R-hnl随机变体及其用于制备光学纯的空间位阻氰醇的用途的制作方法

专利名称：R-hnl随机变体及其用于制备光学纯的空间位阻氰醇的用途的制作方法
专利说明R-HNL随机变体及其用于制备光学纯的空间位阻氰醇的用途 生物催化工艺现已对化学工业非常重要。当生物催化剂的性质使得两种对映异构体之任一能在与手性或前手性化合物的化学反应中优先反应或优先形成时，酶的使用是特别重要的。
利用酶的这些有利性质的必要条件是在工业工艺的现实条件下以低成本获得足够量(工业工艺所需要的)的具有足够高反应活性、选择性和高稳定性的酶。
氰醇是手性化合物中令人特别感兴趣的一类。氰醇在例如α-羟基酸、α-羟基酮、β-氨基醇等(用于制备生物活性物质，例如药物活性物质、维生素或拟除虫菊酯化合物)的合成中很重要。
例如可通过将氢氰酸加到酮或醛的羰基上来制备氰醇。
对(S)-氰醇的工业制备例如已由于对Hevea brasiliensis S-羟基腈裂解酶的分离成为可能，其被描述于WO 97/03204、EP 0951561和EP 0927766中。
但是，对于多种令人感兴趣的化学化合物而言，R-对映异构体对于工业应用来说是重要的。在这方面，以前已描述了制备大量产物的工艺，但是，这些仅可用于实验室规模(例如EP 0276375、EP 0326063、EP 0547655)。这包括主要使用从Rosaceae科的植物获得的酶制剂，例如从杏仁的核获得的(Prunus amygdalus)。以前使用的R-HNL的其它例子是来自亚麻幼苗(Linum usitatissimum；LuHNL)的那些(它们作为第一R-HNL基因被克隆，并在E.coli和Pichia pastoris中表达)，或是Phlebodium aureum R-HNL。
文献中提到了低温(例如，Persson et al.；Enzyme and MicrobialTechnology 30(7)，916-923；2002)、低于pH4的pH(例如，Kragl et al.；Annals of the New York Academy of Science；613(Enzyme Eng.10)，167-75，1990)和两相系统的使用(例如EP 0547655)或乳液的使用(例如EP 1238094)作为有益的反应条件参数，以便能获得具有高光学纯度的产物。通过应用显著增加的酶浓度来实现非常高的对映异构过量的可能性也已被描述过。例如，EP 0528256B1使用了相对每mmol羟基新戊醛而言20mg或2000U的D-醇腈酶(D-oxinitrilase)EC 4.1.2.10。
但是不幸的是，大多数天然的R-HNL在低于4的pH时仅具有不到1小时的半寿期。
EP 1223220A1描述了通过克隆Prunus amygdalus的编码R-HNL同工酶(例如同工酶5(PaHNL5))的基因和通过在微生物宿主中重组表达来制备的重组酶。如实施例所揭示的，所述R-HNL通过在低pH下大幅增加的稳定性而区别于其它已知的R-HNL。
不利的是，发现底物接受性不令人满意，因为较之使用来自杏仁核的商业天然植物R-HNL制剂的情况，一些底物在存在例如重组PaHNL5的时候以显著更低的反应速率转化。
基于PaHNL5和相应的酶-底物复合物的3D结构模型，有可能通过结构设计，来产生具有改进的底物接受性和由此增加的活性和选择性的多种酶变体(例如，WO 2004/083424，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003；42，4815，WO 2006/076965)。
因此，WO 2004/083424描述了所述重组HNL的突变体，其中，活性位点中来自丙氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸构成的组的残基被其它残基替换，由此增加了底物接受性，特别是针对经取代的苯甲醛的底物接受性。一个例子是A111G变体。
此外，WO 2006/076965描述了重组R-HNL的突变体，所述突变体具有改进的底物接受性、增加的活性和改进的立体选择性，例如，针对苯丙醛或苯基丙烯醛等底物。这些变体是通过在Rosaceae科的R-HNL(例如，EP 1223220A1的PaHNL5)中进行特定突变来制备的，其中 a)对应于成熟PaHNL5蛋白第360位的氨基酸残基被不同的非极性氨基酸或中性氨基酸所取代，和/或 b)对应于成熟PaHNL5蛋白第225位的氨基酸残基被不同的极性氨基酸所取代， 任选地，有可能针对疏水通道中或活性位点中的另外1至20个残基进行取代，导致活性位点被取代。一个例子是V360I突变体。
但是，对酶-底物复合物的计算机模型的结构分析没有提供用于改进R-HNL的底物接受性的任何启发。
但是，鉴于该领域非常需要下述酶，所述酶可以以在工业规模上用于工业反应的足够量并且以有成本效益的方式被制备获得，并且具有改进的底物接受性以及由此增加的活性、增加的选择性还有增加的稳定性，因此，本发明的目的是发现Rosaceae科的R-羟基腈裂解酶的新的变体，所述变体满足上述要求，并且能够以比以前已知的任何R-HNL更有效和更有选择性的方式转化空间位阻脂肪族羰基化合物和被取代的芳香族醛。
令人吃惊地，该目的通过在Rosaceae科的R-羟基腈裂解酶(例如EP 1223220A1的PaHNL5或WO 2004/083424的PaHNL5 A111G突变体)中进行随机突变来实现。
本发明因此涉及具有改进的底物接受性、增加的活性和增加的选择性的R-羟基腈裂解酶，其可通过这样获得在随机诱变和/或饱和诱变技术的协助下引入随机突变，通过筛选或选择来进行鉴定，以及，在合适的情况下，随后将有益的突变组合起来。
本发明的R-HNL是通过在定向进化方法协助下进行的随机诱变来制备的。
例如在Henco and Eigen(WO 9218645)的理论文章中描述了制备然后分析具有改进的性质的新颖的生物聚合物的一种可能性。生物聚合物的定向进化或实验室进化原则上包括在生物系统中模拟或复制天然进化方法。在酶文库中产生多样性的典型方法包括随机点诱变、体外或体内重组、随机插入和随机缺失以及转座子的使用。
例如通过易错聚合酶链式反应(epPCR)来进行随机点诱变。这包括使用具有高内在错误率的DNA聚合酶，例如，来自Stratagene(CA，USA)的Mutazyme

I DNA聚合酶或Mutazyme

II DNA聚合酶，或者以使得错误率增加的方式来设计所述聚合酶链式反应的条件。加入二价阳离子、核苷酸不平衡、pH变化或上述选项中两种或三种的组合，会导致PCR反应混合物针对DNA聚合酶有合适的改变，所述聚合酶例如来自Qiagen、Fermentas等的Taq DNA聚合酶或来自Fermentas的Hot StartTaqDNA聚合酶或来自Qiagen等的HotStarTaq DNA聚合酶，从而在基因扩增期间以可控的速率引入错误。
此外还可使用下述方法，例如，GSSM(基因位点饱和诱变)(DeSantis et al.，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，11476)、SeSaM(序列饱和诱变)(Wong et al.，Nucleic Acids Res，2004，32，E26；Wong et al.，AnalBiochem，2005，341，187)、CASTing(完全活性位点饱和测试)(Clouthier et al.，J Org Chem，2006，71，8431)、化学诱变、增变菌株或物理方法或技术人员已知的其它饱和诱变技术，以使得酶文库能够以高效方式被制备。还可在氨基酸序列的各位置进行位点特异性饱和诱变，以产生更多的多样性。此外，对整个基因或其各片断的合成制备例如也允许产生合适的基因文库。
对有益突变的组合、通过组合突变引入协同效果或除去中性或损害性突变是使用重组技术来进行的，所述重组技术例如DNA改组(Stemmer，Nature，1994，370，389)、StEP(摇摆延伸工艺)(Zhao et al.，NatBiotechnol，1998，16，258)、RACHITT(在瞬时模板上进行的随机嵌合诱变)(Coco et al.，Nat Biotechnol，2001，19，354)、CLERY(通过在酵母中重组增强的组合文库)(Abécassis et al.，Nucleic Acids Res，2000，28，E88)、SHIPREC(依赖序列同源性的蛋白重组)(Sieber et al.，NatBiotechnol，2001，19，456)、ITCHY(用于产生杂交体酶的递增性截短)(Ostermeier et al.，Nat Biotechnol，1999，17，1205；Lutz et al.，Nucleic AcidsRes，2001，29，E16；Ostermeier et al.，Bioorg Med Chem，1999，7，2139)、SCRATCHY(Lutz et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2001，98，11248)等。但是，各酶变体的突变的加合和协同效果也可以通过将一种突变体的突变引入第二种经突变的核酸来获得，这例如通过位点特异性诱变、基因合成或重叠延伸PCR来进行。
用酶的定向进化在基因中引入增加的多样性的方法通常在核酸序列中产生插入、缺失或点突变。
在氨基酸水平上，这些修饰导致氨基酸残基的插入、氨基酸残基的缺失、读码框位移或一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基的代替。
此外，定向进化方法引入了导致“沉默突变”的点突变，其中核酸序列被修饰，但是所述修饰并不导致氨基酸序列被修饰。归结于多种生物部分不同的密码子使用，在异源表达的基因中的沉默突变可能产生对于表达有益或无益的核碱基(nucleobase)三体。这可使例如异源表达以及活性酶在相应宿主生物中的折叠得以改进或变坏。
酶文库的功能性表达在异源或分泌表达系统中进行，优选使用例如Pichia pastoris、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis、Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Pichia methanolica、Pichiapolymorpha、Hansenula polymorpha、Pichia anomala、Schizosaccharomycespombe、Arxula adeninivorans、Yarrowia lipolytica、Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescens、Escherichia coli、Bacillus stearothermophilus、Thermus thermophilus、Streptomyces sp.等生物，特别优选Escherichiacoli、Saccharomyces cerevisiae、Kluyveromyces lactis和Pichia pastoris。
本发明的R-HNL是Rosaceae科的羟基腈裂解酶的变体。
对本发明突变体的制备可基于Rosaceae科的天然R-HNL，例如，Prunus amygdalus(PaHNL)、Prunus serotina(PsHNL)、Prunusavium、Prunus laurocerasus、Prunus lyonii、Prunus armaniaca、Prunuspersica、Prunus domestica(PdHNL)、Prunus mume(PmHNL)、Maluscommunis、Malus pumila、Cydonia oblonga等的R-HNL或重组R-HNL，例如EP 1223220或EP 1566441中的，以及突变的重组R-HNL，例如，重组PdHNL或WO 2004/083424或WO 2006/076965中的那些。
优选使用的天然R-HNL是Prunus amygdalus(PaHNL)、Prunusserotina(PsHNL)、Prunus domestica(PdHNL)或Prunus mume(PmHNL)的R-HNL。优选的重组R-HNL是Prunus domestica的R-HNL(PdHNL)，特别是PdHNL1，以及EP 1566441描述的重组R-HNL(PaHNL4)和EP 1223220描述的重组R-HNL(PaHNL1-PaHNL5)，特别优选重组PaHNL5。
以前改进的R-HNL突变体，例如WO 2004/083424或WO2006/076965中的，也可作为基础，特别优选A111G和V360I。
本文中待修饰的R-HNL还可以下述经修饰的序列存在，所述序列是例如通过替换序列中开头的一个或多个氨基酸或通过除去开头的一个或多个氨基酸或通过连上其它氨基酸(例如GluAlaGluAla)或通过与其它同工酶融合来获得的。例如，各R-HNL同工酶可与其它R-HNL同工酶融合，或与协助分泌生产的蛋白融合。
还可在突变之前用另外的信号序列来替换天然信号序列或植物信号序列，例如用Saccharomyces cerevisiaeα交配因子(α-MF)、Saccharomycescerevisiae转化酶(SUC2)、Pichia杀灭毒素信号序列、α-淀粉酶、Pichiapastoris酸性磷酸酶(PHO1)、Phaseolus vulgaris凝集素(PHA-E)的信号序列；Aspergillus niger葡糖淀粉酶信号序列(glaA)、Aspergillus niger葡糖氧化酶信号序列(GOX)、Pichia pastoris Sec10信号序列、Kluyveromyces lactis杀灭毒素28kD亚基的信号序列、BSA信号序列等，或其合成变体，或合成的共有序列来替换。信号序列还可包含点突变、插入或缺失。
合适的信号序列和它们的突变体被描述于例如Heijne G.et al.，FEBSLetters 244(2)，439-46(1989)、EP 19911213、Paifer et al.，BiotecnologiaAplicada 10(1)，41-46，(1993)、Raemaekers et al.，European Journal ofBiochemistry 265(1)，394-403(1999)等中。
优选用Saccharomyces cerevisiaeα交配因子的信号序列或其变体来替换植物信号序列(Xiong et al.，J Biochem Mol Biol，2004，37，282；Xiong etal.，Appl Microbiol Biotechnol，2006，72，1039)。
本发明的HNL酶文库优选是通过随机点诱变来制备的，其中使用EP 1223220A1中描述的重组R-HNL(PaHNL1到PaHNL5，特别优选重组PaHNL5)或以前改进的R-HNL突变体(例如WO 2004/083424或WO2006/076965中的例子，特别优选突变体A111G和V360I)作为模板。此外还可使用通过诱变和筛选获得的改进的HNL变体作为模板，用于制备进一步改进的变体，优选使用变体I304VA111G、I108MA111G、N110SA111G、N3IA111G、I108MA111GY432FV424A、N3II108MA111G、I108MN110SA111G、I108MA111GN225S、I108MA111GV317A和V317A。
随机点诱变例如通过易错PCR来进行，其中使用具有高内在错误率的聚合酶，例如，来自Stratagene(CA，USA)的Mutazyme

