专利名称：食蟹猴的p450 2c9药物代谢酶及其与食蟹猴p450氧化还原酶的共表达重组载体的制作方法
食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶及其与食蟹猴P450氧化还原酶的共表达重组载体 駄领域本发明涉及基因工程研究领域，具体涉及一种食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Macaca /asda//aris)的P450 2C9药物代谢酶(Cytochrome P450 2C9)及其与P450氧化还原酶 (NADPH"Cytochrome P450 oxidoreductae)的共表达重组载体。背景駄细胞色素P450是重要的药物代谢I相酶，市场上80%以上的药物是通过细胞色素P450代谢的。 2C亚家族是细胞色素P450基因家庭的主要成员，主要包括2C8、 2C9及2C18几个成员。细胞色素 P450 2C9能够代谢多种药物如双氯芬酸(Diclofenac)、甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、华法林 ((s)-(+warfarin)等。目前，包括人，狗，大鼠，小鼠等多种动物的细胞色素P450基因序列已经被 克隆，各种细胞色素P450也已经在大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞等宿主中表达。异源表达的细 胞色素P450是研究药物代谢，进行体外药物筛选的重要手段。食蟹猴是常用的临床前安全性评价 实验大动物，其与人的亲缘关系非常接近，因而在代谢上表现出较高的相似性。到目前为止，仍 未见，猴与人P450 2C9亚型相应的基因的克隆的报道。因此，克,蟹猴P450 2C9基因并进 行异源表达对于体外药物筛选有重要意义。P450酶在催化反应中需要两个电子和两个质子，其中的电子由内质网上的NADPH(还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原型辅酶II)-细胞色素P450氧化还原酶(NADPH-cytochrome P450 oxidoreductae)提供。在体外反应中，缺少NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的系统不具有催化 活性。到目前为止，将，猴P450 2C9与食蟹猴P450氧化还原酶基因共表达还未见报道。发明内容本发明的目的在于llt共一种食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶及其与食蟹猴P450氧化还原酶的 共表达重组载体。克隆食蟹猴P450 2C9基因(cj^2C9)并在昆虫细胞中进行异源表达；还包括克隆 猴NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因，构建包含NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的食 蟹猴P450 2C9(c/p 2C9)的昆虫表达载体，并将此载体用于大難U备，猴P450 2C9的代谢物。 本发明通过以下方式达到该目的本发明的食蟹猴(Cynomolgus Monkey, Macaca加cfcM/oris)的P450 2C9药物代谢酶 (Cytochrome P450 2C9)，能催化双氯芬酸(Diclofenac)的4'-羟基化(4'-hydroxy )、甲苯磺丁脲 (Tolbutamide)的4'-羟基化(4'-hydroxy)和华法彬(s)-(-)-warfarin)的7'-羟基化(7，-hydroxy)。根据已经发表的人P450基因序列(Genebank， Accession NO. : NM—000771)，以逆转录自食 蟹 RNA的cDNA为模板，ffiii聚合酶链式反应(PCR)扩增食蟹猴P450 2C9的编码区序列(cj^ 2C9)，扩增得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoP2C9质粒。其中，设计的弓吻不包 含除起始密码(ATG)夕卜的食蟹猴P450 2C9的编码区序列(c^2C9)。经测序，得到的编码区序列 全长1473 M对，编码491个氨基酸。即P450 2C9药物代谢酶的基因序列或其互补序列是与SEQ ID NO: 1的突变率为0-1%的序列。本发明的食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶与P450氧化还原酶(NADPH《ytochrome P450 oxiteductae)共表达的重组载体包含上述食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶序列的开放阅读框和食蟹 猴P450氧化还原酶序列的开放阅读框。以战克隆的條猴P450 2C9的基因(wp2C9)为模板， 以包含RsrII及HindIII限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴P450 2C9的编码区序歹ij(cyp 2C9) 并定向插入昆虫表达载体pFastBac-Dual的RsrII及HindIII酶切位点之间，得到pFB-cynoP2C9 表达载体。按照Bac-to-Bac中表达食蟹猴P450 2C9蛋白。异源表达的食蟹猴P450 2C9蛋白可以 用作体外筛选，测试药物的代谢性质。