该结果增加纤维长度和植物高度。
在本说明书中，术语"植物，，表示可以进行遗传操作的任何含 纤维植物材料，包括但不限于分化的或未分化的植物细胞、原生质 体、全植物、植物组织或植物器官，或者植物的任何部分如叶、茎、 根、芽、块茎、果实、根茎等等。
可以按照本发明工程化的植物包括，但不限于树木，如桉属的 种(白对姿(￡ a/6a)、 白花桉(五.a/6e打力，杏4二桉(五.amygc/a/z'"a) 、G^cwop/j/c^a、 圓叶按(￡". 6a〃e"wa)、 6a〃ac/om'e腦、、双脉按(五. 6z'coWa,a)、 葡萄桉(五.60^yo^fey)、短,蓉-桉(五.6rac/^am/ra)、褐桉(五. 6ra5^/awa)、少豆牙主才耍(五.6reWWj/^)、 布罗韦桉(五.Z rocArwYy^')、 確屯盖赤 桉(五.cama/c/w/ew57's)、五.cenacea、 大花序桉(五.c/oez&wa)、 聚果桉(五. coccz/e厂a)、 异'"、p十桉(五.co厂i/"/(2)、 角蕾桉(五.corww^if)、 五.cor/Zcaya、
剥才安(E <ieg7wp^f)、 大桉de/ega^w^s7'力、c/e//ca^a 、 卡瑞桉 G^vers7.co/or)、五.c^vens7/o/z.a、五.(iZves、五.c/o/Zc/zoca/77a、五.t/wwdtwZL 邓恩桉(五.c/w腿'z')， 滨河白桉e/幽)、五.eo^r歸，、五. e/3^/^o/ / /o/a、五.ewdesmozWes 、五./a/ca/a、五.gamop/^〃a 、五.g7aw"'wa、 蓝桉(五.g/oW—、双月永蓝桉(五.g/c^w/ws . ^co虚,a)、蓝桉原种 (五.g7o6w/ws sw6^p. g7o6w/t/51)、 五.gY 7^gy/oca/7 a、 巨桉(五.gra!wd^s1)、 巨 尾桉杂交种(五.gra"d&x wro/ /^〃a)、五.gw/^/by/e/、 西达才妄(五.g"""")、
/m〃"、 / owseawa、五.7'achom7、 /aw^o扉eawa、 /atoZwew57、、 五./ewcop/z/o&、 白藓叶桉(五./ewcox少/o")、 五./oc^yen'、 五./wcai7'z'、 直 才干蓝桉(51. m^We"")、边纟彖桉(五.marg7."a^)、五.附eg"ca/7 a、蜜p木桉Cfi". we〃z.O(ion3)、 五.wz.c/me/z'awa 、 'h巾冒桉(五.m/crocor;^) 、 d、套桉(五. mz'CH9f/ieca)、纟,孝力纟千皮桉(五.mwe//en'awa)、亮果斗耍(五.""e"s)、五.m力'c/a、 4斗口十斗妄CE1. o6/z々we)、五.oZ^w^y/ora 、西方桉(五.occZde/^a/z'sh五.op〃附a、 卵叶桉(五.画M)、 戸/^; A卢、雪桉(五.戶腦y/画)、粗皮桉(五. ; e〃〃a)、 穿叶桉(五.； ern'm'awa)、 五./ e〃o/an、、 弹丸桉(五.； 〃w/an、)、 五./ /perz'to、 阔叶桉(五./ /fl/y/ /^〃a)、 多花桉(五.po/j^"Aewas0、 五. ; o^M/wea、五./ re&57'awa 、 / sewtZo g7o6w/w51、五./ w/c/ze〃a、五.n2t/Zfl^a、 五.radzV^a sw6s/7. radz'a^u王桉(五.reg 7aws)、五.njdo""、五.ro6er"o""、
raJwa力、河红桉(五.n^Wa)、赤褐桉(五.n^igi"oM)、柳叶桉(五. sa/Zg"a)、纟工皮桉(五.sa/mowopA/oZa)、五.scopan'a、 4艮顶白蜡4姿(E w'e6eW)、五.5pa,/m/論、加er/、 Woa化/、五.加t/—5\五.fenw/r謂&、 纟田叶才安(五.^re"corm'力、五."frago"a、 达尔文纤皮桉(五.化^odo"fa)、
