新的n-乙酰葡糖胺-2-表异构酶以及使用该酶生产cmp-神经氨酸的方法

专利名称：：新的n-乙酰葡糖胺-2-表异构酶以及使用该酶生产cmp-神经氨酸的方法
技术领域：
：本发明涉及新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和用于生产CMP-神经氨酸的方法，更具体涉及来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶生产CMP-N-乙酰神经氨酸的方法。
背景技术：
：近来，由于对糖链的结构和功能的研究迅速发展，寡聚糖、糖脂和糖蛋白以及类似物的生理活性及作为药物或功能物质的使用的发展受到人们的关注。其中，末端具有N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的含唾液酸的糖链具有重要的功能，诸如在细胞粘着或者病毒感染时起到受体的作用。含唾液酸的糖链一般通过唾液酸转移酶的催化合成。唾液酸转移酶是使用CMP-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)作为糖供体将唾液酸转移到受体，诸如糖链的酶。但是，被用作糖供体的CMP-NeuAc非常昂贵，并且仅仅供应以仅仅足够用作试剂的很少的量。已知的用于生产CMP-NeuAc的方法包括使用5'-胞苷三磷酸(CTP)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc)作为底物通过CMP-NeuAc合成酶的作用合成CMP-NeuAc，但被用作生产CMP-NeuAc的原材料CTP和NeuAc非常昂贵，因此使用这些材料合成的CMP-NeuAc也非常昂贵。近来，发展了将乳清酸转化成尿嘧啶5，-三磷酸(UTP)的产氨短杆菌(Brevibacteriumammoniagenes)与生产催化UTP转化成CTP的反应的CTP合成酶的重组大肠杆菌和生产CMP-NeuAc合成酶的重组大肠杆菌组合，并在重组有机体中使用乳清酸和NeuAc作为原材料合成CMP-NeuAc的方法。虽然该方法没有使用昂贵的CTP，但其并不被认为是一种实用的方法，因为该过程很复杂，例如，由于使用多种细菌菌株制备重组菌株，必须准备用于实施该过程的很大尺寸的操作台，并且仍然需要用昂贵的NeuAc作为原材料。同时，关于NeuAc的制备，包括从微生物中收集作为唾液酸聚合物的多聚乙酰神经氨糖酸(colominicacid)并将收集的多聚乙酰神经氨糖酸化学分解的方法是已知的，然而使用酶催化生产NeuAc的方法是新近才发展起来的。已经报道的生产CMP-神经氨酸(CMP-NeuAc)的方法包括(1)通过N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)使用N-乙酰神经氨酸裂解酶或者N-乙酰神经氨酸合成酶催化生产CMP-NeuAc的方法(J.Am.Chem.Soc.,110:6481，1988;J.Am.Chem.Soc.，110:7159，1988;日本专利公开10-4961);(2)在碱性条件下通过将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)转化成N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)并将N-乙酰神经氨酸裂解酶或者N-乙酰神经氨酸合成酶加入到其中以生产N-乙酰神经氨酸(NeuAc)的方法(日本专利公开5-211884;Biotechnol.Bioeng.,66:2,1999;EnzymeMicrob.Technol.,20,1997)，(3)使用催化GlcNAc转化成MamNAc的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶，和NeuAc裂解酶或合成酶由GlcNAc生产CMP-NeuAc的方法(WO95/26399;日本专利公开3-180190;日本专利公开2001-136982);以及(4)使用大肠杆菌和酵母菌合成CMP-N-乙酰神经氨酸的方法(WO2004/009830)。但是，方法(l)具有的问题在于原材料N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)很贵，方法(2)使用廉价的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，但具有的问题在于从GlcNAc和N-乙酰甘露糖胺(ManNAc)的混合物中纯化ManNAc的过程很复杂。而且，方法(3)具有的问题在于，由于GlcNAc2-表异构酶需要昂贵的ATP，ATP必须被加入或者必须利用微生物由ATP前体腺嘌呤生产，方法(4)具有的问题在于，该过程由于使用大肠杆菌和酵母细胞而非常复杂。N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶已知在猪或鼠的肾脏、肝脏、脾、大脑、肠液、胸腺、胰腺、唾液腺中被发现，其性质已经使用来源于猪的酶进行了检査，并且表异构酶主要从来自动物的基因中提取并进行研究(Biochemistry,17:3363,1970;Biochem.J.，210:21,1983;PNAS，52:371，1964)。而且，作为来源于猪的基因的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶基因是已知的(J.Biol.Chem.,271:16294,1996)。在微生物中，一种蓝细菌(Cyanobacteria)，集胞藻属(Synechocystissp.)PCC6803的全基因组序列被测定，并且从基因组中确认了N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的基因序列(DNAResearch,3:109,1996;NucleicAcidsResearch,26:63,1998)。