根据己经发表的人NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因序列(Genebank， Accession N0.: NM_000941)，以逆转录自食蟹MRNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)从扩增食蟹 猴P450氧化还原麟因的编码区序列。其中，设计的弓卿不包含除起始密码(ATG)外的錢猴 P450 2C9的编码区序列。经测序，得到的编码区序列錄2034个碱基对，编码677个氨基酸。 即所述P450氧化还原酶的序列或其互补序列如SEQ ID N0: 2。以上述克隆的食蟹猴NADPH-细胞 色素P450氧化还原,因为模板，以包含BbsI及NsiI限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的编码区序列并定向插入昆虫表达载体pFastBac-Dual的Bbsl及Nsil 酶切位点之间，得到pFB-cynoP0R表达载体。在sf_9昆虫细胞中表达^S猴NADPH-P450氧化还 原酶。异源表达的食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶可以用作体外筛选，测试药物的代谢性质。所述的重组载体还含有杆状病毒基因，能感染包括sf-9在内的昆虫细胞，被感染的昆虫细胞 至少倉,在内质网上异源表达权利要求1所述的P450 2C9药物代谢酶。本发明的有益效果在于，分离的食蟹猴P450 2C9基因(^々2C9)可以MM基因工程的手段在多 种宿主中异源表达。异源表达的蛋白仅代表2C9这一亚型，因此其代谢活性也仅反映该亚型的活 性。此外，本发明提供同是来源于^II猴的NADPH-细胞色素P450氧化还原酶，与使用其他种属的 氧化还原酶构建的体外检测系统相比，用这一氧化还原酶构建的系统显然更接近于食蟹猴体内代 谢的真实情况。
图1是食蟹猴P450 2C9基因(c/p 2C9)的RT-PCR结果图。 图2是pFB-cynoP2C9的PCR鉴定结果图。 图3是重组，猴P450 2C9杆状病毒的PCR鉴定结果图。 图4是食蟹猴P450氧化还原酶的RT-PCR结果图。 图5是pFB-DU-cynoP2C9-0R重组质粒的双酶切鉴定结果图。 图6是pFB-DU-cynoP2C9-0R重组bacmid的PCR鉴定结果图。 图7是食蟹猴P450 2C9体外催化双氯芬酸反应LC/MS图谱图。 具体实 式实施例1.食蟹猴药物代谢酶P450 2C9基因(c/p 2C9)的克隆根据已经发表的人P450 2C9基因序列(Genebank, Accession NO. :NM_000771)，设计引物 引物l: 5' -ATGGATTCTCTTGTGGTC-3' 引物2: 5, "CTTCMACAGGAATGMGCAC-3'以逆转录自食蟹猴肝RNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)从扩增食蟹猴P450 2C9 的编码区序列(cyp 2C9)，扩增得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoP2C9质粒。其 中，设计的引物不包含除起始密码(ATG)外的，猴P450 2C9的编码区序歹iKcp2C9)。经测序， 得到的编码区序列全长1473碱基对，编码491个氨基酸。图1是食蟹猴P450 2C9基因(c// 2C9) 的RT-PCR结果图，Lane 1: Marker DL2000 (由上至下条带大小分别为；2000bp， 1000bp， 750bp， 500bp， 200bp， 100bp)， Lane 2: RT-PCR扩增产物，其大小约为1520bp。图2是pFB-cynoP2C9 的PCR鉴定结果图，Lane 1， 2， 4, 5: 4个pFB-cynoP2C9单皿，主带大小约为1520bp;Lane 3: Marker DL2000。实施例2.，猴药物代谢酶P450 2C9昆虫表达系统的构,表达以上述克隆的食蟹猴P450 2C9的基因(c^ 2C9)为模板，设计包含RsrII及HindIII限制性 内切謝立点的引物引物3: 5， - TGTCGGTCCGATGGATTCTCTTGTGGTC _3， 引物4: 5， — CGCMGCTTCAAACAGGAATGMGCAC -3，PCR扩增，猴P450 2C9的编码区序列(cyp 2C9)并定向插入昆虫表达载体pFastBac-Dual 的RsrII及HindIII酶切位点之间，得到pFB-cynoP2C9表达载体。测序以确定基因正确插入载体 中o按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System Instruction Manual (由irwitrogen公司 Jli共)操作，在sf-9昆虫细胞中表达食蟹猴P450 2C9蛋白。简单来说，用，构建的pFB-cynoP2C9 质粒转DH10Bac感受态细胞，PCR鉴定阳性克隆，从阳性克隆中提取重组杆状病泉用Cellfectin 试剂转染sf-9昆虫细胞获得重组病毒，在多次反复感染后获得高滴度的病毒，病毒感染的sf-9 细胞即能皿食蟹猴P450 2C9蛋白。图3是重组食蟹猴P450 2C9杆状病毒的PCR鉴定结果图， Lane 1: Marker DL15000(由上至下条带的大小依次为15000bp, 10000bp， 7500bp, 5000bp， 2500bp， 1000bp, 250bp); Lane 2-4: 3个转化单菌落的PCR结果，条带的大小约为4000bp。