I DNA聚合酶或Mutazyme

II DNA聚合酶，或者通过加入二价阳离子、核苷酸不平衡、pH变化或上述选项中两种或三种的组合，以使得所用的DNA聚合酶(例如，来自Qiagen、Fermentas等的Taq DNA聚合酶或来自Qiagen等的HotStarTaq DNA聚合酶)错误率增加的方式来设计聚合酶链式反应的条件。
本发明中用于通过易错PCR进行随机点诱变的模板是仅编码成熟HNL酶变体的核酸序列或编码成熟HNL酶变体和信号序列(优选地，Saccharomyces cerevisiae α交配因子的信号序列)的核酸序列。
然后，在重叠延伸PCR的协助下，将通过随机点诱变修饰的Pahnl5-或Pahnl5α-核酸序列与左侧翼末端(例如，有或没有α信号序列的真核启动子(例如GAP启动子)的3’-末端)和右侧翼末端(编码例如选择标记(例如博莱霉素(zeocin)抗性))相连。这些线性表达盒(

图1A)然后被转化进Pichia pastoris。但是，突变的基因也可被克隆进合适的表达载体。此类表达载体随后被线性化，转化进Pichia pastoris，并整合进Pichia基因组，或者，完整的表达质粒被转化进Pichia，并通过自主复制在细胞中保持。
此外，优选通过在氨基酸序列的各位置进行位点特异性饱和诱变，应用制备文库的重叠延伸PCR策略，来制备本发明的HNL酶文库。这产生了用于直接转化进Pichia pastoris的表达盒。
首先，通过PCR制备3条片段，第一片段除了包含真核启动子(例如GAP启动子)的3’-末端之外还包含α-信号序列和Pahnl5基因的第一片断。例如，所述片段1延伸可达Pahnl5基因中待突变的位置。第二片段在待突变的位点从引物延伸至Pahnl5基因的末端，第三片段编码选择标记(例如博莱霉素抗性)。所述片段具有互相重叠的核苷酸序列，它们随后通过重叠延伸PCR被装配起来。该策略还被阐释于图1B中。
对新颖的、改进的酶变体的鉴定是在合适的高通量筛选或选择方法协助下进行的，所述方法允许快速可靠地检测想要的变体。应用定向进化方法的重要指导原则是这句话——“你对什么加以筛选，你就得到什么”(Arnold，Acc Chem Res，1998，31，125)，这表示，通常希望使用能尽可能多地模拟实际感兴趣的底物的筛选底物，更特别地，使用对应于实际底物的筛选底物。
然后可将任何可想到的化学反应转化为高通量筛选方法或高通量选择方法。
因此，有可能用合适的腈、合适的醛或合适的酮作为底物，来进行高通量筛选或高通量选择方法，其中，对腈的切割被监测，或者相应醛或酮向相应氰醇的转化被分析。
经常使用与发色或发荧光化合物的反应来进行高通量检验(Goddardand Reymond，Trends Biotechnol，2004，22，363)。这些底物中的一些被活细胞吸收，并被用于监测体内转化。最被人们熟知的例子是X-Gal，一种被β-半乳糖苷酶切割的β-半乳糖苷，在该过程中释放出不可溶的靛蓝染料(Pearson et al.，Lab Invest，1963，12，1249)。
另一通用概念包括与实际将被分析的第一反应的反应伴侣进行第二反应，以产生可被测量的信号。使用该概念，例如用于检测醛。本文例如使用比色Schiff碱试剂来检测羰基官能团(Doderer et al.，Anal Biochem，2003，321，131)。还可利用荧光检验，将醛与4-肼基-7-硝基苯呋咱(4-hydrazino-7-nitrobenzofurazane，NBDH)反应，产生相应的高荧光腙，其可通过荧光测量被定量(Bornscheuer，Eng Life Sci，2004，4，539；Konarzycka-Bessler and Bornscheuer，Angew Chem Int Ed，2003，42，1418；Koizumi andSuzuki，J Chromatogr，1988，457，299)。
分析高通量反应的其它方法包括HPLC、GC、MS和毛细电泳方法。为在高通量实验中检测对映选择性，例如可以使用采用了手性柱的GC方法，或者利用经同位素标记的底物，其能使得可通过质谱(Reetz et al.，Angew Chem Int Ed，1999，38，1758)、1H-NMR(Reetz et al.，Adv SynthCatal，2002，344，1008)或FTIR光谱(Tielmann et al.，Chemistry，2003，9，3882)对对映异构体底物或产物加以分析。
使用例如苯乙醇腈或2-氯-苯乙醇腈等底物来测定本发明HNL酶变体的HNL酶活性，以光学方法监测至相应醛和HCN的切割(Weis et al.，JMol Catal BEnzym，2004，29，211)。
通过将剩下的醛与4-肼基-7-硝基苯呋咱(NBDH)反应来测定周转量，或通过在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行GC测定对反应混合物衍生化之后的对映异构过量，从而分析使用本发明的HNL酶变体进行的羟基新戊醛的转化。
通过以与第一轮筛选相似的方式进行的再次筛选，对通过第一轮筛选获得的改进的HNL变体进行重复检查。
通过所述筛选获得的具有改进性质的HNL突变蛋白中对应于WO2004/083424中的成熟PaHNL5A111G蛋白的第3位和/或第108位和/或第110位和/或第304位和/或第424位和/或第432位的氨基酸残基被不同的氨基酸替换，例如，被丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或缬氨酸替换。此外，对应于WO 2004/083424中的成熟PaHNL5蛋白的第317位氨基酸残基被不同的氨基酸(例如，丙氨酸)替换。我们发现，本发明的具有第V317A位突变的HNL突变蛋白不同于WO 2004/083424中的变体，因为GTA(缬氨酸)密码子没有被GCT(丙氨酸)替换，而是被GCA(丙氨酸)密码子替换，这对于在Pichia pastoris中表达来说是特别优选的。出人意料地，此时观察到了在空间位阻脂肪族底物转化中的正面积极效果。
此外，通过筛选获得的具有改进的性质的、对应于HNL突变蛋白氨基酸位置85和/或209和/或278和/或432的核碱基三体被编码在每种情况下相同氨基酸的其它密码子替换(沉默突变)。
为改进异源基因的表达，特别是PaHNL5突变蛋白在Pichia pastoris中的表达，首先，可共表达伴侣分子或其它协助蛋白，例如，Pichiapastoris或Saccharomyces cerevisiae的蛋白二硫化物异构酶(PDI)(Inanet al.，Biotechnol Bioeng，2006，93，771；Zhang et al，Biotechnol.Progress，2006，22，1090)，其次，试图将宿主生物的密码子使用最优地转移给待异源表达的相应基因。利用DNA优化程序，例如Entelechon的Leto 1.0(Regensburg，D)来改进Pahnl5基因的密码子使用。为进行计算，使用针对宿主生物的已知密码子使用表(密码子使用数据库www.kazusa.or.jp/codon/)，或者计算例如宿主生物高度表达的特定基因的自我密码子使用表(例如Pichia pastoris中的醇氧化酶1)。基于DNA优化软件计算的基因，首先对寡核苷酸加以设计，然后再将其用于对相应基因的合成。
按照上文提到的参考文献，通过进一步加工获得可用的蛋白。
本发明的R-HNL突变体适于以较之现有技术更高的转化速率、活性和选择性来制备对映异构纯的氰醇，特别是被空间位阻的脂肪族氰醇和被取代的芳香族氰醇。
本发明因此还涉及本发明的R-HNL突变体用于制备对映异构纯的氰醇的用途。
例如，R-HNL突变体可用于对氰醇进行对映选择性切割。
更特别地，本发明的突变体用于将氢氰酸加成到作为底物的脂肪族和芳香族醛或酮。
醛在本文中表示脂肪族、芳香族或杂芳香族的醛。脂肪族醛在本文中表示饱和的或不饱和的，脂肪族的，直链、带支链或环状的醛。优选的脂肪族醛是直链或带支链的具有特别是2至30个碳原子的醛，优选具有4至18个碳原子，其在1至6位是饱和的或单不饱和或多不饱和的。所述醛可既具有C-C双键又具有C-C三键。此外，脂肪族、芳香族和杂芳香族醛可以是未被取代的，或者是被在反应条件下为惰性的基团取代的，例如被任选被取代的芳基或杂芳基(例如苯基、苯氧基或吲哚基)、卤素、羟基、羟基C1-C5烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5硫烷基、醚、醇、羧酸基团、硝基或叠氮基团取代。
优选的脂肪族醛的例子是羟基新戊醛、新戊醛、丙醛、丁醛、己醛、异丁醛、异戊醛、丙烯醛、巴豆醛、甲基丙烯醛、3-苯丙醛、3-苯基丙烯醛(肉桂醛)、3-苯基丙炔醛等。
芳香族或杂芳香族醛的例子是苯甲醛和被不同取代的苯甲醛，例如，2-氯苯甲醛、3-氯苯甲醛、4-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛、3-溴苯甲醛、4-溴苯甲醛、2-氟苯甲醛、3-氟苯甲醛、4-氟苯甲醛、3，4-二氟苯甲醛、3-苯氧基苯甲醛、4-氟-3-苯氧基苯甲醛、2-羟基苯甲醛、3-羟基苯甲醛、4-羟基苯甲醛、2-甲氧基苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛，还有糠醛、甲基糠醛、9-蒽甲醛、3-呋喃甲醛、3-吲哚甲醛、1-萘甲醛、邻苯二甲醛、3-吡唑甲醛、2-吡咯甲醛、2-噻吩甲醛、间苯二甲醛或吡啶甲醛、噻吩醛(thienylaldehydes)等。
酮是脂肪族、芳香族或杂芳香族的酮，其中羰基碳取代基相同或不同。脂肪族的酮表示饱和的或不饱和的，直链、带支链或环状的酮。酮可以是饱和的或单不饱和或多不饱和的。它们可以是未被取代的，或者可被在反应条件下惰性的基团取代，例如被任选被取代的芳基或杂芳基(例如苯基或吲哚基)、卤素、醚、醇、羧酸盐/酯、硝基或叠氮基团取代。
芳香族或杂芳香族酮的例子是苯乙酮、吲哚丙酮等。脂肪族酮的例子是丙酮、二羟基丙酮、丁酮、丁烯酮、3-甲基丁酮、3，3-二甲基丁酮、2-戊酮、4-甲基戊酮、5-氯-2-戊酮、2-己酮、5-甲基己-2-酮、2-庚酮、2-辛酮、3-辛酮等。
适于本发明的醛和酮是已知的或者可以按照常规方法来制备。
存在本发明的HNL时，底物与氰基供体反应。
合适的氰基供体是氢氰酸、碱金属氰化物或通式I的氰醇 R1R2C(OH)(CN)， 其中R1和R2互相独立地是氢或未被取代的烃基，或者R1和R2一起是具有4或5个碳原子的亚烃基，并且R1和R2不同时是氢。烃基是脂肪族或芳香族的，优选是脂肪族的基团。R1和R2优选是具有1-6个碳原子的烷基，特别优选的氰基供体是丙酮氰醇。
氰基供体可通过已知工艺来制备。氰醇，特别是丙酮氰醇，也可商业获得。
使用氢氰酸(HCN)、KCN、NaCN或丙酮氰醇作为氰基供体是优选的，氢氰酸是特别优选的。
本发明范畴内，氢氰酸也可恰在反应前即刻从它的一种盐(例如NaCN或KCN)释放出来，并以未经稀释的形式或溶解的形式加入反应混合物。
转化可在有机系统、水性系统或两相系统中进行，或以乳化形式以及未经稀释的形式进行。
使用的水性系统是包含本发明的HNL的水性溶液或缓冲液。其例子是柠檬酸钠缓冲液、柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液等。
可使用的有机稀释剂是脂肪族或芳香族的碳氢化合物，其与水轻微混溶或不混溶，其是任选被卤化的醇、醚或酯或其混合物或者底物自身。优选使用DMF、乙醇、异丙醇、异丁醇、甲苯、二甲苯、1，3，5-三甲基苯(mesitylene)、枯烯甲基叔丁基醚(MTBE)、二异丙醚、二丁醚、二乙醚、二甲醚以及乙酸乙酯或其混合物。
本文中，本发明的HNL可原样存在或以被固定的形式存在，例如存在于支持物例如Celite