同时，韩国专利公开10-2001-0102019涉及N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和编码该酶的DNA，并公开了该发明的发明人在一种蓝细菌(Cyanobacteria)，集胞藻属(Synechocystis)中发现的N-乙酰葡糖胺曙2-表异构酶并且使用DNA编码该N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的的方法。而且，韩国专利公开10-2006-0010706公开了如下生产CMP-N-乙酰神经氨酸的方法通过将胞苷酸(CMP)、N-乙酰葡糖胺、丙酮酸和酵母加入到用含有由编码N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的基因和编码N-乙酰神经氨酸醛縮酶的基因的共表达载体转化的重组菌株中，从而产生神经氨酸，然后将CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶加入到产生的神经氨酸中；或者通过将胞苷酸(CMP)、N-乙酰葡糖胺、丙酮酸和酵母加入到用含有由编码N-乙酰神经氨酸醛縮酶的基因和编码CMP-N-乙酰葡糖胺合成酶的基因的共表达载体转化的重组菌株中。但是，该方法具有的问题在于，其中需要多个步骤来产生CMP-N-乙酰神经氨酸，并且用作底物的胞苷酸(CMP)转化成胞苷三磷酸(CTP)的产量很低。因此，本发明的发明人付出了极大的努力来开发以经济简单的方式生产CMP-N-乙酰神经氨酸的方法。结果，本发明的发明人在脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343中发现了新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶并确定CMP-N-乙酰神经氨酸可通过一锅式反应(one-potreaction)高浓度生产，所述反应使用多种底物和酶的混合物，包括N-乙酰葡糖胺-2-异构酶，所述酶通过将表达该酶的基因转化到重组载体中得到，廉价底物胞苷酸(CMP)和非常少量的NTP，从而完成了本发明。
发明内容本发明的主要目的在于提供新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和用于制备N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的方法，所述方法包括培养用含有编码所述酶的重组载体转化的重组微生物。本发明的另一目的在于提供通过使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶以及多种底物和酶的混合物的一锅式反应制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法。为了实现上述目的，本发明提供了具有氨基酸序列为SEQIDNO:2的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶。本发明还提供了编码所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的基因，含有所述基因的重组载体，转化有所述重组载体的重组微生物，以及制备所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的方法，所述方法包括培养所述重组微生物；并回收N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶。本发明还提供了制备N-乙酰-D-甘露糖胺的方法，所述方法包括将含有N-乙酰-D-葡糖胺的反应混合物在所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的存在下进行反应并回收所述N-乙酰-D-甘露糖胺。本发明还提供了制备神经氨酸的方法，所述方法包括将含有丙酮酸和N-乙酰-D-甘露糖胺的反应混合物在N-乙酰神经氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)的存在下进行反应；并回收所述神经氨酸。本发明还提供了制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，所述方法包括将含有下列物质的反应混合物进行反应(i)胞苷5，-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，所述反应在下列物质存在下进行(a)N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcNAc2-表异构酶)，(b)N-乙酰神经氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)；并且回收所述CMP-N-乙酰神经氨酸。通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是显而易见的。图1是显示合成CMP-N-乙酰神经氨酸的过程的示意图。图2显示了含有N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶-编码基因(nanE)的重组载体。图3显示了含有N-乙酰神经氨酸醛縮酶-编码基因(nan)的重组载体。图4显示了含有5'磷酸激酶-编码基因(cmk)的重组载体。图5显示了含有醋酸激酶-编码基因(ack)的重组载体。图6显示了含有CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶-编码基因(neu)的重组载体。图7显示了所进行的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的结果，以检査每种酶是否被表达(第1道标记物；第2道胞苷5，磷酸激酶；第3道醋酸激酶；第4道CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶；第5道N-乙酰神经氨酸醛縮酶；第6道乙酰葡糖胺-2-表异构酶)。