实施例3.食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原^S因的克隆根据已经发表的人NADPH-细胞色素P450氧化还原酶基因序列(Genebank， Accession NO.:NM—000941)，设计如下引物(引物5和引物6): 引物5: 5， - ATGATCAACATGGGAGACTCCC -3， 引物6: 5， - CTAGCTCCACACGTCCAGGG -3，以逆转录自食蟹 RNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应从扩增，猴NADPH-细胞色素 P450氧化还原麟因的编码区序歹i」。将得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoPOR质 粒。经测序，得到的编码区序列全长2034个碱基对，编码677个氨基酸。图4是維猴P450氧 化还原酶的RT-PCR结果图，Lanel:MarkerDL2000 (由上至下条带大小分别为；2000bp， 1000bp, 750bp， 500bp， 200bp， 100bp); Lane 2: RT-PCR扩增产物，条带的大小约为2100bp。实施例4.共表达食蟹猴P450 2C9及其NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的表达系统的构建以上述克隆的食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原HS因为模板，设计包含Bbsl及Nsil限制性 内切^^立点的引物(弓卿7和引物8):引物7: 5， - GMGACTTGATCATGATCMCATGGGAGACTC-3，引物8: 5' -TTATGCATCTAGCTCCACACGTCCAG-3'PCR扩增維猴NADPH-细胞色素P450氧舰原麟因的编码区序列并定向插入昆虫表达载体 pFastBac Dual的Bbsl及Nsil酶切位点之间，得到pFB-Du-OR重组质粒。然后，将pFB-cynoP2C9 载体的RsrII及HindIII酶切片段定向插入昆虫表达载体pFastBac Dual的RsrII及HindIII位 点，得到pFB-DU-cynoP2C9-0R载体。按照操作手册操作，获得能感染昆虫细胞的病毒。图5是 pFB-DU-cynoP2C9-OR重组质粒的双酶切鉴定结果图，Lane 1: pFB-DU-cynoP2C9-OR重组质粒经BbsI， Nsil双酶切产物;Lane 2: Marker DL2000; Lane 3: pFB-DU_cynoP2C9-OR重组质粒经RsrII， HindIII 双酶切产物。图6是pFB-DU-cynoP2C9-0R重组杆状病毒的PCR鉴定结果图，Lane 1-4: 4个 pFB-DU-cynoP2C9-OR重组杆状病毒的PCR结果；条带大小为6000bp， Lane 2: Marker DL15000, 由上至下条带大小分别为(由上至下条带的大小依次为15000bp, lOOOObp， 7500bp， 5000bp, 2500bp, lOOObp， 250bp)。实施例5. sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 2C9的代谢双氯芬酸活性领啶用制备的含有食蟹猴P450 2C9基因(c/p2C9)的杆状病毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培养到指数期的sf-9细胞，并在感染后2-3日收集细胞；以磷酸盐缓冲液将收集的sf-9 细胞匀浆；以差速离心法离心制 [粒体；以磷酸盐缓冲液t悬微粒鄉淀，用BCA法测定蛋白 含量，用一氧化碳结合法测定P450含量;将上述微粒与系列稀释的双氯芬酸混合物置于反应管中， 同时加入相应量的NADPH-细胞色素P450氧化还原酶，水浴。力卩40 10 mM NADPH溶液启动 反应。8辦巾反应后加0.8 mL含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；上述各反应管离 心，^Lb凊加入到96孔板进样板，g^S用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少，建立实 验方法，定量分析和数据处理，计算得到昆虫细胞重组皿的食蟹猴P450 2C9代谢双氯芬酸的活 性，使其酶活指标Km和Vmax值处于理想范围，通过食蟹猴P450 2C9有效的代谢双氯芬酸的可 以产生4，-羟基{槐氯芬酸(4'-hydroxydiclofenac)。图7是食蟹猴P450 2C9体夕M對^又氯芬酸 反应LC/MS图谱图，底物浓度双氯芬酸100 uM，反应^f牛37。C， 10min;色谱柱ZorbaxSB-C18 (2.1咖ID X100 mm， 3. 5-Micro);流动相A组成为CH30H/H20 (10: 90， v/v，含0.1%HC00H)， B组成为CH30H/H20 (90: 10， v/v，含0.腦C00H);梯度(min, B%): 0， 30%— 0.2, 30%— 1.6， 95%— 2.6， 95%— 2.8, 30%— 4.0, 30%;采用TurboIonSpray离子源，在正离子检测方式 下，选择醒工作方式进行二级质谱分析。