"Wa/^、五.五.謂6ra、尾叶桉(jE". t^o/ /^〃a)、五.ve削'co5""、多枝按(五.w7m72a/^)、 vrawdoo、 韦塔按(E.置/are腦'力、vW〃/W/、 五.swZ^p./a/cz/orm&、五.vW〃/57々'sw^^p. H7'〃&z7、五.woodwaniz7)， 杨属种类(银白杨(,a/6a)、银白杨大齿白杨杂交种CP. a/6a x i5. gTYmc//^"^^)、 4艮白杨欧洲山杨杂交种(尸.a/6a x尸./^mw/a) 、 4艮白杨 欧洲山杨杂交种(变种)(尸.a/6a x尸.^emw/a va厂.g/(3"dw/oM)、纟艮白杨 美洲山杨杂交种CP. a/6a X P. ^emw/ozWw)、香月旨杨(P. 6a&am^fera)、 毛果香月旨才勿CP. 6a/sa my^Yz swZ^p. ^7'c/ ocar; a)、 毛果香月旨一为美洲黑才为 杂交种(尸.6a/5^mz/era sw6^s/7. ^7'c/ ocar/ o！ x尸.t/e//oz'^y)、纟彖毛片为(P. "7Za&)、美洲黑杨(P. &/^>/^)、胡杨(尸.ew; / ra"ca)、欧美黑杨(尸. ewrawen'cawa)、杂交賓贞才勿(尸.A:z7aA:amZew57X)、大p十4为(i3. /as7'oca;77^0、 苦 才为(i3. /awn/o/z'fl)、 马氏才为(i3.附"x,wovWczh')、 毛果马氏冲为香月旨冲为杂交 种(尸.W2fljd附ow/cz" x尸.6a/samz/era w65p. ^7.cAoca厂pa)、 黑杨(i5.
m.gra)、西氏杨大齿白杨,杂交种CP. x P. grawd^她/(2)、甜杨
(尸.5wwo/^w)、川杨(,szec/mam'ca)、毛白才为(/5. fomew,asa)、欧洲山 杨(尸.^emw/a)、 欧洲山杨北美颤杨杂交种(尸.^emw/a x P. &emi//ozWe5)、北美颤才勿(尸.^eww/c^cfes)、 #會杨(尸.vW&ow")、力口拿大才勿 (P. Canadensis)、、真才为(i5. jtmwtmew^s7.51)), +>类^口火》巨+>(尸/"1 &e<ia)、 湿地松W"ws e仏'o"7)、 美国黄松W"ws po"6/em a)、 小干松W"ws cow^ Wa)牙口辐射^^(/^wt^厂ac/Za^0,花》真^^(尸sewdo^ywga wewzz.e5"),美 国西部铁杉(加拿大铁杉(rwga ca"a&"W力)，北美云杉(尸z'cea g7awca)， 纟工才》0Se《woZa 5^m; en^厂e"s)， 真才》(true fir) ^口 4艮斥乡(X6/es ama&7&)和香月旨冷杉(/7a&amea)及雪*〉类如大侧柏(北美乔柏 (J7my'a p/z'caM))和黄扁柏(C7^maeqy/7an'51 woo汰a化w5^)。
产生纤维的植物也$括在本发明中。示例性的作物是棉花(草棉 种((？o^w/pz'wm spp.))、 亚麻(Ziwwm w57Ya^s^s7'mwm)、 d、尊麻(异才朱尊麻 (t/厂"ca ^'oz'ca))、蛇麻(7/wmw/ws /wpw/w匀、4段杉于类(欧洲小叶才段(77"a cwY/Wa)、欧洲椴(r. x. ewra;^ea)和阔叶椴(r./ /fl(yp/^〃1^))、鹰爪豆 (iSpar〃ww2 y't/wceww)、 苎麻(5oe/jmen.a w/vea) 、 4者(万roiw^owe/j^ /7a/7yn/era), 達斤西兰麻(尸AormZwm ^wax)、 罗布麻(》兹麻(4pocyww附ca朋a6/w画》、秀尾类(道氏秀尾(/. dowg/肌'awa)、 /. macms7》/ ow和 /.p"r办/)、乳草类(马利筋种(Ac/印^ ^ec^力)、凤梨、香蕉和其它。 还包括饲料作物，如紫花苜蓿、黑麦草、羊茅和三叶草。
在本说明书中，"转基因植物"指的是已经引入核酸序列的植 物，核酸序列包括，但不限于正常地不存在于宿主植物基因组中的 基因、正常地不转录为RNA或翻译成蛋白质的核酸序列或者希望引 入到野生型植物中的任何其它基因或核酸序列，如可能正常地存在 于野生型植物中但希望进行遗传工程或改变表达的基因。"转基因 植物"类别包括原始转化体和其世系中的包括转化体的植物，例如 通过标准基因渗入或另一育种过程的途径。