图8显示了所进行的十二垸基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的结果，以检査每种纯化的酶是否被表达(第l道标记物；第2道纯化胞苷5'磷酸激酶；第3道纯化醋酸激酶；第4道纯化CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶；第5道纯化N-乙酰神经氨酸醛縮酶；第6道纯化乙酰葡糖胺-2-表异构酶)。图9显示了CMP-N-乙酰神经氨酸的^核磁共振。HNMR)分析结果。图10显示了CMP-N-乙酰神经氨酸的高效液相色谱(HPLC)分析结果。发明详述以及优选实施例在一个方面，本发明涉及在CMP-N-乙酰神经氨酸合成中涉及的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶，编码所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的基因，含有所述基因的重组载体，用所述重组载体转化的重组微生物，以及制备N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的方法，所述方法包括培养所述重组微生物。在本发明中，所述基因优选具有SEQIDNO:l的碱基序列。所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶是来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的酶，并且显示与集胞藻属(Synechocystissp.)和多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的相应基因具有35.06-32.9%的相似性。在另一方面，本发明涉及制备N-乙酰-D-甘露糖胺和神经氨酸的方法，其特征在于使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶。在还一方面，本发明涉及通过使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的一锅式反应制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法。根据本发明的CMP-N-乙酰神经氨酸可通过允许下列反应混合物来生产(i)胞苷5，-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，在下列物质存在下发生反应来生产(a)N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcNAc2-表异构酶)，(b)N-乙酰神经氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸9激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)。根据本发明，胞苷三磷酸(CTP)由廉价底物胞苷酸(CMP)通过CMP激酶和醋酸激酶经胞苷二磷酸(CDP)以高于97%的产量来合成。作为用于所述CDP的磷酸供体，非常少量的NTP被使用，并且NDP很节约，因为其被过量乙酰Pi和醋酸激酶重新被利用。特别是，在本发明中，在反应完成之后用于除去作为杂质的ADP残余物的复杂过程可通过使用CTP来代替ATP作为用于CDP的磷酸供体而被消除。而且，根据本发明，N-乙酰-D-葡糖胺(GlacNAc)由N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶转化成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，并且由ManNAc和丙酮酸通过NeuAc醛縮酶合成神经氨酸。上述合成的CTP和神经氨酸由CMP-NeuAc合成酶合成CMP-N-乙酰神经氨酸(图l)。在本发明中，所述核苷三磷酸(NTP)或者ATP优选由乙酰Pi和醋酸激酶再生，所述核苷三磷酸(NTP)优选为胞苷三磷酸(CTP)。在本发明中，所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶、N-乙酰神经氨酸醛縮酶、胞苷5'磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶优选被固定于载体上，并且所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶、N-乙酰神经氨酸醛縮酶、胞苷5，磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶优选分别由碱基序列SEQIDNO:1，SEQIDNO:5,SEQIDNO:8,SEQIDNO:11andSEQIDNO:14编码。根据本发明，CMP-N-乙酰神经氨酸的合成成本可极大地降低，因为CMP-N-乙酰神经氨酸可通过纯化每种高表达酶并将纯化的酶固定在聚合物小珠，诸如几丁质上，在一步工序中被合成，不需要进行重复的合成步骤。酶的固定可使用常规酶固定化方式(共价结合，使用多官能团试剂交联，吸附，微囊化等等)来进行。酶的纯化可使用常规酶纯化方式来进行(盐析，等电点沉淀，透析，各种色谱过程，等等)，使用所述纯化工艺得到的辅酶或者纯化的酶可被使用，并且将所述酶固定在聚合物小珠上的过程可使用常规的酶固定化过程来进行。使用所述过程纯化的酶在其被固定在聚合物小珠上的状态下可被使用20次以上，因此回收酶的成本降低，其回收步骤被简化。根据本发明，将所述各种底物和酶的混合物进行一锅式反应，因此，每种酶的反应能力可被最大化，并且CMP-N-乙酰神经氨酸可以超过900/0的高产量被合成，即便使用很少量的酶和底物也是如此。特别值得一提的是，在其中N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶单独反应的情况下，CMP-N-乙酰神经氨酸的合成产量将低于50%，但当进行一锅式反应时，CMP-N-乙酰神经氨酸可以超过90%的高产量被合成。