实施例6.化^tl体外抑制sf-9昆虫细胞重组表达的條猴P450 2C9的活性观啶 如实施方案5中制备sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 2C9的微粒体；4 粒体与固定 浓度的双氯芬酸以及系列稀释的待测化合物的混^)置于反应管中，同时加入相应量的NADPH-细胞色素P450氧化还原酶，水浴。加40 nL 10 mMNADPH溶液启动反应。8射中反应后加0.8 mL 含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；上述各反应管离心，取上清加入到96孑L縱样 板，齢运用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少，建立实验方法，定量分析和数据处理， 通过化合物体外抑制实验，测得化合物体外抑制有效的抑制了食蟹猴P450 2C9的活性。实施例7. sf-9昆虫细胞重组共表达的食蟹猴P450 2C9和NADPH-细胞色素P450氧化还原 酶的代谢双氯芬酸活性测定8用制备的含有食蟹猴P450 2C9基因(《r/ 2C9)和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的杆状病 毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培养到指数期的sf_9细胞，并在感染后2-3日 收集细胞；以磷酸盐缓冲液将收集的sf-9细胞匀浆；以差速离心法离心制备微粒体；以磷酸盐缓 冲液重悬微粒舰淀，用BCA法测定蛋白含量，用一氧化碳结合、法测定P450含量；将上述微粒与 系列稀释的双氯芬酸混合物置于反应管中，水浴。加40 10 mMNADPH溶液启动反应。8射中 反应后加0.8mL含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；上述各反应管离心，取上清加 入到96 L鹏样板，齢运用HPLC和LC-MS测定代谢物的生成或减少，建立实验方法，定量 分析和数据处理，计算得到昆虫细胞重组共表达的食蟹猴P450 2C9和NADPH-细胞色素P450氧化 还原酶代谢双氯芬酸的活性，使其酶活指标Km和Vmax值处于理想范围，通过昆虫细胞重组共 表达的，猴P450 2C9和NADPH-细胞色素P450氧化还原酶有效的代谢双氯芬酸可以产生4'-羟 基《槐氯芬酸(4' -hydroxydiclofenac) 0实施例8.化合物体外抑制sf-9昆虫细胞重组共表达的食蟹猴P450 2C9和NADPH-细胞色素 P450氧化还原酶的活性测定如实施方案7中制备sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 2C9的微粒体；将微粒体与固定 浓度的双氯芬酸以及系列稀释的待测化合物的混合物置于反应管中,水浴。加40pL 10 mM NADPH 溶液启动反应。8分钟反应后加0.8mL含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；上述各 反应管离心，取上清加入到96孔板进样板，进行LC/MSMS定量分析和数据处理，通过化^f勿体 外抑制实验，测得化合物体外抑制有效的抑制了，猴P450 2C9的活性。实施例9.双氯芬酸的維猴P450 2C9代谢物的大量制备按技术方案所述，用制备的同时含有食蟹猴P450 2C9(cyp 2C9)及其氧化还原酶基因的杆状病 毒以MOI (multiplicity of infection) =3感染培养到指数期的sf-9细胞；在感染3天后，将 溶解的双氯芬酸加入感染的细胞中；在加A^氯芬酸2-3天后，离心钟，弃去细胞碎处，保留上 清；用制备HPLC纯化双氯芬酸被食蟹猴P450 2C9代谢的主要产物4'-羟基化双氯芬酸 (4' -hydroxydi c1ofenac) 0序歹據 SEQ ID N0:1〈iio>中科KT州生物医药与健康研究院〈120〉食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶〈130> 1<160〉 1<170〉 Patentln version 3.2〈210〉 1〈211〉 1473 〈212〉腿<213> ^H猴Macaca fascicularis〈 1atggattctc ttgtggtcct tgtgctctgt ctctcctgttagacagagat ctgggagagg aaaattccct cctggcccca aatatcctac agatagatat taaggacgtc agcaaatcct tatggccctg tgttcactct gtattttggc ctggaacgca gaagcagtga aggaagccct gattgatctt ggagaggagt ccattggctg acagagctaa cagaggattt ggaatcgttt aaggagatcc ggcgtUttc cctcatgaca ctgcggaatt attgaggatc gtgttcaaga ggaagcccgc tgccttgtgg ggctcaccct gtgatcccac tttcatcctg ggctgtgctc attattttcc ataaacgttt tgattataaa gatcagcaat Ugaatgaaa acgtcaagat tttgagcagc ccctggatcctgcttctcct