"杂种植物"指的是由两个亲本植物的杂交(cross)产生的植物或 其部分，其中一个亲本是本发明的遗传工程化植物。这种杂交可以 通过，例如有性生殖天然发生或通过，例如体外核融合人工产生。 植物育种的方法是公知的且在植物生物学领域的普通技术人员的能 力范围内。
相反，未进行遗传操作的植物是对照植物，且称为"非转基因" 或"对照"植物。非转基因植物可以是其基因组未通过引入包含本 发明的多核苷酸序列或其片段的构建体而发生改变的植物。它也可
序列的构建体而发生在先改变的植物，或者可以包含由转基因植物 的自体受精产生的纯合隐性后代(即，不具有转基因的任何副本)。
可以预想，在一些情况中，本发明的转基因植物的基因组通过 转基因的稳定引入而扩增。但是在其它情况中，引入的基因取代内 源序列。按照本发明的相关优选基因是细胞壁关联激酶D N A序列， 例如从拟南芥获得的序列。
遗传工程的方法
按照本发明的构建体可以使用合适的技术引入任何植物细胞 中。单子叶和双子叶的纟皮子或#果子植物细胞都可以以本领域已知的各种方法进行遗传工程。例如，参见Klein等，1993,历o&c/mo/ogy 4: 583-590; Bechtold等，1993， C.兄爿ca《Pans 316: 1194-1199; Koncz和Schell, 1986, Mo/. G饥GWz". 204: 383-396; Paszkowski等, 1984, / 3: 2717-2722; Sagi等，1994,尸/a"Z Ce〃 13:
262-266。
例如，可以按照Nagel等，1990, M/cra6z'o/丄e" 67: 325的方法使 用土壤杆菌，如根癌土壤杆菌(A ^we/ac^^)和发根土壤杆菌04. W^ogewe力。简单地说，土壤杆菌可以通过例如电穿孔与植物表达载 体一起使用，这之后土壤杆菌通过例如公知的叶盘(leaf-disk)方法引 入植物细胞中。
用于完成这一任务的其它方法包括，但不限于通过根瘤菌属 (i /^o&ww)、 中华才艮瘤菌属OS&oW^o&wm)或中慢生根瘤菌属 (Me縱&油-謂)的转化(Broothaerts等，2005,淑瞬433: 629-633)、 电穿孔、基因枪轰击、磷酸钙沉淀、和聚乙二醇融合、转移到发芽 花粉粒中、直接转化(Lorz等，1985, Mo/. 199: 179-182)及本
领域中已知的其它方法。如果采用了选择标志如卡那霉素抗性，这 使得确定哪些细胞成功转化更容易。
上面讨论的土壤杆菌转化方法已知可用于转化双子叶植物。另 夕卜，de laPena等，1987,胸,325: 274-276; Rhodes等，1988, Sd置e 240: 204-207和Shimamoto等，1989， A^w" 328: 274-276(所有这些文 献通过引用引入本申请)已经用土壤杆菌转化谷类单子叶植物。另外 参见Bechtold禾口 Pelletier, 1998, AfeAotis Afo/.82: 259-266,其表
明真空渗入用于土壤杆菌介导的转化的用途。
蛋白质、多肽或核酸分子在特定细胞中的存在可以进行测量以 确定，例如是否细胞已经被成功转化或转染。完成这种分析的能力 是公知的，因而不需要在此反复说明。
定量纤维长度和植物高度
单词"纤维，，通常用于对共有以下特征的各种各样植物细胞类型进行统一具有细长的形状和厚细胞壁(通常，但并不总是，描
述为次生壁)中具有丰富的纤维素。这种细胞壁可能木质化或可能 未木质化，且这类细胞的原生质体可能在成熟时保持存活或不存活。 在某些行业中，术语"纤维，，通常包括厚壁传导细胞，如导管和管 胞，和许多个体纤维细胞的纤维聚集体。为了本发明的目的，术语
"纤维"包括(a)木质部的传导和非传导细胞；(b)木质部外来源 的纤维，包括来自韧皮部、树皮、基本组织和表皮的纤维和(c)来自 茎、叶、才艮、种子和花或花序的纤维。