在本发明中使用的N-乙酰神经氨酸醛縮酶、CMP激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶是已知的酶，并且可按照常规方式来制备。但是，优选使用重组DNA技术来制备这些酶，包括所述基因的克隆，含有克隆的DNA片段的重组载体的构建，含有被引入到其中的重组载体的转化体的构建，以及通过转化体的培养的目标酶蛋白质的生产。用于转化的宿主细胞没有特别的限制，但考虑到操作和方便，优选使用大肠杆菌。作为在本发明中使用的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶，使用从脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶编码基因。脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC的基因组DNA的全部序列被测定(US7,090,973)，但N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的功能仍然未知。在本文中，术语"载体"指的是含有DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作地与能够影响DNA在合适宿主中的表达的合适控制序列连接。载体的例子包括质粒、噬菌体粒子或者简单的潜在基因插入物。一旦被转化到合适宿主中，载体可复制并独立于宿主基因组起作用，或者在一些情况下可整合到基因组本身中。在本文中，术语"质粒"和"载体"有时候被互换使用，因为质粒是目前最常用的载体形式。出于本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于该目的的典型质粒载体包括如下(a)复制起点，通过其有效地发生复制，使每个宿主细胞中数百个质粒载体被形成；(b)抗生素抗性基因，使用质粒载体转化的宿主细胞通过其可被选择；和(c)限制性内切酶消化位点，外源DNA片段可插入到其中。即便合适的限制性内切酶消化位点在载体中不存在，常规合成的寡核苷酸接头或连接子的使用也使载体和外源DNA片段之间很容易连接(ligation)。在连接之后，载体应当被转化到合适的宿主细胞中。转化可以使用公知的氯化钙法很容易实现。选择性电转化(Neumann等人，EMBOJ.，1:841，1982)也可在所述宿主细胞的转化中使用。为了大量的表达基因，本领域已知的表达载体可在本发明中使用。当核酸被设置成与另一核酸序列成功能关系时，其"可操作地连接"。"可操作地连接"意味着，基因和一个或多个调节序列以这种方式连接当合适分子(例如转录活化蛋白)结合到调节序列上时允许基因表达。例如，如果DNA被表达为在参与多肽分泌中的蛋白质，用于前置序列或者分泌型前导序列可操作地连接到用于多肽的所述DNA;如果编码序列影响序列的转录，启动子或增强子可操作地与该编码序列连接；或者如果编码序列被定位以便翻译，核糖体结合位点可操作地与该编码序列连接。一般说来，"可操作地连接"的意思是被连接的DNA序列是相邻的，并且在分泌型前导序列的情况下，相邻并在开放阅读框中存在。但是，增强子不一定要相邻。连接通过在常规限制位点连接来实现。如果所述位点不存在，合成的寡核苷酸接头或者连接子按照常规实践被使用。对本领域技术人员来说公知的是，为了增加转染的基因在宿主细胞中的表达水平，基因应当可操作地连接到可在所选表达宿主中起作用的转录和翻译控制序列中。优选地，相应基因和表达控制序列包含在包括选择性标记物和复制起始区的表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，表达载体应当进一步包括在真核表达宿主细胞中有用的表达标记物。使用所述重组载体转化的宿主细胞构成了本发明的另一方面。在本文中，术语"转化"指的是将DNA引入到宿主细胞中，使DNA可复制，或者作为构成染色体的一部分(integrant)或者作为染色体外构件。当然，应当理解，在本发明中提到的载体在表达DNA序列的功能并不相同。同样地，对于相同的表达系统，所用到的宿主细胞也不能起到完全一样的作用。但是，本领域技术人员可选择合适的载体，表达控制序列和宿主细胞，而不背离本发明的精神，并且不需要过度的进行实验。例如，在载体的选择中，宿主细胞必须被考虑。这是因为载体将会在其中复制。而且，载体的复制数和控制复制数的能力以及由载体编码的其他蛋白质例如抗生物标记物的表达应当被考虑。实施例此后，将参照实施例更详细地描述本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不应当理解为对本发明范围的限制。实施例1:基因的克隆和转化1-1:编码N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的nanE基因(SEOIDNO:1)的克隆和转化为了消除将N-乙酰-D-葡糖胺异构化成N-乙酰-D-甘露糖胺的步骤(其在实现增加CMP-N-乙酰神经氨酸的制备产量并降低生产成本的目标中作为最大问题指出)，N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcNAc2表异构酶)从各种来源寻找。三种N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶状基因从厌氧微生物脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343(NC—003228)中被发现。13用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的候选基因No.l位于947856-949034的区域中，具有1179bp大小，并显示了与苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)和人类(Homosapiens)的相应基因具有23.68-24.44%的相似性。