ttcactctgg 60ctcctctccc agtgattgga 120taaccaacct ctcaaaagtc 180tggtggtgct gcatggatac 240tttctggaag aggacatttt 300tcagcaatgg aaag卿tgg 360ttgggatggg gaagaggagc 400aggagttgag aaaaaccaag 柳cctgcaatgt gatctgctcc 520ttcttaaagt gatggaaaaa 580agatatgcaa taattttcct 640 10cctttcattg attatttccc gggagcccat aaaagttata ttttggagaa agtaaaagaa cgggacttta ttgattgctt cctgatgaaa gaatttacta ttgaaaactt ggaaaacact acgacaagca caaccctgag atatgctctc gctaaagtcc aggaagagat tgaacgtgtg gacaggagcc acatgcccta cacagatgct cttctcccca ccaacctgcc ccatgcagtg atccccaagg gcacaaccat attaatttcc tttcccaacc cagagatgtt tgacccttgt aaaagtaact acttcatgcc tttctcagca gcccgcatgg agctgttttt atccttgacc ctggttgacc caaaggacct tgacaccact cccttctacc agctgtgctt cattcctgttaacaaattac ttaaaaacat tgcttttttg 700caccaagaat caatggacat gaacaaccct 760atggagaaag aaaagcacaa ccaacagtct 820gcagttgact tgtttggagc tgggac卿g 880cttctcctgc tgaagcaccc卿ggtcata 940attggcagaa atcggagccc ctgcatgcag 1000gtggtgcacg agatcc卿g atacattgac 1060acctgtgatg ttaaattcag aaactacctc 1120ctgacttctg tgctacatga caacaaagaa 1180cactttctgg acgaaggtgg caattttaag 1240ggaaaacgga tttgtgtggg agaagccctg 1300tccgttUac agaactttaa cctgaaatct 1360ccagttgtca atgggtttgc ctctgtgcca 1420tga 1473SEQ ID N0:2〈110〉中科院广州生物医药与健藤if究院 〈120〉錢猴的P450氧舰原酶〈130〉 1<160〉 1〈170〉 Patentln version 3. 2〈210〉 1〈211〉 2034〈212〉 DNA<213〉 ^fi猴Macaca fascicularis 〈400〉 1atggg卿ct cccacgtgga caccagctcc accgtgtccg aggcggtggc cgaagaagta 60tctcttttca gcatgacgga cgtgattctg ttttcagtca tcgtgggcct cctaacctac 120tggttcctct ttagaaagaa aaaagaagaa gtccctgagt tcaccaaaat tcagacattg 180accagctctg tc卿gagag cggcttcgtg gaaaagatga agaaaacggg gaggaacatc 240atcgtgttct acggctccca gacggggact gcagaggagt ttgccaaccg cctgtccaag 300gacgcccacc gctatgggat gcgaggcatg tcagcggacc ccgaggagta tgacttggcg 360gacctgagca gcctgccgga gatcgacaac gccctggtgg ttttctgcat ggccacctac 420ggcgaggggg accccaccga caatgcccag gacttctacg actggctcca ggagacggac ■gtggatctct ctggggtcaa gtttgcggtg Utggtcttg ggaacaaaac ctacgagcac 540ttcaatgcca tgggcaagta cgtggacaag cggctggagc agctcggcgc ccagcgcatc 600tttgagctgg gcttgggcga cgacgatggg aacttggagg aggacttcat cacctggcga ,gagcagttct ggccggccgt gtgcgagcac tttggggtgg aagccactgg cgaggagtcc 720agcattcgcc agtacgagct tgtggtccac actgacatag acgcggccaa ggtgtacgtg 780ggggagatgg gccggctgaa gagctacgag aaccagaagc ccccctttga tgccaagaat 840ccattcctgg ctgcagtcac caccaaccgg aagctgaacc agggaaccga gcgccacctc 900atgcacctgg