、Avicel等之上，或作为“经交联的酶聚集物”(CLEA)存在于有机稀释剂中，但是也可使用非固定的HNL在两相系统或乳液中进行转化。
本文中，转化在-10℃至+50℃的温度下进行，优选在5℃至+45℃进行，特别优选为0℃至25℃。
反应混合物的pH可以在1.8至7之间，优选为2至5，特别优选为2.0至3.5。
实施例1通过易错聚合酶反应在R-羟基腈裂解酶中制备随机突变 在重叠延伸PCR的协助下，来制备含有随机突变的R-HNL基因的表达文库，其中使用经突变PaHNL5序列(PCR IIa或IIb)的中间片段和由例如真核启动子(PCRI)(例如GAP启动子)的3’-末端构成的左侧翼末端，而右侧翼末端编码选择标记(例如博莱霉素抗性)(PCRIII)。图1A描述了该线性表达盒。
PCR I 使用pGAP158for/HNL5alpha21aq引物对，从pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，但额外突变了L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、AngewChem Int Ed Engl，2003，42，4815中)扩增片段1(GAP启动子的3’-末端)，或也可以使用pGAP158for/pGAPZA484r引物对，从EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a质粒来扩增。
PCR以100μl反应体积(60ng质粒DNA、1x Phusion HF缓冲液、0.2mM dNTPs、0.4μM的每种引物、1.2U来自Finnzymes的PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L))在Applied Biosystems热循环仪中进行。
98℃30秒的变性步骤之后是30个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
PCR之后，通过DpnI消化除去DNA模板。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick GelExtraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
PCR IIa 通过中毒(poisoned)HotStarTaq DNA聚合酶进行易错聚合酶链式反应(epPCR)，在R-羟基腈裂解酶中制备随机突变。
在每种情况下，10ng表达质粒pGAPPamHNL5a(EP 1223220A1)、pGAPPamHNL5aV317A(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变V317A(GTA→GCT))和pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、Angew Chem Int Ed Engl，2003，42，4815中)被用作为模板，用于通过来自Qiagen的中毒HotStarTaq DNA聚合酶(Cat.No.203205)进行诱变反应。
制备100μl反应混合物(1x PCR缓冲液、0.2mM dNTPs、0.8mMdCTP/dTTP混合物、5.5mM MgCl2、0.3μM的每种引物和5U来自Qiagen的HotStarTaq DNA聚合酶)用于PCR。此外，使用不同的MnCl2浓度(0mM、0.05mM和0.1mM MnCl2)。PCR在Applied Biosystems(Forster City，CA)热循环仪中进行。将HNL5alpha11q/PaHNL5endBr引物对用于pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒。将pGAPZA484f/PaHNL5endBr引物对用于诸如pGAPPamHNL5a或pGAPPamHNL5aV317A之类的表达质粒。
使用下述温度程序 A)95℃变性15分钟 B)94℃50秒、60℃30秒和72℃2分钟的30个循环 C)72℃延伸7分钟。
PCR之后通过DpnI消化除去DNA模板。为实现此目的，将2μl DpnI(10U/μl)加进100μl PCR混合物中，混合物在37℃孵育2-3小时。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick Gel Extraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
PCR IIb 通过来自Stratagene的GeneMorph

随机诱变试剂盒(Cat.#600550)进行易错聚合酶链式反应(epPCR)在R-羟基腈裂解酶中制备随机突变。
在每种情况下，50-100ng表达质粒pGAPPamHNL5a(EP 1223220A1)和pGAPPamHNL5aV317A被用作为模板，用于通过来自Stratagene的GeneMorph

随机诱变试剂盒(Cat.#600550)来进行诱变反应。在每种情况下，40pmol正向引物和40pmol反向引物被用于在100μl反应混合物中进行的PCR。PCR在Applied Biosystems(Forster City，CA)热循环仪中进行。95℃30秒的变性步骤之后是25个扩增循环(95℃30秒、60℃30秒、72℃4分30秒)以及72℃10分钟的最后步骤。
PCR之后通过DpnI消化除去DNA模板。然后按照QIAquick GelExtraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
PCR III 编码博莱霉素抗性的片段3扩增自pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，具有额外突变L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、Angew Chem IntEd Engl，2003，42，4815中)或pGAPPamHNL5a质粒(EP 1223220A1)，这使用PaHNL4L1Qendf3/Ocyctermrv1引物对来进行。
PCR以100μl反应体积(60ng质粒DNA、1x Phusion HF缓冲液、0.2mM dNTPs、0.4μM的每种引物、1.2U来自Finnzymes的PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L))在Applied Biosystems热循环仪中进行。
98℃30秒的变性步骤之后是30个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
PCR之后，通过DpnI消化除去DNA模板。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick GelExtraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
线性表达盒的装配 通过重叠延伸PCR以两个步骤来进行装配。
在步骤1中，大约6ng PCR I的产物、大约30ng PCR IIa或PCR IIb的产物以及大约25ng PCR III的产物被用作为模板以及同时用作为引物，用于完成邻接的产物。延伸在50μl反应混合物(含有1x Phusion HF缓冲液、0.2mM dNTPs和0.6U来自Finnzymes的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L))中于Applied Biosystems热循环仪中进行。98℃30秒的变性步骤之后是10个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
在步骤2中，将下述组分加入步骤1的PCR混合物34.7μl水(最高纯度的水)、10μl 5x Phusion HF缓冲液、1μl 10mM dNTPs、2μlpGAP158for引物(20pmol/μl)、2μl Ocyctermrv1引物(20pmol/μl)和0.6U来自Finnzymes的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L)。混合物在98℃变性30秒。这之后是20个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
将线性表达盒转化进Pichia pastoris 按照来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或QIAquick Gel Extraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对重叠延伸PCR产物加以纯化。这之后是通过BlnI(AvrII)(Roche，Cat.#11558161001)或XmaJI(AvrII)(Fermentas，Cat.#ER1561)进行的限制性消化。通过乙醇沉淀来纯化切割反应混合物，然后按照Invitrogen标准方案将大约1μg制备的DNA转化进Pichia pastoris X33。1μg DNA产生了1000-6000个转化子。
引物序列 HNL5alpha11q 5′-AGAGAGGCTGAAGCTCAAGCCAATACTTCTGCTCATGAT-3′ HNL5alpha21aq 5′-GAAGTATTGGCTTGAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3′ Ocyctermrv1 5′-TGCTCACATGTTGGTCTCCAGCTTGC-3′ PaHNL4L1Qendf3 5′-GTCAGATAGCGAGGTCACTCAGTCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAG-3′ PaHNL5endBr 5’-GACTGAGTGACCTCGCTATCTGACTCACATGGACTCTTGAAT-3’ pGAP158for 5′-CCTTCTCTCTCCTTCCACC-3′ pGAPZA484f 5’-TTCGAAACGAGGAATTCACGATGAG-3’ pGAPZA484r 5’-CTCATCGTGAATTCCTCGTTTCGAA-3’ 实施例2通过饱和诱变在R-羟基腈裂解酶中产生随机突变 通过应用重叠延伸PCR的策略来制备R-羟基腈裂解酶的饱和诱变文库，以获得用于直接转化进Pichia pastoris的表达盒。起初通过PCR制备3条片段。由于有重叠的核苷酸序列，因此继而可能通过重叠延伸PCR将所述片段装配起来。该策略也被阐释于图1B中。
PCRI 该实施例的第-片段除了包含GAP启动子的3’-末端之外还包含α-信号序列和Pahnl5基因的第一片断。片段1延伸至Pahnl5基因待突变的位置。
在每种情况下，60ng的表达质粒pGAPPamHNL5a(EP 1223220A1)、pGAPPamHNL5aV317A(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变V317A(GTA→GCT))和pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、Angew Chem Int Ed Engl，2003，42，4815中)被用作为PCR的模板。
制备100μl PCR混合物(1x HF Phusion缓冲液、0.2mM dNTPs、0.4μM的每种引物、1.2U来自Finnzymes的Phusion DNA聚合酶(Cat.No.F530L))，在Applied Biosystems(Forster City，CA)热循环仪中进行PCR。用pGAP158for/V113Xlongrev引物对在位置V113处进行饱和诱变。用pGAP158for/V317Xshortrev引物对在位置V317处进行饱和诱变。用pGAP158for/V329Xshortrev引物对在位置V329处进行饱和诱变。用pGAP158for/V360Xshortrev引物对在位置V360处进行饱和诱变，用pGAP158for/A111rev引物对在位置N110和G112处进行组合的饱和诱变。
使用下述温度程序 A)98℃变性30秒 B)98℃10秒、60℃20秒和72℃1分钟的30个循环 C)72℃延伸7分钟。
PCR之后通过DpnI消化除去DNA模板。为实现此目的，将2μl DpnI(10U/μl)加进100μl PCR混合物，混合物在37℃孵育2-3小时。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick Gel Extraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
PCRII. 第二片段在待突变的位点从引物延伸至Pahnl5基因的末端。在每种情况下，60ng的表达质粒pGAPPamHNL5a(EP 1223220A1)、pGAPPamHNL5aV317A(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变V317A(GTA→GCT))和pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，含有额外突变L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、Angew Chem IhtEd Engl，2003，42，4815中)被用作为PCR的模板。
制备100μl PCR混合物(1x HF Phusion缓冲液、0.2mM dNTPs、0.4μM的每种引物、1.2U来自Finnzymes的Phusion DNA聚合酶(Cat.No.F530L))，在Applied Biosystems(Forster City，CA)热循环仪中进行PCR。用V113Xshortfwd/PaHNL5endBr引物对在位置V113处进行饱和诱变。用V317Xlongfwd/PaHNL5endBr引物对在位置V317处进行饱和诱变。用V329Xlongfwd/PaHNL5endBr引物对在位置V329处进行饱和诱变。用V360Xlongfwd/PaHNL5endBr引物对在位置V360处进行饱和诱变，用A111Mutfor/PaHNL5endBr引物对在位置N110和G112处进行组合的饱和诱变。
98℃30秒的变性步骤之后是30个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
PCR之后通过DpnI消化除去DNA模板。为实现此目的，将2μl DpnI(10U/μl)加进100μl PCR混合物，混合物在37℃孵育2-3小时。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick Gel Extraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
PCRIII 编码博莱霉素抗性的片段3扩增自pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒(对应于EP 1223220A1的pGAPPamHNL5a，具有额外突变L1Q和A111G，描述于EP 1223220A1以及WO 2004/083424、Angew Chem IntEd Engl，2003，42，4815中)或pGAPPamHNL5a质粒(EP 1223220A1)，这使用PaHNL4L1Qendf3/Ocyctermrv1引物对来进行。
PCR以100μl反应体积(60ng质粒DNA、1x Phusion HF缓冲液、0.2mM dNTPs、0.4μM的每种引物、1.2U来自Finnzymes的PhusionHigh-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L))在Applied Biosystems热循环仪中进行。
98℃30秒的变性步骤之后是30个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
PCR之后，通过DpnI消化除去DNA模板。然后通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或按照QIAquick GelExtraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对PCR产物加以纯化。
线性表达盒的装配 通过重叠延伸PCR以两个步骤来进行装配。
在步骤1中，45-60ng PCR I的产物、25-50ng PCR II的产物以及25-30ng PCR III的产物被用作为模板以及同时用作为引物，用于完成邻接的产物。延伸在50μl反应混合物(含有1x Phusion HF缓冲液、0.2mMdNTPs和0.6U来自Finnzymes的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L))中于Applied Biosystems热循环仪中进行。98℃30秒的变性步骤之后是10个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
在步骤2中，将下述组分加入步骤1的PCR混合物34.7μl水(最纯的质量)、10μl 5x Phusion HF缓冲液、1μl 10mM dNTPs、2μlpGAP158for引物(20pmol/μl)、2μl Ocyctermrv1引物(20pmol/μl)和0.6U来自Finnzymes的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L)。混合物在98℃变性30秒。这之后是20个扩增循环(98℃10秒、60℃20秒、72℃1分钟)以及72℃7分钟的最后步骤。
将线性表达盒转化进Pichia pastoris 按照来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)或QIAquick Gel Extraction试剂盒(Cat.No.27106)的纯化方案对重叠延伸PCR产物加以纯化。这之后是通过BlnI(AvrII)(Roche，Cat.#11558161001)或XmaJI(AvrII)(Fermentas，Cat.#ER1561)进行的限制性消化。通过乙醇沉淀来纯化切割反应混合物，然后按照Invitrogen标准方案将大约1μg制备的DNA转化进Pichia pastoris X33。1μg DNA产生了1000-6000个转化子。
引物序列 A111Mutfor 5′-ATCCTCGGTGGCACGACCATAATCNNKGGANNKGTCTACGCCAGAGCTAACA-3′ A111rev 5′-GATTATGGTCGTGCCACCGAGGATC-3′ Ocyctermrv1 5′-TGCTCACATGTTGGTCTCCAGCTTGC-3′ PaHNL4L1Qendf3 5′-GTCAGATAGCGAGGTCACTCAGTCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAG-3′ PaHNL5endBr 5’-GACTGAGTGACCTCGCTATCTGACTCACATGGACTCTTGAAT-3’ pGAP158for 5′-CCTTCTCTCTCCTTCCACC-3′ V113Xshortfwd 5’-TACGCCAGAGCTAACATTTCATTC-3’ V113Xlongrev 5’-GAATGAAATGTTAGCTCTGGCGTAMNNGCCTGCATTGATTATGGTCGTGCC-3’ V317Xlongfwd 5’-CCCAAATCCAATTGAAGCCTCTGTTNNKACTGTTTTAGGCATTAGAAGTGATTATTATCAAG-3’ V317Xshortrev 5’-AACAGAGGCTTCAATTGGATTTGG-3’ V329Xlongfwd 5’-CTGTTTTAGGCATTAGAAGTGATTATTATCAANNKTCTCTGTCAAGCTTGCCATTTTCC-3’ V329Xshortrev 5’-TTGATAATAATCACTTCTAATGCCTAAAACAG-3’ V360Xlongfwd 5’-CCAAATTCGACTTTTGCTCATATTNNKAGCCAAGTTCCAGGACCATTGT-3’ V360Xshortrev 5’-AATATGAGCAAAAGTCGAATTTGG-3’ 实施例3在深孔板中培养Pichia pastoris转化子以及筛选PaHNL5突变体 A)针对提高的转化(R)-2-氯苯乙醇腈的活性进行搜索 用转化子的单个菌落接种2ml深孔板中的400μl BM5D培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；50g/l D-葡萄糖；0.4mg/l生物素)，将其在振荡下于320rpm和28℃、80％湿度下培养。96小时的培养时间后，通过离心移出细胞，培养物上清液直接用于测量酶活性。
活性检验在96孔PS微滴定板(Greiner Bio-One GmbH，D；Cat.No.655101)中进行。向每个孔中引入130μl 0.1M磷酸盐-柠檬酸盐(pH5.0)缓冲液，然后与培养物上清液的20μl合适稀释液混合。通过加入50μl底物溶液(0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)中的10mg/ml(R)-2-氯苯乙醇腈)来开始酶反应。在室温下，在Plate Reader SpectramaxPlus 384(Molecular Devices，D)上，监测300nm处的吸光度曲线斜率，进行5分钟(Weis et al.，J Mol Catal BEnzym，2004，29，211)。
通过在每种情况下针对使用的各MnCl2浓度检验96个转化子的转化(R)-2-氯苯乙醇腈的活性，来分析不同MnCl2浓度对于R-HNL随机诱变文库质量的影响。结果概括于表1中。在没有添加MnCl2的时候获得了最大的活性克隆比例。选择该条件，以产生10000个转化子。
表1比较多种epPCR条件
针对提高的(R)-2-氯苯乙醇腈的转化，测试了具有随机突变的大约10000个转化子(随机突变是通过HotStarTaq DNA聚合酶基于pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒DNA通过易错PCR引入的)或1000个饱和诱变转化子(基于pGAPZAPaHNL5αL1Q，A111G质粒，含有位置N110和G112处的突变)。首先选出具有提高的转化(R)-2-氯苯乙醇腈活性的R-HNL转化子，用于再次筛选，然后再进行进一步分析。为进行再次筛选，选出的转化子被分别划线。对于每种经划线的转化子，再使用4-8个个体菌落，用于在每种情况下接种2ml深孔板中的400μl BM5D培养基。以与第一轮筛选相近的方式来进行培养和随后的分析。
B)通过将羟基新戊醛转化为(R)-羟基新戊醛氰醇来分析PaHNL5突变蛋白 转化子的单个菌落被用于接种2ml深孔板中的700μl BM7,5D培养基(0.4M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；75g/l D-葡萄糖；0.4mg/l生物素；25μg/ml博莱霉素)，将其在振荡下于320rpm和28℃、80％湿度下培养。120小时的培养时间后，通过离心移出细胞，培养物上清液直接用于测量酶活性。
活性检验以2步进行。首先，将羟基新戊醛酶促转化为相应的(R)-羟基新戊醛氰醇。这之后通过剩余醛与4-肼基-7-硝基苯呋咱(4-NBDH)的颜色反应来测定转化，或在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上通过GC来测定反应混合物衍生化之后的对映异构过量。
首先选出具有提高的转化(R)-2-氯苯乙醇腈活性的R-HNL转化子，用于再次筛选，然后再进行进一步分析。为进行再次筛选，选出的转化子被分别划线。对于每种经划线的转化子，再使用4-8个个体菌落，用于在每种情况下接种2ml深孔板中的700μl BM7,5D培养基。以与第一轮筛选相近的方式来进行培养和随后的分析。
I)转化羟基新戊醛 氰醇反应在2ml Scienceware