用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的候选基因No.2位于1996625-1997809的范围内,具有1185bp的大小，并显示了与集胞藻属(Synechocystissp).禾卩多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的相应基因具有35.06-32.9%的相似性。用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的候选基因No.3位于4765592-4766353的范围内,具有762bp的大小，并显示了与红小梨形菌属(Rhodopirellulabaltica)和集胞藻属(Synechocystissp)的相应基因具有48.18-34.97%的相似性。将每个基因插入到pET表达载体(Novagen)中，所述表达载体然后被转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中。结果，观察到用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的候选基因No.l和2高表达为可溶性蛋白质，但候选基因No.3不表达为可溶性蛋白质，但表达为不溶性蛋白质。为了检测高表达候选基因No.l和2的活性，用于表达N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和N-乙酰神经氨酸醛縮酶的候选基因No.l和2以及其活性被测定，使用N-乙酰-D-葡糖胺和丙酮酸作为底物在一步法过程中发生反应。产生的神经氨酸使用糖分析系统(Metrohm)进行分析。结果，可以看到，用于表达N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的候选基因No.l没有活性，而用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶候选基因No.2具有非常好的活性。而且，将候选基因的活性在相同条件下(50mMN-乙酰D-葡糖胺，100-200mM丙酮酸10mMMgCl2,50mM-100mMTrisHC1,30-40°C)与人N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(有机体="Homosapiens,ene="RENBP",由_编码="NM—002910.4:203..1456")的活性进行比较，结果，用于N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶候选基因No.2显示了非常高的反应速度和产量。因此，候选基因No.2被选择作为N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶。为了克隆编码N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcNAc-表异构酶)的nanE基因(SEQIDNO:2)使用脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的染色体DNA作为模板和SEQIDNO:3以及SEQIDNO:4作为引物通过PCR扩增SEQIDNO:3:5'-ctgccatggttatgaatactacagSEQIDNO:4:5'-aatggatecttatttttctgacagPCR扩增使用lpl(10pmol)的DNA，1^1的每种引物，4^1的Primix(Genotech)和l化l的蒸馏水在防蒸发(Mastercycler)梯度PCR系统(Ependorf)中进行30个循环，每个循环在96'C下变性1min，在40.2t:下退火lmin并在72。C下延伸2min。扩增的PCR产物使用质粒微-沉淀试剂盒(plasmidmini-prepkit，Solgent)纯化，然后通过加入70。/。的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通过琼脂糖凝胶电泳分析以纯化1.2-kb的DNA片段。纯化的DNA使用限制性内切酶Ncol和BamHI消化，并使用连接酶与使用相同的限制性内切酶Ncol和BamHI消化的质粒pET28a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)连接(图2)。重组载体被引入到大肠杆菌XL-Blue中以得到抗卡那霉素的转化体，从而从其中分离质粒pNANEe。pNANEe质粒是其中含有脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)的nanE基因的结构基因的DNA片段被插入到pET28a(+)的T7启动子的NcoI-BamHI消化位点下游的质粒。使用通过氯化钙处理将质粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159，1970)将重组基因引入到高表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中。得到的转化体被命名为"E.coli/pNANe"。1-2:编码N-乙酰神经氨酸醛縮酶的nanA基因的克隆和转化为了克隆编码N-乙酰神经氨酸醛縮酶的nanA基因(SEQIDNO:5)，nanA基因使用大肠杆菌K-12C600的染色体DNA作为模板和SEQIDNO:6以及SEQIDNO:7作为引物通过PCR进行扩增SEQIDNO:6:5'-ggtatccatggcaacgaatttacgSEQIDNO:7:5'-ggtaggctcgagcgaggggaaacPCR扩增使用lnl(10pmol)的DNA，的每种引物，4^1的Primix(Genotech)和14^1的蒸馏水在Mastercycler梯度PCR系统(Ependorf)中进行30个循环，每个循环在96'C下变性1min，在50.2'C下退火lmin并在72'C下延伸2min。