本发明的转基因植物特征是纤维长度增加，且优选高度也增加。 遗传工程化植物中纤维长度的增加优选是通过发生细胞膨胀的植物 组织中WAK的超表达实现的。在描述本发明的植物时，"纤维长度 增加"指的是与野生型植物中纤维细胞的长度相比，植物中纤维细 胞的长度量增大。纤维长度的量增大可以通过几种技术测量，例如 数字化、Kajaani方法和纤维质量分析仪。Han等，1999, In: Kenaf Properties, Processing and Products, Mississipi State University, Ag & Bio Engineering, pp 149-167。
本发明的工程植物中的纤维长度比野生型植物的纤维长度长至 少5-15%，优选至少10-30%,且最优选至少20-50 %。
因为纤维长度增加可能跟随着植物高度的增加，本发明的转基 因植物可以具增大的纤维长度和高度。因此在本说明书中，短语"植 物高度增加"表示与野生型植物的高度相比植物高度的量增大。本 发明的工程植物的高度可以增加到野生型植物高度的大约5 % -大约 90%，优选大约10%-大约75%，甚至更优选大约15%-大约65%的水 平。 '
下面给出获得细胞壁关联激酶基因以及通过土壤杆菌引入目标 基因以产生植物转化体的特定实施例。它们是示例性的且不构成对 本发明的限制。实施例1
从拟南芥分离细胞壁关联激酶DNA序列
(a) 从拟南芥茎的RNA制备和cDNA合成
三个月大的拟南芥植物的茎插条切割成小片，在液氮中冷冻并 用于通过溴化十六烷三曱基铵(CTAB)提取方法进行RNA提取。 Aldrich和Cullis， 1993, Plant Mol. Biol. Report, 11: 128-141。 cDNA池 用于其中分离的总RNA用作模板的RT-PCR试验，且Superscript II 逆转录酶(Invitrogen)和寡(dT)引物用于合成第 一链cDNA。如下所述， 双链cDNA使用基因特异性引物通过后续的聚合酶反应获得。
(b) 引物设计
表现来自拟南芥的细胞壁关联激酶4 mRNA的cDNA序列已确 认并以登录号NM101974保存于GenBank中。基于这一序列，DNA 寡聚体合成为PCR引物，包括编码细胞壁关联激酶4的主ORF的第 一密码子ATG附近的区域或终止密码子附近的区域。
引物设计为扩增胞壁关联激酶4的ORF的整个编码区域，即从 ATG到翻译终止密码子。引物的序列在下面给出 WAK—NDE 长度23 SEQ ID NO: 11
CATATGAAAGTGCAGCGTCTGTT WAK—XBA 长度23 SEQ ID NO: 12
TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAA
(c) PCR扩增
在(a)中获得的cDNA样品用作模板，且在(b)中设计的引物用于 PCR。 PCR步骤包括在94°C1分钟、50°C1分钟和72°C2分钟的40 个循环，接着在72。C7分钟的额外延长步骤。PCR产物通过1.0y。琼 脂糖的凝胶电泳进行分离，接着进行电泳凝胶的溴化乙锭染色和在 U V透射仪中检测扩增带。核实所检测的扩增带并用剃刀切割琼脂糖 凝胶。凝胶片转移到1.5mL的微管中，且DNA片段使用GFX PCR 净化和凝胶带纯化试剂盒(Amersham)分离和纯化。回收的DNA片段 亚克隆到pGEM-T克隆载体(Promega)中，转化到大肠杆菌中，然后用于按照通常方式制备质粒DNA,其随后使用BigDye化学(Applied Biosystems)通过双脱氧法测序以产生这里公开为SEQ ID NO: 1的 DNA序列，用于本发明的用途。
实施例2
转基因烟草(TWcWiVz/ifl似6fltcw挑)植物的制备
在上面实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被引入植物宿主 中以产生转基因烟草植物。
(a) 构建体的制备和土壤杆菌的转化
表达构建体通过用合适的限制性内切酶切割上面实施例1中获 得的细胞壁关联激酶基因以包括所有的可译框架并与合适的启动子 一起将该基因插入植物转化载体pALELLYX-WAK(图l)中而制备。 例如，实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被克隆到上述表达载 体中来自美洲黑杨的木质部-优先管状蛋白基因(TUB)启动子的下 游，如国际申请WQ 2005/096805中所述。获得的表达构建体在大肠 杆菌中扩增，然后通过冻融转化到根癌土壤杆菌LBA4404品系中。