96深孔板(Scienceware/Bel-Art)中于室温进行。向每个孔中引入400μl培养物上清液，将其与150μl 3M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 2.4)混合。随后，向每个孔中加入200μl羟基新戊醛底物溶液和磁力搅拌棒(Cat.No.VP 734-2，V&P Scientific，CA，USA)。通过向46.8ml 3M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 2.4)中加入1.2ml简短加热的液体羟基新戊醛来制备羟基新戊醛底物溶液。最后，加入22μl 12M NaCN溶液，以开始反应。为防止HCN逸散，用SILVERsealTMSealer铝箔(Greiner Bio-One GmbH，D，Cat.No.676090)覆盖深孔板。使用来自V&P Scientific(CA，USA)的磁力搅拌棒(Cat.No.VP 734-2)和Alligator Tumble Stirrer来混合微反应混合物。反应期间选用25Hz的混合频率。
1小时后，通过移走SILVERsealTM Sealer铝箔和加入50μl 50％(v/v)硫酸溶液来停止反应。由此，反应溶液的pH变为pH＜1.0，羟基新戊醛停止转化，并且以这种方式除去HCN共底物。反应混合物随后被分析。
II)通过与的4-肼基-7-硝基苯呋咱(4-NBDH)的颜色反应来测定转化 该筛选方法能测定羟基新戊醛反应混合物中剩余的醛浓度。来自BMG LABTECH GmbH(Offenburg，D)的FLUOstar OPTIMA平板读数仪被用于荧光分析。485-P滤光片被用作为激发光过滤器，520-P滤光片被用作为发射光过滤器。荧光分析在来自Greiner Bio-One(Cat.No.651201)的96孔PP微滴定板中进行。每个孔装有150μl 3M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 2.4)，再向其中加入10μl经1∶10稀释的羟基新戊醛反应混合物，最后加入60μl饱和的NBDH/乙醇溶液，以启动NBDH向相应腙的转化。高荧光的腙的增加被监测到超过3分钟，该反应的斜率与反应混合物中剩余的醛的量直接相关。
III)通过手性GC测定对映异构过量 用甲基叔丁基醚(MTBE)来萃取酶促转化期间形成的羟基新戊醛和相应的氰醇将96孔板中的羟基新戊醛反应混合物与500μl MTBE混合，通过来自V&P Scientific(CA，USA)的Alligator Tumble Stirrer以20Hz搅拌5分钟。再过10分钟后，将35μl有机相转移至来自Greiner Bio-One(Cat.No.651201)的96孔PP微滴定板。随后，加入140μl CH2Cl2、23μl乙酸酐和23μl的吡啶，用SILVERsealTM Sealer铝箔(Greiner Bio-One GmbH，D，Cat.No.676090)密封微滴定板。衍生化反应于450rpm和室温下于来自Heidolph Instruments(D)的Titramax 1000摇床上进行30分钟。然后通过Hewlett Packard 6890GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB(25m x 0.32mm，0.25μm膜))上对经衍生化的样品进行分析。来自CTC Analytics的GC PAL，CTC-10022Autosampler被用作为自动取样仪。还可在测量期间将样品于4℃冷却。关于检测仪和进口的其它设置以及所用的温度程序和针对R-和S-羟基新戊醛氰醇获得的驻留时间如下所示 进口 -设置分裂 -GasH2 -温度250℃ -压力1.0bar -分裂比20∶1 温度程序 -110℃-0分钟 -10℃/分钟，至130℃ -20℃/分钟，至170℃ -170℃-0.5分钟 -时间4.5分钟 FID检测仪 -温度250℃ -H220ml/分钟 -空气200ml/分钟 -N230ml/分钟 驻留时间 -R-羟基新戊醛氰醇2.44分钟 -S-羟基新戊醛氰醇2.55分钟 实施例4通过“菌落PCR”进行序列检查 通过PCR对整合的突变的hnl5基因进行扩增和测序，来分析最佳Pichia转化子。
为达到此目的，将Pichia pastoris单菌落重新悬浮于50μl Y-Per

，加热至65℃，10分钟。混合物在冰上简单冷却，然后与60μl苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合，并混合均匀。在桌面离心机上以13200rpm对反应混合物进行30分钟的离心。离心之后将水相转移至新的Eppendorf管中，通过乙醇沉淀加以纯化。然后将沉淀的DNA溶解于50μl水(最高纯度)中，取2-5μl该DNA制备物作为对经突变hnl5基因进行PCR扩增的模板。总体积为100μl的反应混合物还包括两种引物pGAPZA484f和HNL5alp21(其浓度为每种0.4μM)、0.2mM dNTPs、1x Phusion HF缓冲液和1.2U来自Finnzymes的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(Cat.No.F530L)。在Applied Biosystems热循环仪中进行3阶段PCR，该PCR包括下述步骤 98℃30秒，接着是35个循环，每个循环为98℃10秒，60℃20秒和72℃1分钟，最后是72℃7分钟的单次孵育。
通过来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒(Cat.No.28106)的两次纯化后，PCR产物被用于测序。
引物序列 HNL5alp21 5′-ATGGTACCGAATTCTCACATGGACTCTTGAATATTATGAATAG-3′ pGAPZA484f 5’-TTCGAAACGAGGAATTCACGATGAG-3’ 按照菌落PCR方法，通过扩增和测序来检查具有提高的分别转化(R)-2-氯苯乙醇腈和羟基新戊醛的活性的随机诱变R-HNL转化子的整合hnl5基因。
实施例5再将Pahnl5基因的分离变体克隆进pHILD2载体，并培养Pichia pastoris pHILD2转化子 为验证Pahnl5中随机产生的突变确实有助于改进相应的Pahnl5基因，为纯化“多拷贝转化子”以及为改进表达，通过PCR扩增出整合的经突变hnl5基因，通过EcoRI切割位点将其克隆进pHILD2载体(Invitrogen，San Diego，CA)，再针对正确定向加以检查。实施例4中描述了对来自Pichia pastoris转化子基因组DNA的整合的经突变Pahnl5基因的扩增。使用了两种引物HNL5alp21和pGAPZA484f，它们包含EcoRI切割位点。
按照Invitrogen标准方案，将得到的质粒转化进Pichia pastorisGS115。在每种情况下，使用灭菌牙签，将约100个转化子转移到深孔培养板中用于接种，对其加以培养以筛选活性转化子。
为达到此目的，用转化子的单个菌落接种2ml深孔板中的250μlBM0,5G培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；5g/l甘油；0.4mg/l生物素)，在振荡下于320rpm和28℃、80％湿度下培养。60-70小时后，通过加入250μl BMM2培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；10ml/l甲醇；0.4mg/l生物素)来诱导经由AOX1启动子的表达。再过10、24和48小时后，通过每种情况下加入50μl BMM10培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；50ml/l甲醇；0.4mg/l生物素)，来添加更多的甲醇。第一次MeOH诱导后大约72小时，通过离心除去细胞，培养物上清液被直接用于测量酶活性。
通过PCR对整合的经突变hnl5基因再次进行扩增和测序，来分析最佳Pichia转化子。这按照与实施例4相近的方法来进行。
表2示出了对最佳突变体的特定表达菌株的总览