扩增的PCR产物使用质粒微-沉淀试剂盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)纯化，然后通过加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通过琼脂糖凝胶电泳分析以纯化0.9-kb的DNA片段。纯化的DNA使用限制性内切酶Ncol和Xhol消化，并使用连接酶与使用相同的限制性内切酶Ncol和Xhol消化的质粒pET32a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)连接(图3)。得到的载体被转化到大肠杆菌XL-Blue中以得到抗氨苄青霉素的转化体，从而从其中分离质粒pNANa。pNANa质粒是其中含有E.coliK-12C600的nanE基因的结构基因的DNA片段被插入到pET32a(+)的T7启动子的Ncol-Xhol消化位点下游的质粒。使用通过氯化钙处理将质粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159，1970)将重组基因引入到高表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的转化体被命名为"E.coli/pNANa"。1-3:编码胞苷5'-磷酸激酶的cmk基因的克隆和转化为了克隆编码胞苷5，-磷酸激酶的cmk基因(SEQIDNO:8)，cmk基因使用大肠杆菌K-12的染色体DNA作为模板和SEQIDNO:9以及SEQIDNO:10作为引物通过PCR进行扩增SEQIDNO:9:5'-catatgacggcaattgccccggttattacSEQIDNO:10:5'-gaattcggtcgcttatgcgagagecPCR扩增使用lpl(10pmol)的DNA，lpl的每种引物，4pl的Primix(Genotech)和14^1的蒸馏水在Mastercycler梯度PCR系统(Ependorf)中进行30个循环，每个循环在96X:下变性1min，在55.7'C下退火lmin并在72。C下延伸2min。扩增的PCR产物使用质粒微-沉淀试剂盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)纯化，然后通过加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通过琼脂糖凝胶电泳分析以纯化0.7-kb的DNA片段。纯化的DNA使用限制性内切酶Ndel和EcoRI消化，并使用连接酶与使用相同的限制性内切酶Ndel和EcoRI消化的质粒pET22b(+)(Novagen)T4DNA(Takara)连接(图4)。得到的载体被引入到大肠杆菌XL-Blue中以得到抗氨苄青霉素的转化体，从而从其中分离质粒pCMK。质粒pCMK是其中含有E.coliK-12C600的cmk基因的结构基因的DNA片段被插入到pET22b(+)的T7启动子的Ndel和EcoRI消化位点下游的质粒。使用通过氯化钙处理将质粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159,1970)将重组基因引入到高表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的转化体被命名为"E.coli/pCMK"。1-4:编码醋酸激酶的ack基因的克隆和转化为了克隆编码醋酸激酶的ack基因(SEQIDNO:11)，ack基因使用大肠杆菌K-12的染色体DNA作为模板和SEQIDNO:12以及SEQIDNO:13作为引物通过PCR进行扩增SEQIDNO:12:5'-catatgtcgagtaagttagtttctgSEQIDNO:13:5'-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtcPCR扩增使用liil(lOpmol)的DNA，1|^的每种引物，4pi的Primix(Genotech)和14^il的蒸馏水在Mastercycler梯度PCR系统(Ependorf)中进行30个循环，每个循环在96""C下变性1min，在58/TC下退火lmin并17在72。C下延伸2min。扩增的PCR产物使用质粒微-沉淀试剂盒(plasmidmini-prepkit，Solgent)纯化，然后通过加入70。/。的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通过琼脂糖凝胶电泳分析以纯化1.2-kb的DNA片段。纯化的DNA使用限制性内切酶Ndel和EcoRI消化，并使用连接酶与使用相同的限制性内切酶Ndel和EcoRI消化的质粒pET24ma(+)(Novagen)T4DNA(Takara)连接(图5)。得到的载体被转化引入到大肠杆菌XL-Blue中以得到抗卡那霉素的转化体，从而从其中分离质粒pACKa。质粒pACKa是其中含有E.coliK-12C600染色体DNA的ack基因的结构基因的DNA片段被插入到pET24ma(+)的T7启动子的Ndel和EcoRI消化位点下游的质粒。使用通过氯化钙处理将质粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.,53:159,1970)将重组基因引入到高表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)中。得到的转化体被命名为"E.coli/pACKa"。