(b) 土壤杆菌介导的烟草转化
烟草属的种的转化使用Horsh等，1985, Science 227: 1229的叶 盘方法利用包含可操作地与木质部-优先基因的TUB启动子连接的(a) 中获得的细胞壁关联激酶基因的核酸构建体完成。转化体在包含100 mg/L的卡那霉素和500 mg/L的羧千青霉素(Sigma)的Murashige和 Skoog培养基(Sigma, St. Louis, MO)上选择。使转化的烟草苗在 Murashige和Skoog培养基上生根，且随后转移到土壤中并在温室中 生长。
(c) 外源基因插入宿主植物基因组中的PCR核实 PCR可用于核实基因构建体在转基因植物基因组中的整合。PCR
反应混合物在50 的总体积中含有100 ng转化植物的基因组DNA 及0.2 的如上所述的各引物、100 的各脱氧核糖核苷三磷酸、 5 的PCR緩冲液和2.5单位的Ampl汀aq DNA聚合酶(Applied Biosystems)。循环参数如下94°C1分钟、50°C1分钟和72°C3分钟，40个循环，加上72。C5分钟的延伸。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上 进行电泳。
(d)转基因植物中转基因表达水平的确定
半定量RT-PCR用于检测转基因植物的茎组织中细胞壁关联激 酶转录物的累积。总RNA使用Aldrich和Cullis， 1993, P/a^Mo/.肠/. i 印or/, 11: 128-141的CTAB方法从3个月大转基因烟草T0和Tl植 物的茎插条分离。
cDNA使用Superscript II核糖核酸酶H- RT (Invitrogen， USA)从 500 ng的总RNA合成。上面描述的引物与作为内部对照以使各样品 中使用的总RNA的质量标准化的用于编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH)的组成性基因的引物 一起使用。PCR以第 一 链cDNA的12.5 倍稀释在以下条件下进行94°C3分钟和27个循环的94°C1分钟， 52-60。C45秒，及72。C1分30秒。
实施例3
在维管组织中超表达细胞壁关联激酶基因的烟草转基因植物中纤维 长度的增加
对应于5个月大转基因和对照植物的50%高度的茎区域在70°C 下乙酸-过氧化物溶液中浸解48小时或者直到获得单细胞。细胞用番 红染色并在装配有与个人计算机连接的照相机(Sony)的显微镜(Leica DMIL)下检验。细胞(大约每个家系IOO个)使用"Image Tool"软件直 接在筛分机(screen)测量。
已知按照实施例2中详细描述的过程表达转基因的三个转基因 事件显示纤维长度的统计学显著的增加(图2)。转基因事件43B与对 照植物相比表现出纤维长度21%的增加。<0.05， t检验)。转基因事 件47B与对照植物相比表现出纤维长度19%的增加(图2; P<0.05， t 检验)。另外，转基因事件48B与对照植物相比表现出纤维长度15% 的增加(图2; PO.05, t检验)。
值得注意的是，通过果胶甲酯酶基因的超表达增加纤维长度的 另 一策略(Berthold等，WO 2006/068603)已经获得与对照植物相比转基因植物纤维长度仅5 %的增加。
在生长到成熟后，T0事件自我受精(self)以产生Tl品系。当与 纯合隐性植物相比时，纯合显性的植物在纤维长度上存在着10%的 显著增长(P0.05, t检验)。这些结果在两个不同的家系中观察到(图 3和图4)。
实施例4
在维管组织中超表达细胞壁关联激酶基因的烟草转基因植物中植物 高度的增加
由转基因植物的自体受精产生的Tl后代在播种3周后个别地 移栽到花盆中。定期对生长进行测量直到首次开花(植物大约5个月 大)，并记录为总高度。
表现的结果是在不同品系的纯合显性植物中观察到植物高度 增加的实例。对来自事件51B的三个基因型的植物高度进行了对比。 纯合显性植物比纯合隐性植物高12%。半合子植物比纯合隐性植物 高9%(P<0.05, t检验)(图5)。
实施例5
转基因杨属植物的制备
在上述实施例1中获得的基因引入植物宿主中以产生转基因 杨属植物。