实施例6在2升摇瓶中培养第一轮随机诱变的Pichia pastoris R-HNL突变体，使用(R)-2-氯苯乙醇腈和2-氯苯甲醛来分析PaHNL5突变蛋白 A)在2升摇瓶中培养再克隆的R-HNL转化子 用大的单个菌落接种包含50ml YPD培养基(10g/l BactoTM酵母提取物、20g/l BactoTM蛋白栋、20g/l D-葡萄糖)的预培养物，在振荡下于120rpm和28℃，80％湿度下培养过夜。随后，用预培养物接种2l带档板瓶中的225ml BM0,5G培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；5g/l甘油；0.4mg/l生物素)，提供0.05的起始OD，在振荡下于120rpm和28℃、80％湿度下培养。60-70小时后，通过加入25ml BMM10培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；50ml/l甲醇；0.4mg/l生物素)来诱导经由AOX1启动子的表达。10、24和48小时后，以每烧瓶(250ml)2.5ml来添加更多的甲醇。
第一次甲醇诱导后大约72小时，通过离心除去细胞，培养物上清液直接或以经稀释或浓缩形式用于测量酶活性。
B)分析PaHNL5变体 为测定特定突变体的比活性，每种情况下，将表达克隆培养于多个摇瓶中。使用来自Sartorius(

D)的20ml Vivaspin PES离心柱，通过超滤(10kDa的分离点)来浓缩培养物上清液。随后使用Biorad(Hercules，Ca)蛋白检验(Bradford)来进行蛋白浓缩。用于产生校正线的标准物是来自Sigma的天然PaHNL(M-6782Lot 41H4016)。
从酶样品中取含有大约3μg总蛋白的样品，将其直接应用至凝胶(蛋白凝胶NuPAGE 4-12％Bis Gel 1.0mm X 15孔；Invitrogen)。此外，按照厂商提供的方案，通过内糖苷酶H(Cat.#P0702L，NEB)对含有大约1.5μg总蛋白的样品进行去糖基化，然后上样。使用的标准物是来自Invitrogen(Carlsbad，USA)的SeeBlue Plus2 Pre-Stained标准物。
C)对(R)-2-氯苯乙醇腈的切割 首先，通过光学方法测定本发明突变体在切割底物(R)-2-氯苯乙醇腈(DSM Fine Chemicals Linz，A)方面的酶活性。为达到此目的，向石英比色管中引入0.7μl 0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)，将其与100μl经适当稀释的酶溶液混合。通过最终加入200μl(R)-2-氯苯乙醇腈底物溶液(0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)中的10mg/ml的(R)-2-氯苯乙醇腈)来起始反应。对300nm处吸光度斜率加以5分钟监测。表3概括了第一次随机诱变文库的R-HNL突变蛋白的比活性。
表3PaHNL5αL1Q、PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明突变体在切割底物(R)-2-氯苯乙醇腈方面的比活性
突变蛋白A111G4_E10、N3IA111G、I108MA111G和N110SA111G显示了提高的(R)-2-氯苯乙醇腈切割比活性。
I304VA111G在培养物上清液中直接显示了高活性，但是没有提高的比活性，这暗示了增加的表达。
D)(R)-2-氯苯乙醇腈的合成 为比较本发明突变体对于(R)-2-氯苯乙醇腈合成的选择性，将15mmol2-氯苯甲醛溶解于2.1ml叔丁基甲基醚(MTBE)中。用50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.4)来溶解相应的PaHNL制备物(0.5mg)，得到3.7ml的终体积。再次将缓冲溶液调节至pH 3.4，然后与30ml玻璃管中MTBE里溶解的底物混合。将溶液冷却至10℃，使用注射器计量加入1.2ml液体HCN。使用来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器，以700rpm搅拌，产生乳液。
在多个时间点取样，存在吡啶和二氯甲烷的情况下，用乙酸酐进行衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表4示出了不同时间点后本发明R-HNL变体转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表4PaHNL5αL1Q、PaHNL5αL1Q，A111G(都是WO 2004/083424中的)和本发明R-HNL变体在(R)-2-氯苯乙醇腈合成方面的转化率和对映异构过量(n.d.-未测定)
变体A111G4_E10、N3IA111G和I108MA111G较之PaHNL5αL1Q，A111G产生了增加的转化率，并且显示出提高的(R)-2-氯苯乙醇腈合成活性。N110SA111G在(R)-2-氯苯乙醇腈合成方面具有降低的活性，但是在(R)-2-氯苯乙醇腈切割方面具有提高的活性。该比较表明N110S突变仅导致切割反应催化速率增加。
实施例7用于将有益突变组合起来的位点特异性诱变 在每种情况下，用10ng表达质粒pHILD2-PaHNL5αL1Q，I108M，A111G，2_A11*；pHILD2-PaHNL5αL1Q，A111G，4_E10；pHILD2-PaHNL5αL1Q，N110S，A111G，16_A3或pHILD2-PaHNL5

V317A(见实施例5)作为模板，用于通过来自Stratagene的QuikChange XL Site DirectedMutagenesis Kit(Cat.#200516)进行诱变反应。在每种情况下，用200ng特定的两种诱变引物进行反应。
使用下述温度程序 A)95℃变性1分钟 B)8个循环，每个是95℃50秒，60℃50秒和68℃10分钟 C)68℃延伸7分钟。
按照试剂盒方案所述，通过DpnI消化除去模板DNA，按照所述内容，用2μl反应混合物转化超感受态E.coli XL10 Gold细胞。从转化子制备质粒DNA，对其加以测序。在编码DNA插入的区域具有正确序列的突变体的质粒被扩增，并在Invitrogen标准方案的协助下转化进Pichiapastoris GS115。
在深孔板中培养大约100个组氨酸自养型Pichia转化子，通过(R)-2-氯苯乙醇腈切割反应测定培养物上清液的活性(见实施例3)。在每种情况下，各突变体中具有最高酶活性的克隆被选用来进行摇瓶实验。
用于位点特异性诱变的PCR引物 对于N3I突变而言，基于pHILD2-PaHNL5αL1Q，I108M，A111G，2_A11*质粒或pHILD2-PaHNL5αL1Q，I108M，A111G，4_E10质粒 N3If5′-GCTGAAGCTCAAGCCATTACTTCTGCTCATGAT-3′ N3Ir5′-ATCATGAGCAGAAGTAATGGCTTGAGCTTCAGC-3′ 对于I108M突变而言，基于pHILD2-PaHNL5αL1Q，N110S，A111G，16_A3质粒 I108Mf5′-CTCGGTGGCACGACCATGATCAGTGGAGGCGTC-3′ I108Mr5′-GACGCCTCCACTGATCATGGTCGTGCCACCGAG-3′ 对于I108M突变而言，基于pHILD2-PaHNL5αL1Q，A111G，4 E10质粒 I108M2f5′-CTCGGTGGCACGACCATGATCAATGGAGGCGTC-3′ I108M2r5′-GACGCCTCCATTGATCATGGTCGTGCCACCGAG-3′ 对于N225S突变而言，基于pHILD2-PaHNL5αL1Q，I108M，A111G，2_A11*质粒 N225Sf 5′-GAAGATCCTCTTCTCTTCCTCTACATCAAATTTGTCAGCTATTG-3′ N225Sr 5′-CAATAGCTGACAAATTTGATGTAGAGGAAGAGAAGAGGATCTTC-3′ 对于I108M和A111G突变而言，基于pHILD2-PaHNL5

V317A质粒 I108M2f5′-CTCGGTGGCACGACCATGATCAATGGAGGCGTC-3′ I108M2r5′-GACGCCTCCATTGATCATGGTCGTGCCACCGAG-3′ 以这种方式制备的PaHNL组合变体因此是 I108MA111G4_E10、N3II108MA111G、N3II108MA111G4_E10、I108MN110SA111G、I108MA111GN225S和I108MA111GV317A。
实施例8针对2-氯苯甲醛的转化对PaHNL5酶变体的生产和分析 为测定特定突变体的比活性，将实施例7中描述的每种表达克隆培养于2l摇瓶中。以与实施例6A相近的方式来进行培养。
使用来自Sartorius(

D)的20ml Vivaspin PES离心柱，通过超滤(10kDa的分离点)来浓缩培养物上清液，然后用其进行酶活性测定。
为测定底物特异性，使用Biorad蛋白检验(Hercules，Ca)测量酶制剂的蛋白浓度。通过GC来测定关于(R)-2-氯苯乙醇腈的转化率和对映异构过量。
为达到此目的，将15mmol 2-氯苯甲醛溶解于2.1ml甲基叔丁基醚(MTBE)中。用50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.4)来稀释0.5mg相应的PaHNL制备物，得到3.7ml的终体积。再次将缓冲溶液调节至pH3.4，然后与30ml玻璃管中溶解于MTBE中的底物混合。将溶液冷却至10℃，使用注射器加入1.2ml液体HCN。用来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器以700rpm搅拌，产生乳液。
在多个时间点取样，存在吡啶和二氯甲烷的情况下，用乙酸酐进行衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表5示出了不同时间点后本发明R-HNL变体转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表5PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体在(R)-2-氯苯乙醇腈合成方面的转化率和对映异构过量
I108MA111G与N225S的组合在转化率或对映异构过量方面没有显示进一步改进。但是通过将第一次随机诱变文库的最佳突变组合起来，有可能较之I108MA111G变体进一步增加转化率。每摩尔底物仅使用33.3mg未经纯化的酶制备物，6小时后就已经实现了近乎完全的转化。例如N3II108MA111G4_E10变体6小时后达到了99.7％的转化率。
实施例9在5升生物反应器中生产A111G(WO 2004/083424)、A111G4_E10、N3IA111G、I108MA111G、N3II108MA111G和N3II108MA111G4_E10突变蛋白 在5l发酵罐中生产克隆——WO 2004/083424的Pichia pastoris GS115pHILDPaHNL5alphaL1Q，A111G和实施例6-8中描述的克隆——Pichiapastoris GS115 pHILD2-PaHNL5αL1Q，A111G，4_E10；Pichia pastorisGS115 pHILD2-PaHNL5αL1Q，N3I，A111G，25_H2；Pichia pastoris GS115pHILD2-PaHNL5αL1Q，I108M，A111G，2_A11*；Pichia pastoris GS115pHILD2-PaHNL5αL1Q，N3I，I108M，A111G和Pichia pastoris GS115pHILD2-PaHNL5αL1Q，N3I，I108M，A111G4_E10的足够量的酶，用于进一步分析。选用Muts菌株来培养。
首先，用大的单个菌落接种每种克隆的预培养物，其中包含50mlYPD培养基(10g/l BactoTM酵母提取物、20g/l BactoTM蛋白胨、20g/l D-葡萄糖)，并在28℃和120rpm培养24小时。用第一预培养物接种2l带挡板瓶中的2x 200ml YPD。培养在28℃和120rpm下进行大约20小时。
将针对3.5升计算的量的化学品1-7溶解于去离子水中，然后引入5l生物反应器(来自Sartorius，