1-5:编码CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶的neu基因的克隆和转化为了克隆编码CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶的neu基因(SEQIDNO:14)，neu基因使用脑膜炎球菌(Neisseriameningitides)(KoramBiotech)的染色体DNA作为模板和SEQIDNO:15以及SEQIDNO:16作为引物通过PCR进行扩增SE(^IDNO:15:5'-aagcatatggaaaaacaaaatattgcgSEQIDNO:16:5'-gtggaattcttagctttccttgtgPCR扩增使用lpl(10pmol)的DNA，1^1的每种引物，化l的Primix(Genotech)和14|il的蒸馏水在Mastercycler梯度PCR系统(Ependorf)中进行30个循环，每个循环在96'C下变性1min，在57.7'C下退火lmin并在72'C下延伸2min。扩增的PCR产物使用质粒微-沉淀试剂盒(plasmidmini-prepkit,Solgent)纯化，然后通过加入70%的乙醇沉淀DNA。沉淀的DNA通过琼脂糖凝胶电泳分析以纯化0.7-kb的DNA片段。纯化的DNA使用限制性内切酶Ndel和EcoRI消化，并使用连接酶与使用相同的限制性内切酶Ndel和EcoRI消化的质粒pET32a(+)(Novagen)T4DNA(Takara)连接(图6)。得到的载体被引入到大肠杆菌XL-Blue中以得到抗氨节青霉素的转化体，从而从其中分离质粒pSYNb。质粒pSYNb是其中含有脑膜炎球菌(Neisseriameningitides)的synB基因的结构基因的DNA片段被插入到pET24ma(+)的T7启动子的Ndel和EcoRI消化位点下游的质粒。使用通过氯化钙处理将质粒引入到菌株中的方法(J.Mol.Biol.，53:159,1970)将重组基因引入到高表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中。得到的转化体被命名为"E.coli/pSYNb"。实施例2:酶表达分析将通过在LB培养基中培养每种转化体E.coli/pNANe,E.coli/pNANa,E.coli/pCMK,E.coli/pACKa禾卩E.coli/pSYNb得到的500ml种子培养物接种到5升的LB培养基中。当细胞浓度(OD,)达到大约3-5时，收获细胞。含有各种酶的转化体的培养条件在下表1中显示。收获的细胞使用超声破碎仪(disruptor)或者法式压滤壶(Frenchpress)破碎，然后每种酶的表达通过十二垸基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析(图7)。结果，可以观察到由插入到每种转化体中的基因编码的酶被大量的表达。表l:制备每种酶的菌株的培养条件<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例3:酶的纯化将所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcAc2-异构酶)，N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NeuAc醛縮酶),胞苷5'-磷酸激酶，醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuAc合成酶)使用硫酸铵沉淀并使用离子交换树脂柱纯化(蛋白质纯化技术"Proteinpurificationtechniques"，第二版,OxfordUniversityPress，2001)。用于每种酶沉淀的硫酸铵的浓度可在30-80%的范围内适当调节。每种酶使用硫酸铵在低于l(TC的冰箱中，优选的是3-5"C，并搅拌l-5小时被沉淀。将沉淀的酶溶解在微量的50mMTrisHCI(pH7.5)缓冲液中并通过透析膜脱盐。纯化并浓縮的酶溶液在填充有强离子交换树脂的UNOsphereQ(Bio-RAD)柱上使用洗脱液A(20mMTrisHCI(pH7.5))和洗脱液B(20mMTrisHCl/lMNaCl(pH7.5))作为洗脱液梯度洗脱来纯化。纯化的酶通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析(图8)。实施例4:酶的固定将3升2.5%的戊二醛加入到lkg(大约l升)的聚合物小珠中，然后在室温下搅拌2小时以活化聚合物小珠。活化的聚合物小珠被过滤然后清洗，并将实施例3中纯化的每种酶以每克聚合物小珠3mg的量加入到聚合物小珠中。然后，将混合物在室温下搅拌6小时以将酶固定在聚合物小珠上。酶固定化的程度和量参考Bradford法(Anal.Biochem.,72:248,1976)进行分析。实施例5:CMP-N-乙酰神经氨酸的合成将使用2MNaOH在37。C下保持pH6.5-8.0的20-100g的20-80mM胞苷5'-磷酸(CMP，ShanghaiQZUBioscience&Biotechnology),34.15-136.6g的20-80mMN-乙酰-D-葡糖胺(ShanghaiJiubangChemical),33.9-101.7g的40-120mM丙酮酸，30.9g的20mMMgCl2H20(Duksan),3.72g的1mMCTP(Sigma),84-525g的80-500mM乙酰磷酸(Sigma)和7升的50mMTrisHCl缓冲液(pH7.0)与在实施例4中制备的聚合物小珠混合，所述聚合物小珠上固定有胞苷磷酸激酶(CMK)、醋酸激酶(ACK)、NeuAc醛縮酶(NAN)、CMP-NeuAc合成酶(NEU)和GlcNAe-2-表异构酶。然后，将混合物在反应器中搅拌5-12小时。为了分离并检测反应上清液，Thermo42柱(ThermoElectronCorporation)被使用，并且使用洗脱液A(IOOmM101204/1^21^04)和洗脱液B(甲醇)以90%(洗脱液A):10%(洗脱液B)的比例进行高效液相色谱(HPLC)。结果，可以看到，CMP-N-乙酰神经氨酸以大约90%的产量被合成。实施例6:CMP-神经氨酸的纯化将在实施例5中合成的CMP-N-乙酰神经氨酸注入到阴离子交换树脂柱(Dowex-lx2;C广形式)的上部，并用盐浓度梯度洗脱。