(a) 构建体的制备和土壤杆菌的转化
表达构建体可以通过用合适的限制性内切酶切割上面实施例1 中获得的细胞壁关联激酶基因以包括所有的可译框架，并与合适的 启动子一起将该基因插入植物转化载体pALELLYX-WAK(图l)中而 制备。例如，实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被克隆到上述 表达载体中来自美洲黑杨的木质部-优先管状蛋白基因(TUB)启动子 的下游，如国际申请WQ 2005/096805中所述。获得的表达构建体在 大肠杆菌中扩增，然后通过冻融转化到根癌土壤杆菌LBA4404家系 中。
(b) 土壤杆菌介导的杨属转化野生型山杨使用携带包含可操作地与木质部-优先基因(T UB) 的启动子连接的实施例1中获得的拟南芥细胞壁关联激酶基因的构 建体的根癌土壤杆菌转化。来自体外微繁殖的植物的叶柄和节间茎 段用作外植体。转化的苗在包含100mg/L的卡那霉素的再生培养基 上选择并使其在Murashige和Skoog培养基上生根。所选择的植物随 后转移到土壤中并在温室中生长。
权利要求
1.一种核酸构建体，包含与木质部优先启动子可操作地连接的WAK多核苷酸序列，该启动子引起所述WAK多核苷酸序列的超表达。
2. 如权利要求1所述的构建体，其中所述木质部优先启动子选 自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H基因启动子。
3. —种包含权利要求1的核酸构建体的转基因植物，其中所述 植物与同种的非转基因植物相比纤维长度和/或高度增加。
4. 如权利要求3所述的转基因植物，其中所述木质部优先启动 子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和 C4H基因启动子。
5. 如权利要求3所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
6. 如权利要求3所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
7. 如权利要求3所述的转基因植物，其中所述植物是棵子植物。
8. 如权利要求3所述的转基因植物，其中所述植物是阔叶树。
9. 如权利要求8所述的转基因植物，其中所述阔叶树是桉
10. 如权利要求8所述的转基因植物，其中所述阔叶树是杨
11. 如权利要求7所述的转基因植物，其中所述棵子植物是松 W薩)树。
12. 权利要求3的转基因植物的部分，其中所述部分选自叶、茎、 花、子房、果实、种子和愈伤组织。
13. 权利要求3的转基因植物的后代。
14. 如权利要求13所述的后代，其中所述后代是杂种植物。
15. 增加纤维长度和/或植物高度的方法，包括的WAK多核苷酸序列的核酸构建体，该木质部优先启动子引起所述 WAK多核苷酸序列的超表达；(b) 在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞；和(c) 选择与同种的非转基因植物相比具有增加的纤维长度和/或 植物高度的转基因植物。
16. 如权利要求15所述的方法，其中所述木质部优先启动子选 自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H 基因启动子。
17. 从权利要求3的转基因植物获得的木浆。
18. 从权利要求3的转基因植物获得的木纤维。
全文摘要
本发明公开了用于改变纤维长度、植物高度和/或植物组织中的植物生物质的核酸构建体和方法。植物用编码拟南芥细胞壁关联激酶基因的构建体进行遗传工程化，当该基因在形成层/木质部优先启动子的控制下超表达时改变纤维长度和/或植物高度。带有细胞壁关联激酶基因的植物转化体表现出增加的纤维长度，这被认为是用于改善木质树木的制浆和造纸性能的一种性状。
文档编号C12N9/12GK101583719SQ200780046680
公开日2009年11月18日 申请日期2007年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者I·R·格哈特, P·阿鲁达 申请人:阿莱利克斯有限公司