aattggacat ctcggactcc aaaatc郷t atgaatctgg ggaccacgtg 960gctgtgtacc cagccaacga ctctgctctc gtcaaccagc tgggcaaaat cctgggtgcc 1020gacctggacg tcgtcatgtc cctgaacaac ctggatgagg agtccaacaa gaagcaccca 1080ttcccgtgcc ctacgtccta ccgcacggcc ctcacctact acctggacat caccaacccg 1140ccgcgtacca acgtgctgta cgagctggcg ctgctgcgca卿tggcctc ctcctccggc gtgg郷ccc gg鄉caceit cctggccatc attgaccacc tgtgtgagct gctgccgcgc tcctccaagg tccatcccaa ctctgtacac 肪ggccggcc gcatcaacaa gggcgtggcc ggggagaacg gcggccgcgc gctggtgccc cccttcaagg ccaccacacc tgtcatcatg at鄉cttca tccaggagcg ggcctggctg ctgctgtact acggctgccg ccgctcggat cagttccaca gggacggcgc gctcacccag cacaaggtct acgtccagca cctgctaaag gaaggcggcg cccacatcta tgtctgtggg aacaccttct atgacatcgt ggctgagctc tatgtcaaga agctgatgac caagggccgccagtacgcct cggagccctc ggagcaggag 1200g鄉gcaagg agctgtacct gagctgggtg 1260ctgcaggact gcccgtcctt gcggcccccc 1320ctgcaggccc gctactactc catcgcctca 1380atctgtgcgg tggttgtgga gtacgagacc 1440accaactggc tgcgggccaa ggagcctgct 1500atgttcgtgc gcaagtccca gttccgcctg 1560gtgggccccg gcactggggt ggcccccttc 1620cggcagc鄉gcaagg鄉t gggggagacg 1680gaggactacc tgtaccggga ggagctggcg 1740ctcaacgtgg ccttctcccg ggagcagtcc 1800cgggaccgag agcacctgtg gaagctgatc 1860gatgcacgga acatggccag ggacgtgcag 1920ggggccatgg agcacgccca ggccgtggac 1980tactccctgg acgtgtggag ctag 203权利要求
1. 一种食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶，能催化双氯芬酸的4’-羟基化、甲苯磺丁脲的4’-羟基化和华法林的7’-羟基化。
2. 根据权利要求1所述的食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶，其特征在于，所述P450 2C9药物 代谢酶的基因序列或其互补序列是与SEQ ID NO: 1的突变率为0-1%的序列。
3. —种食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶与食蟹猴的P450氧化还原酶的共表达重组载体，其特 征在于，含有权利要求2所述的食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶序列的开放阅读框和食蟹猴的P450 氧化还原酶序列的开放阅读框。
4. 根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述食蟹猴的P450氧化还原酶的序列或 其互补序列如SEQ ID NO: 2。
5. 根据权利要求3所述的重组载体，其牛寺征在于，还含有杆状病毒基因，能感染包括sf-9 在内的昆虫细胞，被感染的昆虫细胞至少能够在内质网上异源表达权利要求1所述的，猴的P450 2C9药物代谢酶。
全文摘要
本发明公开了一种食蟹猴P450 2C9药物代谢酶及其与食蟹猴P450氧化还原酶的共表达重组载体。食蟹猴P450 2C9药物代谢酶能催化双氯芬酸的4’-羟基化、甲苯磺丁脲的4’-羟基化和华法林的7’-羟基化；其基因序列或其互补序列是与SEQ ID NO1的突变率为0-1％的序列。食蟹猴P4502C9药物代谢酶与食蟹猴P450氧化还原酶的共表达重组载体包含食蟹猴的P450 2C9药物代谢酶序列和食蟹猴P450氧化还原酶序列的开放阅读框。食蟹猴P450氧化还原酶的序列或其互补序列如SEQ ID NO2。本发明异源表达的蛋白仅代表食蟹猴P450 2C9，其系统更接近于食蟹猴体内代谢的真实情况。
文档编号C12N15/866GK101250505SQ20081002705
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者佘妙琴, 戴仁科, 温鼎声, 王海涛, 杨 白 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院