所需材料的洗脱百分比再次被浓縮并通过葡聚糖(SephadexG-10)凝胶渗透脱盐，从而得到高纯度的终产物。产物通过冰冻干燥浓縮。通过每个纯化步骤并通过核磁共振(NMR)和高效液相色谱(HPLC)分析，CMP-N-乙酰神经氨酸最终产量达到81%(图9和图10)。工业实用性如上面详细描述的那样，本发明具有提供使用新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶大量生产CMP-N-乙酰神经氨酸的方法的效果。根据本发明，CMP-N-乙酰神经氨酸可使用作为廉价底物的胞苷酸和N-乙酰-D-葡糖胺通过一步反应大量生产。而且，CMP-N-乙酰神经氨酸可以低成本生产，因为核苷三磷酸(NTP)或ATP可以通过乙酰Pi和醋酸激酶再生。虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，但本领域技术人员将会理解，该描述仅仅用于说明优选实施例，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实际范围将由所附的权利要求书及其等同技术限定。权利要求1、一种N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcAc2-表异构酶)，具有氨基酸序列为SEQIDNO2。2、一种编码权利要求1的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的基因。3、根据权利要求2的基因，其特征在于，具有碱基序列SEQIDNO:4、含有权利要求2的基因的重组载体。5、使用权利要求4的重组载体转化的重组微生物。6、一种制备N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的方法，所述方法包括培养权利要求5的重组微生物；并回收所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶。7、一种制备N-乙酰-D-甘露糖胺的方法，所述方法包括将含有N-乙酰-D-葡糖胺的反应混合物在权利要求1的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶的存在下进行反应；并且回收所述N-乙酰-D-甘露糖胺。8、一种制备神经氨酸的方法，所述方法包括将含有丙酮酸和由权利要求7的方法制备的N-乙酰-D-甘露糖胺的反应混合物在N-乙酰神经氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)的存在下进行反应；并且回收所述神经氨酸。9、一种制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，所述方法包括将含有下列物质的反应混合物进行反应(i)胞苷5'-磷酸(CMP)，(ii)核苷三磷酸(NTP)或者ATP，(iii)乙酰磷酸(Pi)，(iv)N-乙酰-D-葡糖胺和(v)丙酮酸，所述反应在下列物质存在下进行(a)N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶(GlcNAc2-表异构酶)，(b)N-乙酰神经氨酸醛縮酶(NeuNAc醛縮酶)，(c)胞苷5'-磷酸激酶(CMP激酶)，(d)醋酸激酶和(e)CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶(CMP-NeuNAc合成酶)；并且回收所述CMP-N-乙酰神经氨酸。10、根据权利要求9的制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸(NTP)或者ATP由乙酰Pi和醋酸激酶再生。11、根据权利要求9或10的制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述核苷三磷酸(NTP)是胞苷三磷酸(CTP)。12、根据权利要求9的制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶具有氨基酸序列为SEQIDNO:2。13、根据权利要求9的制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶、N-乙酰神经氨酸醛縮酶、胞苷5'-磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶被固定在载体上。14、根据权利要求9的制备CMP-N-乙酰神经氨酸的方法，其特征在于，所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶、N-乙酰神经氨酸醛縮酶、胞苷5'-磷酸激酶、醋酸激酶和CMP-N-乙酰神经氨酸合成酶分别由碱基序列SEQIDNO:1,SEQIDNO:5,SEQIDNO:8,SEQIDNO:11以及SEQIDNO:14编码。全文摘要本发明涉及新的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和用于生产CMP-神经氨酸的方法，更具体涉及来源于脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343的N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶和使用所述N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶生产CMP-N-乙酰神经氨酸的方法。根据本发明，CMP-N-乙酰神经氨酸可使用作为廉价底物的胞苷磷酸和N-乙酰-D-葡糖胺通过一步反应被大量经济地生产。文档编号C12N9/00GK101668850SQ200780046422公开日2010年3月10日申请日期2007年12月7日优先权日2006年12月15日发明者吉泰建,姜善烨,宋在京,张庆淳,徐元敏,梁智英,沈相熙,禹真锡,许仁康,郑永洙,金大熙,金秉祺申请人:基因化学株式会社