D的Biostat

CT)。原位灭菌之后，通过经由进料泵的无菌添加，用25％的氨将培养基的pH调节至pH5.0。这之后是通过无菌注射器向生物反应器中引入13.5ml经过滤灭菌的痕量元素溶液(包含维生素H)。
每种情况下，两个2l摇瓶中大约400ml预培养物被用于接种。发酵罐中的起始OD600为1-2。操作温度为28℃，通气速率为2.5-10升空气/分钟，搅拌速度在500至1500rpm之间，氧分压(pO2)保持为＞30％饱和浓度的值。通过经由进料泵无菌添加25％的氨，将培养基pH保持恒定为pH5.0。
最初引入的甘油被消耗之后，15-20小时的发酵时间后，开始计量加入甘油培养基，最初是45ml/小时。加入速率逐渐增加至90-100ml/小时，持续大约12小时，直到达到大约150OD600。然后停止加入甘油。
通过计量加入甲醇诱导表达来启动发酵的第三阶段。加入速率最初被调节为10-15ml/小时。该速率在12-15小时期间逐渐增加至45-60ml/小时，并再保持60小时。
甲醇诱导大约72小时后，通过在具有Beckman JLA 8.1000转子的Beckman CoulterTM(Fullerton，Ca，USA)AvantiTM J-20XP离心机中于4℃以4000rpm进行两次20分钟的离心，来收获细胞。收集培养物上清液，测定(R)-2-氯苯乙醇腈切割的酶活性。用0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)来适当地稀释发酵上清液，加入(R)-2-氯苯乙醇腈底物溶液(0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)中的10mg/ml的(R)-2-氯苯乙醇腈)后，在微滴定板中对300nm的吸光度进行5分钟监测。离心之后培养物上清液中酶活性是2l摇瓶中发酵之后的大约10-15倍高。
使用来自Sartorius的30kDa分离点模块(VIVASCIENCE Vivaflow50，来自Sartorius，

D)，通过横流超滤来浓缩培养物上清液。由此产生蛋白浓度为1-3mg/ml的酶制备物，其在4℃储藏短时间，在-20℃储藏更长的时间。鉴于Pichia pastoris极少将其自身蛋白分泌进培养物上清液，以这种方式生产和浓缩的酶已经非常纯了。
用下述化学品来制备培养基(每3.5l的量) 1.85％正磷酸 73.5ml 2.CaSO4.2H2O 3.15g 3.K2SO4 50.05g 4.MgSO4.7H2O 42.7g 5.KOH11.55g 6.甘油 140g 7.去离子水，导电率5.5-9.1μS/cm3.5l 8.消泡剂10％Acepol 83E 1ml (Carl Becker Chemie GmbH，Hamburg，D) 9.4.35ml/l痕量元素溶液(原位灭菌后添加) 10.25％氨，技术级 具有维生素H的痕量元素溶液(每l的量) 11.生物素 0.2g 12.CuSO4.5H2O 6.0g 13.KI 0.09g 14.MnSO4.H2O3.0g 15.Na2MoO4.2H2O 0.2g 16.H3BO30.02g 17.CoCl20.5g 18.ZnSO4.7H2O 42.2g 19.Fe(II)SO4.7H2O 65g 20.H2SO45ml 甘油培养基 将750g甘油与去离子水混合，提供1.5l溶解并灭菌的。随后，加入12ml/l痕量元素溶液。
甲醇培养基 将0.9l甲醇引入无菌的2l瓶中，将其与12ml/l痕量元素溶液混合。
实施例10对5升发酵罐中产生的酶变体进行纯化和分析 对发酵罐中产生后被浓缩的酶制备物进行色谱纯化。
纯化之前，通过用低盐结合缓冲液A(20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液，pH 5.5)反复稀释和浓缩，对经浓缩的酶制备物加以平衡。这通过30kDa分离点模块(VIVASCIENCE Vivaflow 50，来自Sartorius，

D)，通过横流超滤来进行。然后在来自Amersham Biosciences UKLimited(Buckinghamshire，UK)的

10FPLC仪器上，以10ml的柱体积经由阴离子交换Q-Sepharose Fast Flow(QFF)柱对经平衡的酶制备物加以纯化。使用洗脱缓冲液B(20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液+1M NaCl，pH 5.5)进行洗脱。在纯化之前，用5倍体积的缓冲液A对柱加以平衡。之后，将表6列出的梯度设置用于Pichia pastoris异源生产的多种PaHNL5变体。
表6用于通过10ml阴离子交换Q-Sepharose Fast Flow(QFF)柱对多种PaHNL5变体进行纯化的梯度设置
选用2ml/分钟的流速和2ml的级分体积。通过Biorad(Hercules，Ca)蛋白检验(Bradford方法)来测量根据色谱评估应当含有蛋白(取决于峰位置)的那些级分的蛋白含量。还测定了这些级分中切割(R)-2-氯苯乙醇腈的酶活性。合并含有最高活性的2-3份级分，用其进行对酶性质的进一步分析。通过Biorad(Hercules，Ca)蛋白检验(Bradford)来测定蛋白浓度。用于制备校正线的标准物是来自Sigma的天然PaHNL(M-6782Lot 41H4016)。
从酶样品中取含有大约3μg总蛋白的样品，将其直接应用至凝胶(蛋白凝胶NuPAGE 4-12％Bis Gel 1.0mm X 15孔；Invitrogen)。此外，按照厂商提供的方案，通过内糖苷酶H(Cat.#P0702L，NEB)对含有大约1.5μg总蛋白的样品进行去糖基化，然后应用至蛋白凝胶。使用的标准物是来自Invitrogen(Carlsbad，USA)的SeeBlue Plus2 Pre-Stained标准物。
使用经纯化的R-HNL变体，分别针对(R)-2-氯苯乙醇腈、(R)-2-溴苯乙醇腈和(R)-2-氟苯乙醇腈的合成，来测定酶性质。
为达到此目的，将15mmol 2-氯苯甲醛、2-溴苯甲醛或2-氟苯甲醛溶解于2.1ml叔丁基甲基醚(MTBE)中。用50mM磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.4)来溶解相应的PaHNL变体(0.25mg或0.5mg)，得到3.7ml的终体积。再次将缓冲溶液调节至pH 3.4，然后与30ml玻璃管中MTBE里溶解的底物混合。将溶液冷却至10℃，使用注射器计量加入1.2ml液体HCN。使用来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器，以700rpm搅拌，产生乳液。
在多个时间点取样，存在吡啶和二氯甲烷的情况下，用乙酸酐进行衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表7a)-d)示出了不同时间点后本发明R-HNL变体转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表7a在5l发酵罐中生产之后，经纯化R-HNL变体的转化率和对映异构过量变体PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体用于合成(R)-2-氯苯乙醇腈。

表7b在5l发酵罐中生产之后，经纯化R-HNL变体的转化率和对映异构过量变体PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体用于合成(R)-2-溴苯乙醇腈。


表7c在5l发酵罐中生产之后，经纯化R-HNL变体的转化率和对映异构过量变体PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体用于合成(R)-2-氟苯乙醇腈。

表7d在5l发酵罐中生产之后，未经纯化R-HNL变体的转化率和对映异构过量在每种情况下，0.25mg变体PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体用于合成(R)-2-氯苯乙醇腈。

表8在5l发酵罐中生产之后，经纯化R-HNL变体的比活性和TOF(周转频率)变体PaHNL5αL1Q，A111G(WO 2004/083424)和本发明R-HNL变体用于合成(R)-2-氯苯乙醇腈。
实施例11在摇瓶中培养Pichia pastoris转化子以及针对羟基新戊醛的转化对酶变体加以分析 从2l摇床培养物中的克隆Pichia pastoris GS115 pHILDPaHNL5αL1Q(WO 2004/083424)、Pichia pastoris GS115 pHILDPaHNL5αL1Q，V317G(WO 2004/083424)和Pichia pastoris GS115 pHILD2-PaHNL5

V317A(见实施例2和实施例5)制备足够量的酶，用于最初的分析。
A)培养Pichia pastoris转化子 在每种情况下，用转化子的单个菌落接种接种2l带档板瓶中的135ml BM0,5G培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；5g/l甘油；0.4mg/l生物素)，在振荡下于120rpm和28℃、80％湿度下培养。60-70小时后，通过加入15ml BMM10培养基(0.2M磷酸钾，pH 6.0；13.4g/l酵母氮基础；50ml/l甲醇；0.4mg/l生物素)来诱导经由AOX1启动子的表达。10、24和48小时后，以每烧瓶(150ml)1.5ml来添加更多的甲醇。
第一次甲醇诱导后大约72小时，通过离心除去细胞，培养物上清液直接或以经稀释或浓缩形式用于测量酶活性。
B)分析PaHNL5变体 使用来自Sartorius(

D)的20ml Vivaspin PES离心柱，通过超滤(10kDa的分离点)对来自摇瓶的培养物上清液进行大约20倍浓缩。随后使用Biorad(Hercules，Ca)蛋白检验(Bradford)来进行蛋白浓缩。用于产生校正线的标准物是来自Sigma的天然PaHNL(M-6782 Lot41H4016)。
从酶样品中取含有大约3μg总蛋白的样品，将其直接应用至凝胶(蛋白凝胶NuPAGE 4-12％ Bis Gel 1.0mm X 15孔；Invitrogen)。此外，按照厂商提供的方案，通过内糖苷酶H(Cat.#P0702L，NEB)对含有大约1.5μg总蛋白的样品进行去糖基化，然后上样。使用的标准物是来自Invitrogen(Carlsbad，USA)的SeeBlue Plus2 Pre-Stained标准物。图2示出了PaHNL5αL1Q(＝WT)、V317G和V317A突变蛋白的SDS-PAGE。
C)合成(R)-羟基新戊醛氰醇 为针对羟基新戊醛向相应(R)-氰醇转化的选择性对本发明的突变体加以比较，在每种情况下，用3M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 2.4)将1mg相应PaHNL稀释至终体积5ml。通过加入50％(w/w)柠檬酸溶液，再次将缓冲溶液调节至pH 2.4，并将其与30ml玻璃管中120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛混合。将溶液冷却至4℃，使用注射器计量加入100μl液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm搅拌溶液。
在多个时间点取样，存在吡啶和二氯甲烷的情况下，用乙酸酐进行衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表9示出了不同时间点后本发明R-HNL变体转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表9使用底物羟基新戊醛时，PaHNL5αL1Q(＝WT)、PaHNL5αL1Q，V317G(都是WO 2004/083424)和PaHNL5

V317A在相应(R)-氰醇合成方面的转化率和对映异构过量
(n.d.-未测定；rac-外消旋) 虽然V317G变体在转化羟基新戊醛方面实现了与野生型(PaHNL5αL1Q)大致相同的对映异构过量，但是V317A变体能实现好得多的选择性和转化率。
实施例12在5升发酵罐中生产V317A突变体 在5l发酵罐中从克隆Pichia pastoris GS115pHILD2-PaHNL5

V317A(见实施例2和实施例5)制备足够量的酶，用于进一步分析。选用Muts菌株来培养。
首先，用大的单个菌落接种预培养物(包含50ml YPD培养基(10g/lBactoTM酵母提取物、20g/l BactoTM蛋白胨、20g/l D-葡萄糖))，并在28℃和120rpm培养24小时。用所述第一预培养物接种2l带挡板瓶中的2x 200ml YPD。这之后是在28℃和120rpm下培养大约10小时。
发酵所需的所有化学品都是之前在实施例9中提到的。
将针对3.5升计算的量的化学品1-7溶解于去离子水中，然后引入5l生物反应器(来自Sartorius的Biostat

CT)。原位灭菌之后，通过经由进料泵的无菌添加，用25％的氨将培养基的pH调节至pH 5.0。这之后是通过无菌注射器向生物反应器中引入13.5ml经过滤灭菌的痕量元素溶液(包含维生素H)。
每种情况下，两个2l摇瓶中大约400ml预培养物被用于接种。发酵罐中的起始OD600为1.2。操作温度为28℃，通气速率为2.5-10升空气/分钟，搅拌速度在500至1500rpm之间，氧分压(pO2)保持为＞30％饱和浓度的值。通过经由进料泵无菌添加25％的氨，将培养基pH保持恒定为pH5.0。
最初引入的甘油被消耗之后，15-20小时的发酵时间后，开始计量加入甘油培养基，最初是45ml/小时。加入速率逐渐增加至90-100ml/小时，持续大约15小时，直到达到大约180OD600。然后停止加入甘油。
通过计量加入甲醇诱导表达来启动发酵的第三阶段。加入速率最初被调节为10-15ml/小时。该速率在12-15小时期间逐渐增加至45-60ml/小时，并再保持60小时。
甲醇诱导大约72小时后，通过在具有Beckman JLA 8.1000转子的Beckman CoulterTM(Fullerton，Ca，USA)AvantiTM J-20XP离心机中于4℃以4000rpm进行两次20分钟的离心，来收获细胞。收集培养物上清液，测定(rac)-苯乙醇腈切割的酶活性。用1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)来适当地稀释发酵上清液，加入苯乙醇腈底物溶液(40μl(rac)-苯乙醇腈+5ml 0.1M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0))后，对280nm的吸光度进行5分钟监测。离心之后培养物上清液中酶活性是62.4U/ml，这产生来大约174 700U的酶产量，这是大约2.8l培养物上清液的总产量。
使用来自Sartorius的30kDa分离点模块(VIVASCIENCE Vivaflow50，来自Sartorius，

D)，通过横流超滤来浓缩培养物上清液。以这种方式，制备了蛋白浓度为3.715mg/ml、酶活性为316.1U/ml(标准HNL检验，采用rac-苯乙醇腈)的V317A酶制备物。酶制备物被分为1ml或6ml的小份试样，在-20℃储藏。鉴于Pichia pastoris极少将其自身蛋白分泌进培养物上清液，以这种方式生产和浓缩的酶已经非常纯了(也见图4)。
在发酵期间的多个时间点取样。通过离心除去细胞，通过Biorad(Hercules，Ca)蛋白检验(Bradford)来测定培养物上清液的蛋白浓度。用于制备校正线的标准物是来自Sigma的天然PaHNL(M-6782 Lot41H4016)。
各培养物上清液取5μl直接应用至凝胶(蛋白凝胶NuPAGE 4-12％Bis Gel 1.0mm X 15well；Invitrogen)。此外，按照厂商提供的方案，每种情况下，通过内糖苷酶H(Cat.#P0702L，NEB)对3μl培养物上清液进行去糖基化，然后上样。使用的标准物是来自Invitrogen(Carlsbad，USA)的SeeBlue Plus2 Pre-Stained标准物。图3和4分别示出了天然和去糖基化的V317A样品在5l发酵期间不同时间点的蛋白凝胶。
以与实施例10相近的方式，通过色谱对发酵中产生然后经浓缩的酶制备物加以纯化。
实施例13羟基新戊醛的单体化 化合物羟基新戊醛在室温下是二聚体
羟基新戊醛单体(1)和二聚体(2)之间的平衡 对于与HCN的反应而言，对二聚体进行单体化，以获得暴露的醛基。单体化可以以两种方式进行 A)热单体化 为进行热单体化，以大约100℃对未经稀释形式的羟基新戊醛二聚体加热。发现在该过程中形成了次级产物。醛在大约100℃的温度被加热越久，形成的次级产物的量也就越大。该产物是通过“反常Tishchenko反应”(Finch，J Org Chem，1960，25，2219)产生的2，2-二甲基-1，3-丙二醇和3-羟基-2，2-二甲基丙酸(在Cannizzaro反应中产生的化合物)融合，产生3-羟基-2，2-二甲基丙基-3-羟基-2，2-二甲基丙酸酯(图6)。所有正常的Tishchenko反应(Tishchenko，J Russ Phys Chem Soc，1906，38355，482，540，547)都需要Lewis酸，并且要求不存在水(Fouquet et al.，Liebigs AnnChem，1979，10，1591)。而在本情况下，使用非无水条件，大约100℃的温度足以通过“反常Tishchenko反应”(Finch，J Org Chem，1960，25，2219)形成融合产物。通过GC(图5)在环糊精柱(CP-Chirasil-DexCB)上分析存在吡啶和二氯甲烷时经乙酸酐衍生化的混合物。有可能对单体、二聚体和产生的酯进行分级分离
使用羟基新戊醛(1)进行的“反常Tishchenko反应”(Finch，J OrgChem，1960，25，2219)，产生3-羟基-2，2-二甲基丙基-3-羟基-2，2-二甲基丙酸酯(3)。
B)酸催化的单体化 还可进行酸催化的对二聚体的半缩醛切割，以将平衡向单体方向移动。由于PaHNL5变体在酸性介质中良好的稳定性(WO 2004/083424)，从而还可在低pH值下进行酶催化的HCN加成。
为测试羟基新戊醛单体化在不同pH值下的性质，每种情况下，将180mg液体羟基新戊醛与5ml 30mM磷酸钾缓冲液(pH 2.0-7.0)在30ml玻璃管中混合，以250rpm于室温下在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上上搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
结果示于图8和表10中。羟基新戊醛二聚体的单体化显示进展非常慢。比较28小时后的单体比例，羟基新戊醛单体的量随着溶液pH的减少而增加(见表10)。大约4小时后(见图6)，还在更高的pH值下观察到了相对大的单体比例。但是，在这些pH值下，存在R-HNL时HCN加成的立体选择性仅仅是很低的。
表1028小时后，不同pH值下，羟基新戊醛单体在经缓冲的水溶液中的比例

实施例14使用底物羟基新戊醛和新戊醛，对在5升发酵罐中产生的V317A突变体的分析 检验了多种反应参数对于V317A突变体的选择性和活性的影响。来自5l发酵的V317A酶制备物被用于水性培养基中、用于具有MTBE的两相系统中、以及以在Celite上固定的形式用于有机系统中。在下述实验中，一个单位对应于在pH 5.0和室温下于一分钟内将1μmol苯乙醇腈转化为苯甲醛和HCN的酶的量。
A)在不同pH下于2M磷酸钾缓冲液中转化羟基新戊醛 每种反应混合物5ml，用于在不同pH值下的羟基新戊醛转化。用2M磷酸钾缓冲液在30ml玻璃管中稀释170个单位经浓缩的V317A酶制备物(85.1U/mg)，得到5ml的终体积。对于相应空白反应而言，用相同体积的去离子水代替酶制备物。反应混合物在pH 1.0、pH 1.5、pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0和pH 8.0进行。加入酶制备物或去离子水后，再次将缓冲溶液调节至相应的pH。这之后是加入120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl(＝2.2当量)液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表11和图7示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表11在2M磷酸钾缓冲液(pH 1.0-8.0)中不同pH值下，使用羟基新戊醛，V317A的转化率和对映异构过量(rac＝外消旋)
B)在不同pH下于1M磷酸钾缓冲液中转化羟基新戊醛 每种反应混合物5ml，用于在不同pH值下的羟基新戊醛转化。用1M磷酸钾缓冲液在30ml玻璃管中稀释170个单位经浓缩的V317A酶制备物(85.1U/mg)，得到5ml的终体积。对于相应空白反应而言，用相同体积的去离子水代替酶制备物。反应混合物在pH 1.5、pH 2.0、pH 2.5、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0和pH 6.0进行。加入酶制备物或去离子水后，再次将缓冲溶液调节至相应的pH。这之后是加入120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl(＝2.2当量)液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表12和图8示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。

不同pH下的转化结果揭示，pH 2.0-3.0的pH范围最适合将羟基新戊醛转化为相应的(R)-氰醇。V317A在低于pH 2.0时不具有足够的活性，而高于pH 3.0时的转化也受到非选择性的化学背景反应的不利影响。这表现在随着pH的增加，酶促反应的对映异构过量减少以及纯化学反应(空白反应)的转化增加。
C)比较不同的缓冲液浓度 进一步改变磷酸钾缓冲液浓度。用50mM、100mM、1M或2M的磷酸钾缓冲液(pH 2.5)在30ml玻璃管中稀释170个单位经浓缩的V317A酶制备物(85.1U/mg)，得到5ml的终体积。在空白反应混合物中，用相同体积的去离子水代替酶制备物，并且选用2mol/l的缓冲液浓度。加入酶制备物或去离子水后，再次将缓冲溶液调节至pH 2.5。这之后是加入120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl(＝2.2当量)液体HCN。在来自H+PLabortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表13示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表13V317A在不同磷酸钾缓冲液浓度的水性系统中的转化率和对映异构过量(rac＝外消旋)
当在2小时后比较时，鉴定出了明显的区别。缓冲液浓度越低，得到的转化率值就越低。对映异构过量大致保持稳定。随着反应时间的增加，所述区别近乎完全消失。在2mol/l的缓冲液浓度下，22小时后达到了99.1％的转化率，而在50mmol/l的缓冲液浓度下也测量到98.7％的转化率。较高的缓冲液浓度导致转化率提高可通过下述事实来解释羟基新戊醛的单体化在较高的缓冲液浓度下进展更快，由此提供了更大的单体比例用于HCN加成。
D)使用的酶的量的变化 比较了三种不同的酶的量用3M磷酸钾缓冲液(pH 2.5)在30ml玻璃管中稀释56个单位、112个单位或316个单位的经浓缩的V317A酶制备物，得到5ml的终体积。在空白反应混合物中，用相同体积的去离子水代替酶制备物。加入酶制备物或去离子水后，再次将缓冲溶液调节至pH 2.5。这之后是加入120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl(＝2.2当量)液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag ElectronicrührerPoly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表14示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表14V317A在水性系统中的转化率和对映异构过量-所用的酶的量变化(rac＝外消旋)
甚至在5小时内，羟基新戊醛以94％的对映异构过量和＞93％的转化率直接转化为对应的(R)-氰醇。酶量的增加导致对映异构过量和转化率提高。
E)羟基新戊醛量的变化 用2M的磷酸钾缓冲液(pH 2.5)在30ml玻璃管中稀释170个单位经浓缩的V317A酶制备物(85.1U/mg)，得到5ml的终体积。加入酶制备物后，再次将缓冲溶液调节至pH 2.5。这之后是加入13mg、56mg或120mg液体羟基新戊醛(分别对应于25mM、110mM和235mM终浓度的羟基新戊醛)。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl(＝2.2当量)液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表15示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表15V317A在水性系统中的转化率和对映异构过量-所用的底物的量变化(rac＝外消旋)
通过降低初始羟基新戊醛的量，进一步提高了转化率和对映异构过量。羟基新戊醛初始量为13mg时，6小时后达到了97.0％的ee和100％的转化率。22小时后达到了97.5％的对映异构过量和100％的转化率。
F)使用的HCN的量的变化 用1M磷酸钾缓冲液(pH 2.5)在30ml玻璃管中稀释170个单位经浓缩的V317A酶制备物，得到5ml的终体积。在空白反应混合物中，用相同体积的去离子水代替酶制备物。加入酶制备物或去离子水后，再次将缓冲溶液调节至pH 2.5。这之后是加入120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入70μl(＝1.5当量)、90μl(＝2.0当量)、110μl(＝2.5当量)、140μl(＝3.0当量)、160μl(＝3.5当量)或180μl(＝4.0当量)的液体HCN。在来自H+PLabortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表16示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。

采用不同HCN的量的结果揭示对映异构过量仅有微小区别。随着反应时间的进展，转化率的增加更清楚可见。除了采用3.0当量HCN的转化率之外，都可将转化率的略微提高与增加的初始HCN的量关联起来。此外，还观察到随着初始HCN的量增加对映异构过量略微减少。
G)在两相系统中转化羟基新戊醛，并与纯的水性溶剂系统相比 对于纯的水系统的反应混合物而言，用50mM磷酸钾缓冲液(分别是pH 3.4和5.1)在30ml玻璃管中稀释2mg经浓缩的V317A酶制备物(＝170个单位)或2mg PaHNL5(WO 2004/083424)(＝852个单位)，得到5ml的终体积。加入酶制备物后，再次将缓冲溶液分别调节至pH 3.4和pH 5.1。这之后是加入180mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl液体HCN。在来自H+PLabortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
对于两相系统的反应混合物而言，用50mM磷酸钾缓冲液(分别是pH 3.4和5.1)在30ml玻璃管中稀释2mg经浓缩的V317A酶制备物(＝170个单位)或2mg PaHNL5(WO 2004/083424)(＝852个单位)，得到5ml的终体积。加入酶制备物后，再次将缓冲溶液分别调节至pH 3.4和pH 5.1。这之后是加入2.5ml甲基叔丁基醚(MTBE)和180mg经过简短加热的液体羟基新戊醛。在4℃冷却反应混合物，使用注射器计量加入100μl液体HCN。在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表17示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表17V317A和PaHNL5(＝WT)的转化率和对映异构过量-在2个不同pH值下将纯的水性系统与两相系统相比
在纯的水性系统和两相系统(H2O/MTBE)中，V317A变体均显示出能比PaHNL5野生型更快速地将羟基新戊醛底物转化为相应的(R)-氰醇，并且具有更高的对映选择性。这再次表明，pH的升高导致对映异构过量的降低。这些结果还表明，对于转化羟基新戊醛来说纯的水性系统比两相系统(H2O/MTBE)优选。两相系统获得了更少的对映异构过量和更低的转化率。
H)将V317A或PaHNL5固定到Celite

上以及在微水性、有机溶剂系统中转化羟基新戊醛 将2g Celite

545引入50ml玻璃烧杯中，在室温下，在磁性搅拌器上，与20ml 50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)搅拌45分钟。然后滤出Celite

，用去离子水彻底洗涤。在每种情况下，将140mg洗过的Celite

装入50ml圆底瓶中，其中加入8.6ml 30mM磷酸钾缓冲液(pH 3.4)。此外，加入1.41mg经浓缩的V317A酶制备物(＝120个单位)或1.41mgPaHNL5(WO 2004/083424)(＝600个单位)。混合物均匀混合，在Rotavapor(

Labortechnik AG，Flawil，CH)上在液体N2中冷冻，并在0.040mbar和-50℃冻干14小时30分。
将经固定的物质转移到10ml圆底瓶中，与2970μl二异丙醚(DIPE)、24.8μl 30mM磷酸钾缓冲液(pH 3.4)和120mg经过简短加热的液体羟基新戊醛混合。在室温下在Heidolph Instruments(D)MR 3001磁性搅拌器上搅拌反应混合物，通过加入100μl液体HCN来开始。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表18示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表18在微水性、有机溶剂系统中，固定到Celite

上的V317A和PaHNL5(＝WT)的转化率和对映异构过量(rac＝外消旋) 当在微水性、有机溶剂系统中，固定到Celite

上时，V317A突变体和PaHNL5野生型都显示出了相当的对映选择性。20小时后，获得了大约97％的对映异构过量。但是，该反应系统的缺点在于有机溶剂DIPE中羟基新戊醛二聚体的单体化缓慢，由此导致转化率仅为中等。
I)在100ml反应器中用V317A突变蛋白对1.2g羟基新戊醛进行制备性转化 在具有KPG搅拌器的100ml Schimizo反应器(Schmizo AG，Zofingen，CH)中，用2M磷酸钾缓冲液(pH 2.5)在30ml玻璃管中稀释3mg经浓缩的V317A酶制备物(＝255个单位)，得到50ml的终体积。检查pH，再次调节至pH 2.5。这之后加入1.2g经过简短加热的液体羟基新戊醛(最终浓度235mM)。因此相对于每mmol羟基新戊醛仅使用了255mg的酶。在4℃冷却反应混合物，猛烈搅拌。最后，通过加入1ml液体HCN来开始反应。
20小时的反应时间后开始后处理。从反应器排出反应溶液，用甲基叔丁基醚(MTBE)萃取三次。合并有机相，在Na2SO4上干燥，在旋转式蒸发器上浓缩。
存在吡啶和二氯甲烷的情况下经乙酸酐衍生化后，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
20小时后反应产率为88％，并且具有96％ee。
J)用V317A或PaHNL5将新戊醛转化为(R)-2-羟基-3，3-二甲基丁腈 用30mM磷酸钾缓冲液(pH 3.4)在30ml玻璃管中稀释2mg经浓缩的V317A酶制备物(＝170个单位)或2mg PaHNL5(WO 2004/083424)(＝852个单位)，得到5ml的终体积。加入酶制备物后，再次将缓冲溶液调节至pH 3.4。这之后是加入200μl新戊醛。在4℃冷却反应混合物，并以600rpm搅拌10分钟。再使用注射器计量加入100μl液体HCN。反应期间，在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的VariomagElectronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表19示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表19采用新戊醛时，V317A和PaHNL5(＝WT)的转化率和对映异构过量 采用V317A突变蛋白时，甚至在2小时的反应时间后即发现了定量转化率以及95.7％ee。
实施例15用V317A或PaHNL5将新戊醛转化为(R)-2-羟基-3，3-二甲基丁腈 在5l生物反应器中，从克隆Pichia pastoris GS115 pHILD2-PaHNL5

V317A或Pichia pastoris GS115 pHILD2-PaHNL

(WO2004/083424)制备足够量的酶，用于进一步分析。在每种情况下，使用来自Sartorius的30kDa分离点模块(VIVASCIENCE Vivaflow 50，来自Sartorius，

D)，通过横流超滤，将培养物上清液浓缩大约6倍。
在30ml玻璃管中，用1M磷酸钾缓冲液(pH 3.0)稀释2mg、3mg或4mg经浓缩的V317A酶制备物(分别＝170个单位、256个单位和341个单位)或2mg、3mg或4mg PaHNL5酶制备物(分别＝545个单位、817个单位、1089个单位)，得到5ml的终体积。加入酶制备物后，再次将缓冲溶液调节至pH 3.0。这之后是加入200μl新戊醛(Sigma-Aldrich，T71501)。在9℃冷却反应混合物。再使用注射器计量加入100μl液体HCN。反应期间，在来自H+P Labortechnik(Oberschleiβheim，D)的Variomag Electronicrührer Poly 15磁性搅拌器上以600rpm对溶液加以搅拌。
在不同时间点取样，在存在吡啶和二氯甲烷的情况下用乙酸酐衍生化，通过GC在环糊精柱(CP-Chirasil-Dex CB)上进行分析。
表1示出了不同时间点转化率(％转化)和对映异构过量(％ee)的结果。
表1采用新戊醛时，V317A和PaHNL5(＝WT)的转化率和对映异构过量
使用V317A突变蛋白时，甚至在1小时的反应时间后就发现了定量转化以及97.5％ee。
权利要求
1.具有改进的底物接受性、增加的活性和增加的选择性的R-羟基腈裂解酶，其可通过这样获得在随机诱变和/或饱和诱变技术的协助下引入随机突变，通过筛选或选择来进行鉴定，以及，在合适的情况下，随后将有益的突变组合起来。
2.权利要求1的R-羟基腈裂解酶，其中，所述突变在来自Prunusamygdalus(PaHNL)、Prunus serotina(PsHNL)、Prunus avium、Prunus laurocerasus、Prunus lyonii、Prunus armaniaca、Prunus persica、Prunus domestica(PdHNL)、Prunus mume(PmHNL)、Maluscommunis、Malus pumila、 Cydonia oblonga的R-羟基腈裂解酶或其重组R-羟基腈裂解酶上进行。
3.权利要求1和2的R-羟基腈裂解酶，其中，待修饰的所述R-羟基腈裂解酶的序列是完整的，或者已通过取代开头的一个或多个氨基酸或通过随机插入或缺失而被改变，或者，已通过除去开头的一个或多个氨基酸对所述序列进行了截短，或者通过连上其它氨基酸或通过融合对所述序列进行了延伸。
4.权利要求1至3的R-羟基腈裂解酶，其中，在突变之前，天然或植物信号序列被另外的信号序列替换，所述另外的信号序列来自Saccharomyces cerevisiae α交配因子、Saccharomyces cerevisiae转化酶、Pichia杀灭毒素信号序列、α-淀粉酶、Pichia pastoris酸性磷酸酶、Phaseolus vulgaris凝集素的信号序列；Aspergillus niger葡糖淀粉酶信号序列、Aspergillus niger葡糖氧化酶信号序列、Pichia pastoris Sec10信号序列、Kluyveromyces lactis杀灭毒素28kD亚基的信号序列、BSA信号序列或它们的合成变体构成的组，或所述天然或植物信号序列被合成的共有序列来替换，所述信号序列还可包含点突变、插入或缺失。
5.权利要求1至4的R-羟基腈裂解酶，其中，通过随机突变进行的制备是在定向进化方法以及随后的在微生物中异源或分泌性表达的协助下进行的，所述微生物选自E.coli、Pichia pastoris、Saccharomycescerevisiae、Kluyveromyces lactis、Aspergillus niger、Penicilliumchrysogenum、Pichia methanolica、Pichia polymorpha、Hansenulapolymorpha、Pichia anomala、Schizosaccharomyces pombe、Bacillussubtilis、Pseudomonas fluorescens、Bacillus stearothermophilus、Thermusthermophilus构成的组。
6.权利要求1至5的R-羟基腈裂解酶，其中，所述突变是通过缺陷性聚合酶反应、序列饱和诱变、完全活性位点饱和检验、位点特异性诱变、基因位点饱和诱变、化学诱变、增变菌株或物理方法引入的。
7.权利要求1至6的R-羟基腈裂解酶，其中，所述突变通过选自由DNA改组、StEP、RACHITT、CLERY、SHIPREC、ITCHY或SCRATCHY构成的组的组合技术来进行组合，或者，其中各酶变体的突变的加合或协同效果通过将一种突变体的突变引入另一种经突变的核酸来获得。
8.权利要求1至7的R-羟基腈裂解酶，其中，筛选是通过高通量筛选或高通量选择方法来进行的，其中使用合适的腈、合适的醛或合适的酮作为底物，其中监测对所述腈的切割，或者分析相应的醛或酮向相应的氰醇的转化。
9.权利要求1至8的R-羟基腈裂解酶，其中，
a)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第3位的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换，或者
b)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第108位的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换，或者
c)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第110位的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换，或者
d)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第304位的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换，或者
e)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第85位的密码子被在每种情况下编码相同氨基酸的其它密码子替换，或者
f)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第209位的密码子被在每种情况下编码相同氨基酸的其它密码子替换，或者
g)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第278位的密码子被在每种情况下编码相同氨基酸的其它密码子替换，或者
h)对应于成熟PaHNL5A111G蛋白的第432位的密码子被在每种情况下编码相同氨基酸的其它密码子替换，或者
i)发生a)-h)所述氨基酸取代或密码子取代的组合。
10.权利要求1至7的R-羟基腈裂解酶，其中，对应于成熟PaHNL5蛋白的第317位的氨基酸残基被不同的氨基酸残基替换。
11.权利要求9的R-羟基腈裂解酶，其中，对应于所述成熟PaHNL5A111G蛋白的第108位的氨基酸残基被甲硫氨酸替换，和/或，对应于所述成熟PaHNL5A111G蛋白的第3位的氨基酸残基被异亮氨酸替换，和/或，对应于所述成熟PaHNL5A111G蛋白的第85位和第432位的残基的编码序列被改变为CCG(第85位)和TAC(第432位)。
12.权利要求9至11的R-羟基腈裂解酶，其中，所述裂解酶具有来自I304VA111G、I108MA111G、N110SA111G、N3IA111G、I108MA111GY432FV424A、N3II108MA111G、I108MN110SA111G、I108MA111GN225S、I108MA111GV317A和V317A构成的组的突变。
13.权利要求1-12中任意一项的R-羟基腈裂解酶用于制备对映异构纯的氰醇的用途。
14.权利要求13的制备对映异构纯的氰醇的工艺，其中，在-10℃至+50℃之间的温度和pH 1.8-pH 7.0之间，在有机系统、水性系统或2-相系统中或者以乳液的形式或以未经稀释的形式，存在氰基供体的情况下，通过任何权利要求中所述的R-羟基腈裂解酶，将脂肪族、芳香族或杂芳香族的醛或酮转化为相应的氰醇。
全文摘要
本发明涉及具有改进的底物接受性、增加的活性以及增加的选择性的R-羟基腈裂解酶，其可通过这样获得在随机诱变和/或饱和诱变技术的协助下引入随机突变，通过筛选或选择来进行鉴定，以及，在合适的情况下，随后将有益的突变组合起来；本发明还涉及所述酶的用途。
文档编号C12N9/88GK101611141SQ200780046262
公开日2009年12月23日 申请日期2007年12月11日 优先权日2006年12月14日
发明者理查德·盖斯伯格, 安盾·金尔德, 刘志斌, 贝蒂·皮斯彻蒂 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司